肖帥，廖雄輝，羅海燕，張樹琴，李洪波，2，*

（懷化學(xué)院1.生物與食品工程學(xué)院；2.民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南懷化418008）

昆蟲神經(jīng)毒素AaIT原核表達(dá)、純化及抗體制備

肖帥1，廖雄輝1，羅海燕1，張樹琴1，李洪波1，2，*

（懷化學(xué)院1.生物與食品工程學(xué)院；2.民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南懷化418008）

人工合成AaIT的成熟基因，連接到pET32載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，純化重組AaIT蛋白并免疫小鼠，經(jīng)蛋白質(zhì)-G柱對抗血清進(jìn)行純化.研究結(jié)果表明，純化得到了AaIT蛋白經(jīng)免疫小鼠和純化抗血清得到了特異性強(qiáng)的AaIT抗體蛋白.

昆蟲神經(jīng)毒素；原核表達(dá)；抗血清；親合純化；抗體

昆蟲神經(jīng)毒素是一類選擇性作用于昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)的多肽類毒素[1].這類昆蟲專一性毒素的分子靶點(diǎn)是細(xì)胞膜表面的離子通道，已知高度特異的昆蟲神經(jīng)毒素最主要的分子靶點(diǎn)是鈉離子通道.蝎子是昆蟲神經(jīng)毒素最主要的來源之，從蝎毒中分離的蝎長鏈昆蟲神經(jīng)毒素是一類選擇性作用昆蟲鈉離子通道的毒素，這類毒素一般由60-70個(gè)氨基酸殘基組成，通常包含2-4對分子內(nèi)二硫鍵[2-4].AaIT是一種從北非蚶蝎Androctonus australis Hector毒腺中分離得到的高度選擇性的昆蟲神經(jīng)毒素，能引起昆蟲興奮性神經(jīng)中毒，該毒素作用位點(diǎn)是鈉離子通道，也是目前研究得最多的一種昆蟲神經(jīng)毒素，已被應(yīng)用于獲得轉(zhuǎn)基因抗蟲植株和提高昆蟲病毒的毒力[5-8].幾納克到幾十納克每克體重劑量的AaIT就能使翅目、雙翅目、直翅目等昆蟲在數(shù)分鐘左右癱瘓甚至死亡[7，8]. AaIT是一種高效且專一的昆蟲神經(jīng)毒素，在農(nóng)業(yè)害蟲的防控上具有潛在應(yīng)用價(jià)值.為了準(zhǔn)確快速地檢測AaI T，制備相應(yīng)抗體非常必要.

1 材料

AaIT成熟蛋白的基因由上海生工合成并連接到pET32載體.表達(dá)用菌株BL21-codonplus（DE3）購自廣州Invitrogen公司.鎳親和層析樹脂購自Qiagen公司，酶標(biāo)二抗體購自于CST公司，1 ml蛋白質(zhì)-G預(yù)裝柱購自GE公司.蛋白純化設(shè)備為BIO-RAD Duoflow系統(tǒng).其它化學(xué)試劑均為分析純產(chǎn)品.

2 方法

2.1 目標(biāo)蛋白的驗(yàn)證

重組表達(dá)載體pET32/AaIT轉(zhuǎn)化BL21-codonplus（DE3）表達(dá)菌株.隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化子數(shù)個(gè)，接種至LB（50 mg/LAmp）液體培養(yǎng)基中，37℃和IPTG條件下振蕩培養(yǎng)至A600=0.6左右，加入終濃度為0.1 mMIPTG，37℃和200 rpm條件下誘導(dǎo)，誘導(dǎo)6 h后取菌液80 μl，加入20 μl 5×SDS-PAGE變性上樣緩沖液，95℃變性5 min，SDS-PAGE分析重組蛋白的表達(dá).

2.2 目標(biāo)蛋白的純化

取大腸桿菌轉(zhuǎn)化子過夜培養(yǎng)的LB液體種子，1：100比例接種至100 ml液體培養(yǎng)基中，37℃、250 rpm培養(yǎng)至A600=0.6左右，加入終濃度為0.1 mM的IPTG，37℃、200 rpm條件誘導(dǎo)6 h.根據(jù)精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南和文獻(xiàn)報(bào)告的方法利用鎳親合層析柱對重組包涵體蛋白進(jìn)行純化[9，10].取不同咪唑濃度的蛋白洗脫液，加入DS-PAGE上樣緩沖液、95℃變性5 min，15%SDS-PAGE分析檢測.

