陳 玲，陳 凱，楊錫貴，姜 超，楊香山

1. 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)三科，山東 濟(jì)南 250031； 2. 昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院胸外科一病區(qū)； 3. 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院病理科

HOXD10基因轉(zhuǎn)染對(duì)人胃癌耐藥SGC7901/VCR細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲能力的影響

陳 玲1，陳 凱2，楊錫貴1，姜 超1，楊香山3

1. 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)三科，山東 濟(jì)南 250031； 2. 昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院胸外科一病區(qū)； 3. 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院病理科

目的 研究HOXD10基因轉(zhuǎn)染人胃癌耐藥細(xì)胞系SGC7901/VCR后表達(dá)情況及對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲能力的影響。方法將HOXD10基因表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3.1-EGFP-HOXD10)轉(zhuǎn)染至SGC7901/VCR中，利用Real-time PCR和Western blotting檢測(cè)HOXD10基因轉(zhuǎn)染后表達(dá)效果；MTT方法、平板單克隆實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、Transwell方法分別檢測(cè)HOXD10基因轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞增殖、單克隆形成、細(xì)胞周期、凋亡、侵襲能力的影響；并用Western blotting檢測(cè)HOXD10基因轉(zhuǎn)染對(duì)腫瘤侵襲性相關(guān)因子MMP-2蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果 HOXD10基因轉(zhuǎn)染至人胃癌SGC7901/VCR細(xì)胞后其基因和蛋白表達(dá)水平均顯著上升(P<0.05)，能夠抑制SGC7901/VCR細(xì)胞增殖、單克隆形成、細(xì)胞周期，并提高順鉑作用下細(xì)胞凋亡率(P<0.05)，同時(shí)顯著抑制細(xì)胞侵襲能力和MMP-2蛋白的表達(dá)(P<0.05)。結(jié)論 HOXD10基因轉(zhuǎn)染人胃癌耐藥細(xì)胞系SGC7901/VCR后能夠高表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖、單克隆形成、細(xì)胞周期和侵襲能力并提高順鉑下細(xì)胞凋亡率，而其抑制細(xì)胞侵襲能力可能與MMP-2表達(dá)減少有關(guān)。

HOXD10；基因轉(zhuǎn)染；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞侵襲；MMP-2

胃癌作為全球高發(fā)的惡性腫瘤之一，在我國(guó)腫瘤死亡原因中占第二位，且因其早期診斷率較低，不易被診治[1]。Bernards等[2]研究發(fā)現(xiàn)胃癌腫瘤易發(fā)生轉(zhuǎn)移侵襲，轉(zhuǎn)移性患者的發(fā)病率從1990年的24%顯著提高到2011年的44%，且和其他類型腫瘤一樣，胃癌也易存在原發(fā)性耐藥性。近來(lái)對(duì)胃癌的研究有了較大進(jìn)步，但針對(duì)晚期和伴有轉(zhuǎn)移性、耐藥性的胃癌研究仍不理想[3]。人胃癌耐藥細(xì)胞系SGC7901/VCR具有強(qiáng)侵襲能力和耐藥能力，是研究人胃癌特性細(xì)胞功能的最佳細(xì)胞系[4]。HOXD10基因是Ⅰ類同源異形盒基因(Homobox genes)家族中的一種特殊的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，具有控制胚胎細(xì)胞發(fā)育、組織細(xì)胞增殖、分化的生理作用，并具有抑癌基因的作用[5]。最新研究[6]表明HOXD10表達(dá)水平在乳腺癌、子宮腫瘤、腎癌、胃癌等惡性腫瘤中均表達(dá)減少，并在上皮來(lái)源惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。但目前關(guān)于HOXD10在人胃癌腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用及對(duì)細(xì)胞功能的影響尚未見(jiàn)研究。因此，本研究通過(guò)將HOXD10基因轉(zhuǎn)染至人胃癌耐藥細(xì)胞系SGC7901/VCR中，探討HOXD10基因在胃癌細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲中發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料人胃癌耐藥細(xì)胞系SGC7901/VCR購(gòu)自北京中科院細(xì)胞庫(kù)；RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基、EDTA胰酶、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibico公司；pcDNA3.1-EGFP空載質(zhì)粒及人源HOXD10基因重組pcDNA3.1-EGFP-HOXD10表達(dá)質(zhì)粒購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所及本實(shí)驗(yàn)室自行構(gòu)建；LipofectamineTM2000購(gòu)自上海Invitrogen公司；Real-time PCR試劑盒購(gòu)自大連Takara公司；Transwell Permeable Supports購(gòu)自美國(guó)Corning公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、順鉑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒、Annexin-V/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自北京鼎國(guó)生物公司；兔抗人HOXD10、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、肌動(dòng)蛋白(β-actin)一抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗購(gòu)自北京中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1 HOXD10基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞及培養(yǎng)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胃癌細(xì)胞耐藥系SGC7901/VCR細(xì)胞以1×105個(gè)/ml重懸于含10%胎牛血清的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基中后，種植于6孔細(xì)胞板中，放入含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)融合率達(dá)80%～90%時(shí)，開(kāi)始HOXD10基因轉(zhuǎn)染。先將50 μl Opti-MEM稀釋混勻4 μg重組pcDNA3.1-EGFP-HOXD10表達(dá)質(zhì)粒及pcDNA3.1-EGFP空載質(zhì)粒，再用50 μl Opti-MEM將2 μl的LipofectamineTM2000稀釋混勻，分別室溫孵育5 min后將其混勻再孵育20 min，均勻加入到SGC7901/VCR細(xì)胞中共培養(yǎng)轉(zhuǎn)染6 h后更換新的培養(yǎng)基。同時(shí)加入1.0 g/L的G418進(jìn)行陽(yáng)性篩選，同時(shí)用未轉(zhuǎn)染的SGC7901/VCR作對(duì)照。當(dāng)細(xì)胞大部分死亡時(shí)，換用0.5 g/L的G418篩選。挑取陽(yáng)性克隆細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，分別獲得HOXD10基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞和空載轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

