翟俊山，李 楠，宋久剛，王艷梅，朱超慧，吳 凱

解放軍第309醫(yī)院消化內(nèi)科，北京 100091

胃癌組織中APPL1和COX-2的表達及其與患者預后的關系

翟俊山，李 楠，宋久剛，王艷梅，朱超慧，吳 凱

解放軍第309醫(yī)院消化內(nèi)科，北京 100091

目的 探討胃癌組織中APPL1和COX-2蛋白表達情況、二者相關情況及其與患者生存期的關系。方法 應用免疫組織化學SP法檢測83例經(jīng)手術切除石蠟包埋存檔胃癌組織中APPL1和COX-2蛋白的表達情況。結果 胃癌組織中APPL1和COX-2表達陽性率分別為60.2%(50/83)、62.7%(52/83)。APPL1的表達與胃癌的浸潤深度、淋巴結轉移、TNM分期、組織學類型差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；COX-2的表達與胃癌的浸潤深度、淋巴結轉移、TNM分期差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而與組織學類型差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。它們與腫瘤患者年齡、性別差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。相關分析結果顯示APPL1與COX-2表達呈正相關(P<0.05)。生存曲線研究結果顯示APPL1和COX-2表達與患者術后生存時間顯著相關(P<0.05)。結論 APPL1和COX-2表達程度與胃癌的浸潤深度、淋巴結轉移、TNM分期密切相關，影響患者的生存時間。

APPL1；COX-2；胃癌；預后；免疫組化

胃癌的發(fā)病率及病死率在我國一直處于高位水平，因目前尚無有效的早期診斷方法，確診時往往已是中晚期，雖經(jīng)治療，生存質(zhì)量及時間仍受到明顯影響[1]，提高胃癌的早期診斷及早期治療對患者預后意義重大。研究腫瘤的發(fā)病機制，明確其分子機制，盡可能發(fā)掘腫瘤的“關鍵”分子標志物是目前腫瘤診斷和分子靶向治療的關鍵。磷酸酪氨酸銜接蛋白(adaptor protein containing PH domain，PTB domain and leucine zipper motif 1，APPL1)表達產(chǎn)物是細胞內(nèi)一種功能蛋白，與脂聯(lián)素結合，傳遞細胞信號，在多種腫瘤，如結腸癌[2]、肺癌[3]中表達均上調(diào)，但尚無在胃癌中表達情況的報道。本文應用免疫組織化學SP法聯(lián)合檢測基因APPL1和環(huán)氧化物酶2(COX-2)在經(jīng)手術切除石蠟包埋的胃癌組織中的表達水平，研究APPL1和COX-2表達產(chǎn)物與胃癌生物學特性的關系，為胃癌的早期診斷及分子靶向治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取解放軍第309醫(yī)院2007年1月-2009年12月確診為胃癌后經(jīng)手術切除治療的患者為研究對象，共83例。從病理科調(diào)閱其存檔石蠟塊進行免疫組織化學SP法染色。83例患者中男56例，女27例，年齡26.1～83.2歲，平均年齡(57.7±10.3)歲。所有病例術前均未予新輔助化療，術后常規(guī)給予化療。從術后開始隨訪，隨訪內(nèi)容包括患者的一般情況，腫瘤有無復發(fā)、轉移，術后治療情況；共隨訪5年，生存時間超過5年的統(tǒng)一算為5+年，隨訪過程中失訪的算作截尾數(shù)據(jù)，生存時間以上一次能隨訪到的時間計算。

1.2 試劑兔抗人APPL1多克隆抗體及APPL1陽性對照片購于上海滬峰生物技術公司；兔抗人COX-2單克隆抗體及COX-2陽性對照片購于北京中杉金橋生物技術有限公司；SP免疫組織化學試劑盒和DAB顯色劑購于Invitrogen公司。

1.3 方法(1)免疫組化SP操作方法：對病理科存檔石蠟塊進行切片，每塊切片5張，切片厚度3 μm。分別進行空白、APPL1、COX-2及兩種蛋白陽性對照片染色。染色方法按試劑盒說明書進行；(2)結果判斷：染色強度評分標準：無色為0分，淺色為1分，中等染色為2分，深染色為3分；染色細胞陽性率評分標準為：沒有細胞染色為0分，<10%為1分，10%～50%為2分，>50%為3分。染色強度評分與染色細胞陽性率評分乘積<3記為(-)，≥3記為(+)。隨機選取10個高倍視野，平均分作為每張切片的最終結果。