2.3 抗血清的制備及純化

從SDS-PAGE膠上將目標(biāo)條帶切下、磨碎并加入弗氏完全佐劑，腹腔注射雄性6周齡昆明小鼠，取免疫前血清為陰性對照.在第一次免疫后后每間隔2周左右加強(qiáng)免疫1次，于第2次加強(qiáng)免疫后的7-10天，抽取小鼠腹水.將純化的10 μg/ml AaIT蛋白包被96孔酶標(biāo)板，以不同釋稀度的抗血清為一抗、HRP標(biāo)記山羊抗兔IGg為二抗，間接ELISA法測定抗血清的效價(jià).取效價(jià)最高的腹水，pH7.4 PBS稀釋10倍，0.22 μm濾膜過濾，10倍柱體積的PBS平衡蛋白質(zhì)-G純化柱.以1 ml/min的流速將腹水掛柱，100倍柱體積的pH5.0的0.1 MNaAC漂洗純化柱后，0.1 M甘氨酸-HCl緩沖液（pH 2.4）洗脫、1 MTris中和并PBS透析，截留分子量10 kDa的超濾管濃縮蛋白.12%SDS-PAGE對純化前后的抗體進(jìn)行分析.

2.4 純化抗體特異性分析

分別取未經(jīng)誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)液菌體總蛋白、未經(jīng)純化的AaIT包涵體蛋白和經(jīng)純化的AaIT包涵體蛋白，SDS-PAGE后轉(zhuǎn)膜，將純化的抗體（1 mg/ml）稀釋5000倍用作一抗，HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG為二抗，對抗體的特異性進(jìn)行跡分析.

3 結(jié)果

3.1 表達(dá)產(chǎn)物的驗(yàn)證

隨機(jī)挑取2個(gè)pET32空載體的BL21轉(zhuǎn)化子和4個(gè)pET32/AaIT轉(zhuǎn)化子，誘導(dǎo)表達(dá)前后總蛋白的SDS-PAGE結(jié)果如圖1所示.pET32空載體BL21轉(zhuǎn)化子N-端硫氧還蛋白（Trx）融合片段表達(dá)產(chǎn)物的理論分子量約18 kDa，即空載體轉(zhuǎn)化子在IPTG誘導(dǎo)下，表達(dá)的Trx片段分子量約18 kDa；AaIT蛋白理論分子量約8 kDa，其N-端融合了Trx片段，AaIT/Trx融合蛋白分子量理論值為26 kDa左右.泳道1是未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pET32空載體BL21轉(zhuǎn)化子總蛋白、泳道2是經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pET32空載體BL21轉(zhuǎn)化子總蛋白，說明在IPTG誘導(dǎo)下，空載體轉(zhuǎn)化子實(shí)現(xiàn)了Trx片段的表達(dá)，分子量大小與理論相符約為18 kDa.未加入IPTG誘導(dǎo)的菌體總蛋白（泳道3）在26 kDa位置沒有特異蛋白條帶，而3株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化子總蛋白（泳道4-6）在26 kDa有明顯的目標(biāo)條帶（箭頭所示），且特異表達(dá)蛋白的分子量與預(yù)期相符，說明重組AaIT在大腸桿菌中的實(shí)現(xiàn)了融合表達(dá).

圖1 SDS-PAGE分析AaIT融合蛋白的表達(dá)

3.2 重組蛋白純化

SDS-PAGE結(jié)果顯示，含有100、200和300 mM咪唑的洗脫液可將重組AaIT蛋白洗脫下來，在咪唑?yàn)?00 mM時(shí)，洗脫的目標(biāo)蛋白純度最高，當(dāng)咪唑濃度為400 mM時(shí)未見目標(biāo)蛋白，說明在咪唑300 mM時(shí)目標(biāo)蛋白已全被洗脫（圖2所示）.以上電泳結(jié)果說明，鎳親合層析可以純化AaIT包涵體蛋白.

圖2 重組AaIT蛋白的純化

3.3 抗血清的制備及純化

經(jīng)免疫小鼠，獲得的最高滴度的抗血清效價(jià)達(dá)1：64000，將此血清用蛋白質(zhì)-G柱進(jìn)行純化，抗體蛋白的洗脫曲線如圖3-A所示，經(jīng)過漂洗液的漂洗后，0.1 M甘氨酸-HCl緩沖液（pH 2.4）洗脫得到單一蛋白峰.將純化前后的抗體進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖3-B所示，純化前的血清在抗體重鏈50 kDa和輕鏈25 kDa處外還有大量雜蛋白（泳道1），尤其是在55-70 kDa處存在大量的血清白蛋白條帶.而經(jīng)過蛋白質(zhì)-G柱純化后，單一蛋白峰僅在抗體重鏈50 kDa和輕鏈25 kDa處有特異條帶（泳道2），結(jié)果說明，利用蛋白質(zhì)-G柱可以高效除去抗體以外的蛋白，從而實(shí)現(xiàn)對抗體的純化.