1.2.2 HOXD10基因轉(zhuǎn)染檢測(cè)：重組pcDNA3.1-EGFP-HOXD10表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SGC7901/VCR細(xì)胞并篩選后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，在倒置熒光顯微鏡下觀察各組的細(xì)胞形態(tài)和綠色熒光表達(dá)情況。同時(shí)消化離心收集各轉(zhuǎn)染組及轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞，加入1 ml RNAiso Plus提取液勻漿提取總RNA，并利用反轉(zhuǎn)試劑盒逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一鏈為模板。根據(jù)人HOXD10基因和內(nèi)參β-actin基因設(shè)計(jì)引物為HOXD10：上游5′-TTCACCGCTCTTTGTTTG-3′，下游5′-AGTTACCCTGCATTACGA-3′；β-actin：上游5′-CTGGGACGACATGGAGAAA-3′，下游5′-AGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3′。利用Bio-Rad公司的IQ5TMReal-time PCR系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)pcDNA3.1-EGFP-HOXD10表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前后各組SGC7901/VCR細(xì)胞中HOXD10基因的表達(dá)情況。PCR的反應(yīng)條件為：95 ℃ 60 s，95 ℃ 10 s，58 ℃ 20 s，70 ℃ 10 s，40個(gè)循環(huán)。各組重復(fù)檢測(cè)3次，以2-△△Ct方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)。同時(shí)在細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，消化收集各組細(xì)胞，RAPI強(qiáng)裂解液裂解細(xì)胞提取細(xì)胞中總蛋白，利用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度后，各組上樣30 μg總蛋白進(jìn)行10%的SDS-PAGE電泳2 h后，半干法轉(zhuǎn)PVDF膜，封閉后孵育多克隆兔抗人HOXD10和β-actin一抗，4 ℃過(guò)夜后利用TBST洗滌3次后孵育山羊抗兔HRP標(biāo)記二抗(1∶5 000)2 h，后TBST洗滌后ECL化學(xué)發(fā)光顯影，曝光拍照，用Quantity One軟件分析各組細(xì)胞中HOXD10蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 MTT方法檢測(cè)細(xì)胞增殖：分別收集HOXD10基因轉(zhuǎn)染前后的SGC7901/VCR細(xì)胞，設(shè)置未轉(zhuǎn)染對(duì)照組、EGFP空載組和HOXD10轉(zhuǎn)染組。利用各組培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞濃度為104個(gè)/ml，接種于96孔板中，分別先后培養(yǎng)12、24、36、48、60、72 h后，每孔加入20 μl的MTT溶液(濃度為5 mg/ml)，37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸棄培養(yǎng)基，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl，振蕩10 min后，置于酶標(biāo)儀測(cè)定492 nm處各孔的A值。每組設(shè)置6個(gè)重復(fù)孔，各進(jìn)行3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 平板實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞單克隆形成能力：分別取未轉(zhuǎn)染對(duì)照組、EGFP空載組和HOXD10基因轉(zhuǎn)染組SGC7901/VCR細(xì)胞，消化后收集用培養(yǎng)基重懸成單細(xì)胞懸液。在細(xì)胞培養(yǎng)板中分別加入各組含500個(gè)細(xì)胞的單細(xì)胞懸液，在37 ℃含5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)7 d，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，用4%多聚甲醛固定30 min，1%的結(jié)晶紫染色30 min后PBS洗滌2次。在顯微鏡下拍照計(jì)數(shù)單克隆數(shù)，各組單克隆形成率(%)=各組單克隆數(shù)/接種細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和順鉑作用下凋亡率：收集各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SGC7901/VCR細(xì)胞進(jìn)行同步化后接種于6孔板中，調(diào)整每孔細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/ml細(xì)胞，置于37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。各組細(xì)胞消化離心后收集棄上清，并用70%預(yù)冷乙醇在4 ℃固定12 h以上后，離心棄上清洗去乙醇，用500 μl PBS重懸細(xì)胞加入PI和RNaseA(50 μg/ml)孵育后室溫避光經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組HUVEC細(xì)胞周期并計(jì)算各組細(xì)胞周期細(xì)胞百分比。同時(shí)收集各組細(xì)胞，參照文獻(xiàn)[7]更換含0.6 mg/L順鉑、10%胎牛血清的RPMI 1640新培養(yǎng)基繼續(xù)24 h，后分別加入5 μl的FITC標(biāo)記Annexin V及10 μl PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力：收集HOXD10基因轉(zhuǎn)染前后各組SGC7901/VCR細(xì)胞，用培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/ml。分別在各組Transwell板的上室膜上涂抹均勻的1 mg/ml的Matrigel膠50 μl，置于37 ℃培養(yǎng)箱中30 min使形成基底膜結(jié)構(gòu)后，將各組細(xì)胞各取100 μl加入到Transwell上室中，在下室中加入含20%胎牛血清的1640培養(yǎng)基600 μl，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)好后用4%多聚甲醛固定小室濾膜，并擦除上表面細(xì)胞，用結(jié)晶紫染色10 min后PBS洗滌2遍，在顯微鏡下觀察各組細(xì)胞濾膜上穿過(guò)膜侵襲的細(xì)胞，拍照并計(jì)數(shù)各組SGC7901/VCR細(xì)胞侵襲率。侵襲率(%)=各組平均侵襲細(xì)胞數(shù)/未處理組侵襲細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.7 Western blotting檢測(cè)細(xì)胞MMP-2蛋白表達(dá)情況：HOXD10基因轉(zhuǎn)染SGC7901/VCR細(xì)胞后，收集正常未轉(zhuǎn)染組、EGFP空載組、HOXD10基因轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，PBS洗滌1次后按照相同的方法提取各組細(xì)胞中總蛋白并測(cè)定蛋白濃度。每組上樣30 μg總蛋白后進(jìn)行10%的SDS-PAGE電泳2 h，半干法轉(zhuǎn)膜封閉后分別孵育細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體(1∶1 000)4 ℃過(guò)夜，TBST洗滌后二抗(1∶5 000)孵育2 h，ECL顯影，曝光拍照。用Quantity One軟件分析目的條帶相對(duì)吸光值，并用內(nèi)參β-actin進(jìn)行校正。

2 結(jié)果

2.1 HOXD10基因轉(zhuǎn)染SGC7901/VCR細(xì)胞后表達(dá)情況通過(guò)將構(gòu)建的重組pcDNA3.1-EGFP-HOXD10表達(dá)質(zhì)粒用脂質(zhì)體可以順利轉(zhuǎn)染到SGC7901/VCR細(xì)胞中，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和發(fā)熒光變化。未轉(zhuǎn)染對(duì)照組中細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整不發(fā)熒光，而轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-EGFP空載組和pcDNA3.1-EGFP-HOXD10基因轉(zhuǎn)染組中，大部分細(xì)胞均發(fā)出綠色熒光，說(shuō)明SGC7901/VCR細(xì)胞中有綠色熒光蛋白EGFP表達(dá)，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功(見(jiàn)圖1)。為進(jìn)一步檢測(cè)HOXD10基因轉(zhuǎn)染SGC7901/VCR細(xì)胞后的表達(dá)情況，分別利用Real-time PCR和Western blotting方法檢測(cè)HOXD10基因和蛋白的表達(dá)情況。Real-time PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與未轉(zhuǎn)染組相比，EGFP空載組中HOXD10基因表達(dá)未見(jiàn)明顯變化，而HOXD10基因轉(zhuǎn)染組中HOXD10基因表達(dá)顯著提高約12倍(P<0.05)；Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與未轉(zhuǎn)染組相比，EGFP空載組中HOXD10蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化，而HOXD10基因轉(zhuǎn)染組中HOXD10蛋白表達(dá)上升約5倍(P<0.05,見(jiàn)圖2)。

2.2 HOXD10基因轉(zhuǎn)染對(duì)SGC7901/VCR細(xì)胞增殖的影響利用MTT方法檢測(cè)HOXD10基因轉(zhuǎn)染SGC7901/VCR細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)的生長(zhǎng)曲線以判斷其對(duì)細(xì)胞增殖的影響。與未轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比，EGFP空載組中細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的吸光值變化不明顯(P>0.05)；而HOXD10基因轉(zhuǎn)染組中細(xì)胞在48、60、72 h時(shí)的吸光值(分別為0.51±0.03、0.59±0.04、0.63±0.04)均顯著低于未轉(zhuǎn)染對(duì)照組(分別為0.65±0.04、0.77±0.03、0.88±0.04)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)圖3)。

圖1 HOXD10基因轉(zhuǎn)染SGC7901/VCR細(xì)胞后形態(tài)及熒光變化(20×) A:未轉(zhuǎn)染對(duì)照組；B:EGFP空載組；C:HOXD10基因轉(zhuǎn)染組

注：與未轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比，*P<0.05。

注：與未轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比，*P<0.05。

2.3 HOXD10基因轉(zhuǎn)染對(duì)SGC7901/VCR細(xì)胞單克隆形成的影響利用平板實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HOXD10基因轉(zhuǎn)染對(duì)SGC7901/VCR細(xì)胞單克隆形成的影響。未轉(zhuǎn)染對(duì)照組和EGFP空載組中細(xì)胞單克隆形成數(shù)差別不大，而HOXD10基因轉(zhuǎn)染組中細(xì)胞單克隆形成數(shù)顯著降低。經(jīng)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，未轉(zhuǎn)染對(duì)照組、EGFP空載組中細(xì)胞單克隆形成率分別為(45.50±4.50)%、(42.00±5.50)%，相比未見(jiàn)明顯變化(P>0.05)；而HOXD10基因轉(zhuǎn)染組中細(xì)胞單克隆形成率為(19.50±4.60)%，顯著低于未轉(zhuǎn)染對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)圖4)。

2.4 HOXD10基因轉(zhuǎn)染對(duì)SGC7901/VCR細(xì)胞周期的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HOXD10基因轉(zhuǎn)染后對(duì)SGC7901/VCR細(xì)胞周期的影響。與未轉(zhuǎn)染對(duì)照組細(xì)胞中G0/G1期(55.65±3.10)%和S+G2/M期(31.24±2.53)%相比，HOXD10基因轉(zhuǎn)染組中細(xì)胞G0/G1期百分比顯著升高(P<0.05)；而S+G2/M期百分比顯著下降(P<0.05)。而EGFP空載組中細(xì)胞G0/G1期和S+G2/M期百分比值與未轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見(jiàn)圖5)。

注：與未轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比，*P<0.05。

注：與未轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比，*P<0.05。

2.5 HOXD10基因轉(zhuǎn)染對(duì)順鉑作用下SGC7901/VCR細(xì)胞凋亡的影響利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HOXD10基因轉(zhuǎn)染對(duì)順鉑作用下耐藥SGC7901/VCR細(xì)胞凋亡的影響。在0.6 mg/L順鉑作用下，未轉(zhuǎn)染對(duì)照組和EGFP空載組中SGC7901/VCR細(xì)胞凋亡較少，驗(yàn)證了SGC7901/VCR細(xì)胞的耐藥性，而HOXD10基因轉(zhuǎn)染組中細(xì)胞凋亡則顯著增加。與未轉(zhuǎn)染對(duì)照組細(xì)胞凋亡率(15.50±3.25)%相比，EGFP空載組細(xì)胞凋亡率變化不顯著，為(18.35±4.55)%(P>0.05)，而HOXD10基因轉(zhuǎn)染組中細(xì)胞凋亡率顯著增加，為(46.48±4.64)%(P<0.05，見(jiàn)圖6)。

注：與未轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比，*P<0.05。

2.6 HOXD10基因轉(zhuǎn)染對(duì)SGC7901/VCR細(xì)胞侵襲的影響利用Transwell實(shí)驗(yàn)可以檢測(cè)HOXD10基因轉(zhuǎn)染對(duì)SGC7901/VCR細(xì)胞侵襲的影響。與未轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比，EGFP空載組中細(xì)胞的侵襲數(shù)未見(jiàn)明顯變化，而HOXD10基因轉(zhuǎn)染組中細(xì)胞侵襲數(shù)顯著減少。與未轉(zhuǎn)染對(duì)照組侵襲率(99.55±1.25)%相比，HOXD10基因轉(zhuǎn)染組中細(xì)胞侵襲率顯著下降至(38.46±4.65)%(P<0.05，見(jiàn)圖7)。

注：與未轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比，*P<0.05。

2.7 HOXD10基因轉(zhuǎn)染對(duì)SGC7901/VCR細(xì)胞中MMP-2表達(dá)的影響利用Western blotting方法檢測(cè)HOXD10基因轉(zhuǎn)染對(duì)SGC7901/VCR細(xì)胞中腫瘤侵襲性相關(guān)因子MMP-2蛋白的表達(dá)。與未轉(zhuǎn)染對(duì)照組(0.82±0.04)相比，EGFP空載組中MMP-2蛋白表達(dá)(0.78±0.04)未見(jiàn)明顯變化，而HOXD10基因轉(zhuǎn)染組中MMP-2蛋白表達(dá)則顯著降低，為0.26±0.05(P<0.05，見(jiàn)圖8)。

注：與未轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比，*P<0.05。

3 討論

HOXD10是人類同源盒基因(Homeobox，HOX)家族中的一員，HOX基因是一類特殊的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，其編碼蛋白能夠與特異性DNA結(jié)合后調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育和細(xì)胞生長(zhǎng)分化，而近來(lái)研究表明其異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[7]。目前，在多種腫瘤中均可檢測(cè)到HOX家族相關(guān)基因的異常表達(dá)如結(jié)腸癌、腎癌、乳腺癌、骨肉癌等[8]。HOX家族基因與乳腺癌等多種惡性腫瘤的預(yù)后及發(fā)展密切相關(guān)，參與其細(xì)胞增殖、分化、凋亡信號(hào)通路等[9]。HOXD10作為同源盒家族中一種，與腫瘤的關(guān)系研究尚處于初步階段，在對(duì)乳腺癌、食管癌、人腦星形細(xì)胞瘤等腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)HOXD10蛋白表達(dá)水平低于其在正常組織中水平，其可能作為抑癌基因表達(dá)[10]。同時(shí)已有研究表明不同腫瘤細(xì)胞中HOXD10表達(dá)水平與其分化程度和侵襲轉(zhuǎn)移能力相關(guān)[11]。任輝等[12]研究也發(fā)現(xiàn)HOXD10在正常胃黏膜組織中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，而在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性的胃癌組織中表達(dá)極弱或不表達(dá)。胃癌作為消化道中最為常見(jiàn)的惡性腫瘤，在我國(guó)惡性腫瘤發(fā)病率中占首位，盡管目前對(duì)胃癌研究已有較大進(jìn)展，但因其強(qiáng)侵襲能力和轉(zhuǎn)移能力，仍未有較滿意的診斷和治療途徑[13]。而胃癌的發(fā)生發(fā)展涉及到多因素包括抑癌基因的表達(dá)異常、細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期的調(diào)控異常、基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄異常等方面[14]。HOXD10基因作為可能的抑癌基因，與胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，特別是對(duì)胃癌的生物學(xué)行為影響尚未見(jiàn)研究，因此，本研究利用真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法，將HOXD10基因轉(zhuǎn)染至人胃癌耐藥細(xì)胞系SGC7901/VCR中，使HOXD10基因高表達(dá)，進(jìn)而檢測(cè)其對(duì)SGC7901/VCR細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲等生物功能的影響。

本研究中將HOXD10基因轉(zhuǎn)染至SGC7901/VCR細(xì)胞后，利用Real-time PCR和Western blotting方法分別檢測(cè)HOXD10轉(zhuǎn)染前后基因和蛋白的表達(dá)變化，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染后HOXD10基因和蛋白表達(dá)水平分別顯著上升約12倍和5倍，說(shuō)明HOXD10基因在正常人胃癌耐藥細(xì)胞系SGC7901/VCR中表達(dá)較低，而通過(guò)基因轉(zhuǎn)染后能夠在SGC7901/VCR中高表達(dá)。利用MTT方法檢測(cè)HOXD10基因轉(zhuǎn)染后在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)SGC7901/VCR細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與未轉(zhuǎn)染組和EGFP空載組相比，HOXD10基因轉(zhuǎn)染組細(xì)胞生長(zhǎng)較緩慢且在48～72 h時(shí)間段生長(zhǎng)曲線顯著降低。平板單克隆實(shí)驗(yàn)?zāi)軌驒z測(cè)單個(gè)細(xì)胞的增殖能力，本研究中HOXD10基因轉(zhuǎn)染SGC7901/VCR細(xì)胞后，細(xì)胞單克隆形成率也顯著下降，充分說(shuō)明HOXD10基因過(guò)表達(dá)能夠抑制人胃癌耐藥細(xì)胞系SGC7901/VCR細(xì)胞增殖。

細(xì)胞的增殖水平及能力主要受到細(xì)胞周期時(shí)相的調(diào)節(jié)，細(xì)胞周期是細(xì)胞活動(dòng)的基本過(guò)程，包括DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)和細(xì)胞分裂暫停期(G0期)[15]。本研究利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HOXD10基因轉(zhuǎn)染至SGC7901/VCR細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期能夠阻滯于G0/G1期，而反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的S+G2/M期百分率也顯著下降，與上述檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HOXD10基因轉(zhuǎn)染后過(guò)表達(dá)抑制SGC7901/VCR細(xì)胞增殖結(jié)果是一致的。HOXD10作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞發(fā)育分化，因此，HOXD10基因轉(zhuǎn)染后抑制SGC7901/VCR細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的機(jī)制可能是HOXD10過(guò)表達(dá)調(diào)控相關(guān)轉(zhuǎn)錄信號(hào)影響細(xì)胞G0期向G1期細(xì)胞分化的能力。同時(shí)利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HOXD10基因轉(zhuǎn)染后在順鉑作用下的細(xì)胞凋亡情況。人胃癌耐藥細(xì)胞系SGC7901/VCR對(duì)一般化療藥物具有耐藥性[16]，檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)在0.6 mg/L順鉑作用下,未轉(zhuǎn)染對(duì)照組和EGFP空載組細(xì)胞凋亡率均較低，而當(dāng)HOXD10基因轉(zhuǎn)染后SGC7901/VCR細(xì)胞凋亡率顯著上升，說(shuō)明HOXD10過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)人胃癌耐藥SGC7901/VCR對(duì)化療藥物的敏感性，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

人胃癌耐藥細(xì)胞系SGC7901/VCR因具有強(qiáng)耐藥性，比一般胃癌SGC7901細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲和遷移能力[17]。本研究中利用Transwell方法檢測(cè)HOXD10基因轉(zhuǎn)染后對(duì)SGC7901/VCR細(xì)胞侵襲能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HOXD10基因轉(zhuǎn)染組中細(xì)胞的侵襲率顯著下降，說(shuō)明HOXD10高表達(dá)能夠抑制SGC7901/VCR細(xì)胞的侵襲能力。為了揭示HOXD10高表達(dá)抑制SGC7901/VCR細(xì)胞侵襲的機(jī)制，利用Western blotting檢測(cè)了HOXD10基因轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞中侵襲性相關(guān)因子MMP-2的表達(dá)情況。在腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)發(fā)揮關(guān)鍵性作用，MMPs能夠降解細(xì)胞基質(zhì)外各種蛋白成分，從而破壞腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向周圍組織的侵襲遷移[18]。而在MMPs家族中，MMP-2被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞中影響侵襲性生長(zhǎng)的最佳預(yù)測(cè)因子[19]。本研究中Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HOXD10基因轉(zhuǎn)染SGC7901/VCR后細(xì)胞侵襲能力下降同時(shí)MMP-2蛋白表達(dá)水平也隨之顯著下降，說(shuō)明HOXD10高表達(dá)抑制SGC7901/VCR細(xì)胞侵襲能力可能通過(guò)抑制MMP-2蛋白表達(dá)發(fā)揮作用。

綜上所述，本研究利用HOXD10基因轉(zhuǎn)染人胃癌耐藥細(xì)胞系SGC7901/VCR，誘導(dǎo)HOXD10高表達(dá)，發(fā)現(xiàn)能夠顯著抑制SGC7901/VCR的細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并通過(guò)抑制MMP-2蛋白表達(dá)降低細(xì)胞侵襲能力。通過(guò)本研究證明HOXD10在胃癌發(fā)生、發(fā)展的病理機(jī)制中發(fā)揮重要作用，并可為胃癌的治療和診斷提供理論依據(jù)和新方向。

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(責(zé)任編輯：馬 軍)

Influence of HOXD10 gene transfection on cell proliferate, apoptosis and invasion of human gastric cancer resistance SGC7901/VCR

CHEN Ling1, CHEN Kai2, YANG Xigui1, JIANG Chao1, YANG Xiangshan3

1. Department of the Third Internal Medicine, Affiliated Hospital of Shandong Academy of Medical Sciences, Ji’nan 250031; 2. Department of Thoracic Surgery, the Third Affiliated Hospital of Kunming Medical University; 3. Department of Pathology, Affiliated Hospital of Shandong Academy of Medical Sciences, China

Objective To investigate the expression of HOXD10 gene after transfecting human gastric cancer cell line SGC7901/VCR and its effect on cell proliferation, apoptosis and invasion. Methods HOXD10 expression plasmid (pcDNA3.1-EGFP-HOXD10) was trasfected into SGC7901/VCR, then HOXD10 gene and protein expression effect were tested by Real-time PCR and Western blotting. The effect of HOXD10 gene transfection on cell proliferation, monoclonal formation, cell cycle, apoptosis treated with cisplatin, cell incasion of the SGC7901/VCR were determined by MTT assay, tablet monoclonal experiments, flow cytometry and Transwell assay, respectively. And the expression of tumor invasion related factor matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) was detected by Western blotting after HOXD10 gene transfected.Results The levels of HOXD10 gene and protein expression were significantly increased after HOXD10 gene transfected into SGC7901/VCR cell (P<0.05); which could inhibit the cell proliferation, monoclonal formation, cell cycle of SGC7901/VCR, and enhance the apoptosis rate after treated with cisplatin (P<0.05); and inhibit the cell invasion and MMP-2 protein expression (P<0.05).Conclusion HOXD10 could be highly expressed after the HOXD10 gene transfected into human gastric cancer resistant cell line SGC7901/VCR, inhibit the cell proliferation, monoclonal formation, cell cycle and invasion ability and improve the rate of apoptosis in casplatin, which inbibit the invasion of SGC7901/VCR cells related to the decrease of MMP-2 expression.

HOXD10; Gene transfection; Cell proliferation; Apoptosis; Cell invasion; MMP-2

陳玲，主治醫(yī)師，研究方向：胃癌基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)及臨床治療。E-mail：chenling_712@163.com

楊香山，副主任醫(yī)師，研究方向：惡性腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移分子機(jī)制研究。E-mail：yangxsh@126.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.01.003

R735.2

A

1006-5709(2016)01-0009-07

2015-06-10