1.4 統(tǒng)計學處理采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析，計數(shù)資料用χ2檢驗，相關性分析采用Spearman等級相關，生存率比較采用Log-rank時序檢驗，預后分析采用Cox多因素回歸分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 胃癌中APPL1和COX-2的表達APPL1蛋白陽性主要為細胞漿著色，COX-2蛋白陽性主要為細胞膜著色，顏色從淡黃色至棕褐色。經(jīng)過綜合判斷，APPL1陽性率為60.2%(50/83)，COX-2陽性率為62.7%(52/83)(見圖1)。

圖1 胃癌中APPL1和COX-2的表達(SP 100×) A：APPL1在胃癌中的表達；B：COX-2在胃癌中的表達

2.2 胃癌中APPL1和COX-2表達與臨床病理的關系及其相關性APPL1在胃癌中的表達與浸潤深度、淋巴結轉移、TNM分期、組織學類型差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；COX-2在胃癌中的表達與浸潤深度、淋巴結轉移、TNM分期差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與不同的組織學類型差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。它們與腫瘤患者年齡、性別差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表1)。Spearman相關分析結果顯示APPL1與COX-2表達呈正相關，相關系數(shù)為0.618(P<0.05)。

2.3 Kaplan-Meier生存分析分別將APPL1和COX-2表達分陽性組和陰性組，繪制生存曲線，進行Log-rank時序檢驗。分析結果顯示APPL1陽性組生存時間為(23.15±11.17)月，顯著低于陰性組(32.13±18.19)月(P<0.05)； COX-2陽性組生存時間為(23.15±19.34)月，顯著低于陰性組(33.13±18.23)月(P<0.05)。

2.4 Cox多因素回歸分析對APPL1和COX-2的表達情況、浸潤深度、TNM分期、淋巴結轉移和年齡、性別分別賦值進行Cox多因素分析表明，除年齡、性別及組織學類型外其他因素均對生存時間有影響(P<0.05)。其中APPL1陽性表達的風險比為1.95(95%CI：1.120～2.724，P<0.05)；COX-2陽性表達的風險比為2.12(95%CI：1.376～3.032，P<0.05)。

3 討論

APPL1共由709個氨基酸組成，定位于3號染色體上，是細胞內(nèi)的一種功能性蛋白，由Mitsuuchi等[4]于1999年首先發(fā)現(xiàn)。APPL1參與細胞信號傳遞，涉及多個細胞信號通路，介導多種細胞反應。APPL1與脂聯(lián)素結合，在細胞內(nèi)有抗氧化、抗動脈硬化、調(diào)節(jié)炎癥反應及平衡血糖等多種功能，越來越受到人們的重視[5]。APPL1在胰腺組織中廣泛分布，病理狀態(tài)下不能正確介導胰島素調(diào)節(jié)血糖功能，與胰島素抵抗和Ⅱ型糖尿病有關[6]。新近實驗證實，APPL1還與肝纖維化有關，在肝纖維化患者血清中APPL1明顯上升，且隨著Child-Pugh分級增加而增高[7]。APPL1介導了結直腸癌缺失基因(deleted in colorectal carcinoma， DCC)的抗細胞凋亡作用，在多種腫瘤組織中，DCC表達缺失，抗凋亡作用受到影響[8]。APPL1還與人表皮生長因子(epidermal growth factor receptor， EGFR)信號通路密切相關，在腫瘤組織中，APPL1參與了EGFR信號通路傳遞，引起了EGFR信號通路中重要蛋白Rab5a的過度表達[9]。且多個實驗已證實，APPL1在多種腫瘤如乳腺癌[10]、卵巢癌[11]中高表達，參與癌癥的侵襲轉移。本研究中胃癌的浸潤深度、淋巴結轉移、TNM分期、不同組織學類型均有APPL1的表達水平改變，表明APPL1與胃癌關系密切。環(huán)氧化酶(cyclooxygenase，COX)基因與腫瘤增殖及凋亡密切相關，其表達產(chǎn)物COX-2是花生四烯酸代謝過程中的關鍵酶。COX-2蛋白有促進腫瘤細胞增殖、抑制腫瘤細胞凋亡、逃避生物體內(nèi)細胞免疫監(jiān)視作用，促進癌前疾病向腫瘤轉化作用[12]；且可以誘導血管內(nèi)皮生長因子分泌，促進腫瘤新生血管形成，支持腫瘤生長[13]。在本研究中，COX-2表達與胃癌的組織學類型差異無統(tǒng)計學意義，考慮COX-2蛋白與腫瘤的組織學起源關系不大。

表1 APPL1和COX-2在胃癌表達及與胃癌臨床病理之間的關系[例數(shù)(%)]

在本研究中，APPL1與COX-2在胃癌表達有相關性，相關系數(shù)為0.618。APPL1與COX-2分別涉及多條細胞信號通路，考慮二者在胃癌的發(fā)病機制中具有交叉的細胞信號通路。查閱文獻得知，MAPK/ERK信號通路可能在其中起了橋梁作用，該信號通路被激活后，上調(diào)COX-2分子水平[14]。COX-2可抑制p53在細胞內(nèi)的聚集，從而抑制細胞凋亡[15]，這在惡性腫瘤發(fā)生中有重要作用。細胞實驗證實APPL1通過競爭性抑制TRB3增強胰島素刺激的Akt磷酸化，同時通過改變Raf-1的磷酸化位點激活MAPK/ERK信號通路[16]。二者可能就是通過這種內(nèi)在機制，協(xié)同促進胃惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

我們重點研究了APPL1與COX-2在胃癌組織上蛋白表達的變化及相互關系，結果顯示APPL1和COX-2在胃癌組織上均高表達，表明二者均與胃癌的發(fā)生密切相關。且在胃癌組織中二者呈正相關，表明二者通過細胞內(nèi)信號通路具有協(xié)同作用。進一步研究二者的內(nèi)在作用機制，把二者作為同一個靶點，可為胃癌的診斷治療帶來新亮點。

[1]Zhang WD, Miao SJ. Analysis on epidemic characteristics of cancer death rate in China [J]. Chinese Journal of Health Education, 2009, 25(4): 246-248. 張偉東, 苗樹軍. 我國惡性腫瘤死亡率流行病學特征分析[J]. 中國健康教育, 2009, 25(4): 246-248.

[2]Bidkhori G, Narimani Z, Hosseini Ashtiani S, et al. Reconstruction of an integrated genome-scale co-expression network reveals key modules involved in lung adenocarcinoma [J]. PLoS One, 2013, 8(7): e67552.

[3]Rao HM, Qiu F, Sun Y, et al. The expression of APPL1 and VEGF-C in colorectal cancer tissues and their correlation [J]. Journal of Colorectal & Anal Surgery, 2013, 19(1): 5-9. 饒惠民, 邱堃, 孫羽, 等. APPL1與VEGF-C在結直腸腺癌中的表達及相關性研究[J]. 結直腸肛門外科, 2013, 19(1): 5-9.

[4]Mitsuuchi Y, Johnson SW, Sonoda G, et al. Identification of a chromosome 3p14.3-21.1 gene, APPL, encoding an adaptor molecule that interacts with the oncoprotein-serine/threonine kinase AKT2 [J]. Oncogene, 1999, 18(35): 4891-4898.

[5]Tu Q, Zhang J, Dong LQ, et al. Adiponectin inhibits osteoclastogenesis and bone resorption via APPL1-mediated suppression of Akt1 [J]. J Biol Chem, 2011, 286(14): 12542-12553.

[6]Cheng KK, Lam KS, Wang B, et al. Signaling mechanisms underlying the insulin-sensitizing effects of adiponectin [J]. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab, 2014, 28(1): 3-13.

[7]Zhong YD, Hu ZL, Xiong QF, et al. Relationship of serum APPL1 and Child-Pugh classification in hepatitis B liver cirrhosis patients [J]. Chinese Hepatology, 2014, 19(11): 854-856. 鐘艷丹, 胡志亮, 熊清芳, 等. 乙型肝炎肝硬化患者血清APPL1水平與Child-Pugh分級的關系[J]. 肝臟, 2014, 19(11): 854-856.

[8]Liu J, Yao F, Wu R, et al. Mediation of the DCC apoptotic signal by DIP13 alpha [J]. J Biol Chem, 2002, 277(29): 26281-26285.

[9]Zhao Z, Liu XF, Wu HC, et al. Rab5a overexpression promoting ovarian cancer cell proliferation may be associated with APPL1-related epidermal growth factor signaling pathway [J]. Cancer Sci, 2010, 101(6): 1454-1462.

[10]Chen Q, Liu WY, Zhao Z, et al. Expression and significance of Rab5a and APPL1 in breast cancer [J]. Zhonghua Zhong Liu Za Zhi, 2012, 34(11): 838-841.

[11]Zhao Z, Liu XF, Wu HC, et al. Rab5a overexpression promoting ovarian cancer cell proliferation may be associated with APPL1-related epidermal growth factor signaling pathway [J]. Cancer Sci, 2010, 101(6): 1454-1462.

[12]Misra S, Sharma K. COX-2 signaling and cancer: new players in old arena [J]. Curr Drug Targets, 2014, 15(3): 347-359.

[13]Kim NK, Park JK, Shin E, et al. The combination of nuclear factor kappa B, cyclo-oxygenase-2 and vascular endothelial growth factor expression predicts poor prognosis in stage Ⅱ and Ⅲ colorectal cancer [J]. Anticancer Res, 2014, 34(11): 6451-6457.

[14]Wang ZL, Fan ZQ, Jiang HD, et al. Selective Cox-2 inhibitor celecoxib induces epithelial-mesenchymal transition in human lung cancer cells via activating MEK-ERK signaling [J]. Carcinogenesis, 2013, 34(3): 638-646.

[15]Khajeniazi S, Allameh A, Soleimani M, et al. Changes in COX-2 and oxidative damage factors during differentiation of human mesenchymal stem cells to hepatocyte-like cells is associated with downregulation of P53 gene [J]. Biol Chem, 2013, 394(9): 1213-1222.

[16]Tian C, Jin X, Ye X, et al. Long term intake of 0.1% ethanol decreases serum adiponectin by suppressing PPARγ expression via p38 MAPK pathway [J]. Food Chem Toxicol, 2014, 65(1): 329-334.

(責任編輯：馬 軍)

Expressions of APPL1 and COX-2 in gastric carcinoma and relationship with the prognosis of patients

ZHAI Junshan, LI Nan, SONG Jiugang, WANG Yanmei, ZHU Chaohui, WU Kai

Department of Gastroenterology, the 309 Hospital of PLA, Beijing 100091, China

Objective To investigate the expressions of APPL1 and COX-2 in gastric carcinoma and relationship with the prognosis of patients.Methods The expressions of APPL1 and COX-2 were detected by immunohistochemical methods in 83 paraffin-embedding surgical resection specimens.Results The positive expression rates of APPL1 and COX-2 were 60.2% (50/83), 62.7% (52/83). The expression of APPL1 was notably correlated with the depth of invasion, lymph nodes metastasis, TNM stage, pathologic type in gastric carcinoma (P<0.05); The expression of COX-2 was notably correlated with the depth of invasion, lymph nodes metastasis, TNM stage in gastric carcinoma (P<0.05), but not related to the pathologic type (P>0.05). Both of them were not correlated with the age and sex (P>0.05). The expression of APPL1 was positively correlated with COX-2. The expressions of APPL1 and COX-2 were correlated with the survival time of postoperative patients (P<0.05).Conclusion The expressions of APPL1 and COX-2 are obviously correlated with the depth of invasion, lymph nodes metastasis, TNM stage in gastric carcinoma and affect the survival time of postoperative patients.

APPL1; COX-2; Gastric carcinoma; Prognosis; Immunohistochemistry

國家自然科學基金(81101852)

翟俊山，主治醫(yī)師，研究方向：胃癌分子生物學。E-mail：fmmuzjs@163.com

李楠，博士，主任醫(yī)師，研究方向：胃癌分子生物學。E-mail：xhk309@126.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.01.004

R735.2

A

1006-5709(2016)01-0016-04

2015-04-02