圖3 A.抗體蛋白的洗脫曲線B.抗體純化前后的SDS-PAGE結(jié)果

3.4 純化抗體特異性分析

未經(jīng)誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)液菌體總蛋白、未經(jīng)純化的AaIT包涵體蛋白和經(jīng)純化的AaIT包涵體蛋白，SDS-PAGE分離后的考染結(jié)果如圖4-A所示，未經(jīng)純化的AaIT包涵體蛋白除目標(biāo)蛋白外還有很多雜蛋白條帶（泳道1），未經(jīng)誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)液菌體總蛋白除雜蛋白外沒有目標(biāo)蛋白條帶（泳道2），經(jīng)純化的AaIT包涵體蛋白僅在目標(biāo)位置處有蛋白條帶（泳道3）.Western blot分析抗體的特異性的結(jié)果如圖4-B所示，以稀釋5000倍的抗體為一抗，未經(jīng)誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)液菌體總蛋白未出現(xiàn)印跡條帶（泳道2），純化的AaIT包涵體蛋白（泳道1）和未經(jīng)純化的AaIT包涵體蛋白在目標(biāo)位置（泳道3）均僅檢測到目標(biāo)蛋白條帶，未經(jīng)純化的AaIT包涵體蛋白未出現(xiàn)明顯非特異條帶表明純化的抗體具有很高的特異性.

圖4 A.SDS-PAGE分離蛋白B.蛋白印跡

4 討論

昆蟲毒素除了具有高度的昆蟲選擇性、癱瘓和致死劑量低，因此這類毒素在農(nóng)業(yè)上有非常誘人的前景，目前已有不少利用昆蟲神經(jīng)毒素改造生物殺蟲劑提升殺蟲效果和將這類基因轉(zhuǎn)入到植物中獲得轉(zhuǎn)基因植株的報(bào)告.而檢測這類毒素最有效的方法之一就是利用抗體技術(shù)承包.制備多抗仍然是獲得抗體的常用方法，而高質(zhì)量多克隆抗體的制備需要高純度的抗原，以基因工程手段制備重組蛋白并對蛋白質(zhì)進(jìn)行純化，純化的蛋白中常常含有雜蛋白，而雜蛋白除去往往非常困難，導(dǎo)致抗體的特異性受到影響.本研究將純化的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分離，再將目標(biāo)蛋白連同膠一起切下，磨碎后免疫小鼠.經(jīng)過SDS-PAGE后能將不同大小分子量的蛋白分開，切下的含目標(biāo)條帶具有很高純度，保證了抗原的特異性，因此能獲得高質(zhì)量的多克隆抗血清.制備的抗血清利用親合層析柱對抗體進(jìn)行了純化，結(jié)果表明，經(jīng)過蛋白質(zhì)-G柱純化后，得到了高純度的抗體蛋白，該抗體能特異性檢測AaIT重組蛋白.抗體的制備為AaIT的快速與準(zhǔn)確檢測打下了良好的前期基礎(chǔ).

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Prokaryotic Expression，Purification and Antibody Preparation of Insect Neurotoxin AaIT

XIAO Shuai1，LIAO Xiong-hui1，LUO Hai-yan1，ZHANG Shu-qing1，LI Hong-bo1，2
（1.College of Biological and Food Engineering；2.The Key Laboratory of Research and Utilization of Ethnomedicinal Plant Resources of Hunan Province，Huaihua University，Huaihua，Hunan 418008）

Mature AaIT gene was synthesized and cloned into the pET32 expression vector.The resulting recombinant vector of pET32/AaIT was transformed intoEscherichia coli expression strain and expressed with IPTG induction.The antiserum was purified by protein-G affinity column post immunized mice with purified AaIT.The AaIT protein was purified and immunized to mice，the high specific antibody was purified by protein-G affinity column.

insect neurotoxin；prokaryotic expression；antiserum；affinity purification；antibody

Q786

A

1671－9743（2016）11－0060－04

2016-08-17

湖南省生物類專業(yè)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練中心項(xiàng)目及湖南省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目（15A147）.

肖帥，1995年生，女，懷化學(xué)院本科生；

*通訊作者：李洪波，1980年生，男，湖南永州人，副教授，博士，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué).