李啟照

（安徽新華學(xué)院藥學(xué)院，安徽合肥230088）

女貞不同部位中總皂苷的含量測定及提取工藝

李啟照

（安徽新華學(xué)院藥學(xué)院，安徽合肥230088）

采用正交試驗(yàn)等技術(shù)方法對女貞的根皮、莖皮及葉子中總皂苷的含量及提取工藝進(jìn)行分析.研究結(jié)果表明，最佳提取工藝條件為：提取時(shí)間2 h、料液比1：20、乙醇濃度75%、提取溫度60℃.其根皮、莖皮和葉子中總皂苷含量分別為1.934%、1.667%和1.382%.通過精密度試驗(yàn)等方法學(xué)考察，說明該提取工藝精確、穩(wěn)定、可靠.

女貞；總皂苷；提取工藝；正交試驗(yàn)；含量

女貞為木犀科常綠植物，種子含有三萜類、多糖類、皂苷類、黃酮類活性成分，具有降血脂、降血糖、抗衰老、抗氧化、滋陰補(bǔ)腎、增強(qiáng)免疫和抗腫瘤等多種藥理作用.近年來，有關(guān)女貞的藥理方面研究較多，但對女貞不同部位（葉、莖皮、根皮）中皂苷含量研究較少.本實(shí)驗(yàn)采用單因素和正交試驗(yàn)利用回流方法對女貞莖皮、根皮、葉子中皂苷活性成分進(jìn)行提取純化、測定，為女貞全株有效成分利用開發(fā)提供研究基礎(chǔ).

1 材料與儀器試劑

女貞（Ligustrum lucidum）實(shí)驗(yàn)材料采自安徽新華學(xué)院校內(nèi)，由劉金旗教授鑒定.人參皂苷Re與齊墩果酸對照品均購自中國藥品生物制品鑒定所，甲醇、乙醇、正丁醇等均為分析純.主要儀器包括UV-2102 PCS型紫外分光光度計(jì)（尤尼柯上海儀器有限公司），SHB—111循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司），R-200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮儀器有限公司），METFLERAE 240分析天平（上海托利多一梅特勒儀器有限公司）等.

2 方法與結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)方法

2.1.1 女貞中皂苷提取方法考察

2.1.1.1 微波法提取

將女貞的根皮、莖皮、葉子洗凈，干燥，粉碎，過40目篩，收集備用.準(zhǔn)確稱取干燥的根皮、莖皮、女貞葉粉各5.0 g，分別放置在三個(gè)100 ml的錐形瓶中.然后各準(zhǔn)確加入25 ml 75%乙醇，微波提取30 min，收集提取液；繼續(xù)加75%乙醇25 ml，微波30 min，離心過濾，收集提取液，減壓濃縮，殘?jiān)谜麴s水溶解，用20 ml水飽和的正丁醇萃取3-5次，合并醇層溶液再用60 ml氨試液（正丁醇飽和）萃取2-3次，合并醇層水浴蒸干，用甲醇溶解殘?jiān)? ml定容，待測.每個(gè)樣品重復(fù)提取3次.

2.1.1.2 超聲法提取考察

精密稱取女貞根皮、莖皮、葉子粗粉各5.0 g，分別放置在3個(gè)100 ml圓底燒瓶中，各加25 ml 75%乙醇，浸泡30 min，然后分別超聲提取30 min，減壓過濾，殘?jiān)谜麴s水溶解，用20 ml水飽和的正丁醇萃取3-5次，合并醇層溶液再用60 ml氨試液（正丁醇飽和）萃取2-3次，合并醇層水浴蒸干，用甲醇溶解殘?jiān)? ml定容，待測.每個(gè)樣品重復(fù)提取3次.

2.1.1.3 乙醇回流提取法考察

精密稱取女貞根皮、莖皮、葉子粗粉各5.0 g，分別加50 ml 75%乙醇，60℃水浴回流2次，每次1 h，過濾，揮干，殘?jiān)谜麴s水溶解，用20 ml水飽和的正丁醇萃取3-5次，合并醇層溶液再用60 ml氨試液（正丁醇飽和）萃取2-3次，合并醇層水浴蒸干，用甲醇溶解殘?jiān)? ml定容，待測.每個(gè)樣品重復(fù)提取3次.

2.1.2 對照品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取對照品人參皂苷Re和齊墩果酸各5 mg，分別加甲醇溶解并定容至10 ml，制成5 mg/ml作為對照品溶液.

2.1.3 供試品溶液的制備

精密稱取女貞根皮、莖皮、葉子粗粉各5.0 g，分別加50ml 75%乙醇，60℃水浴回流2次，每次1 h，過濾，揮干，殘?jiān)谜麴s水溶解，用20 ml水飽和的正丁醇萃取3-5次，合并醇層溶液再用60 ml氨試液（正丁醇飽和）萃取2-3次，合并醇層水浴蒸干，用甲醇溶解殘?jiān)?0 ml定容，為供試品溶液.

2.1.4 最大吸收波長的確定

分別精密吸取人參皂苷Re、齊墩果酸對照品溶液0.24、0.30、0.36、0.42、0.48 ml，放置在10 ml具塞磨口刻度試管中，取供試品溶液0.10、0.16 ml，分別置于10 ml具塞磨口刻度試管中，水浴揮干，加0.4 ml新鮮配置的5%香草醛-冰乙酸溶液、1.6 ml高氯酸、密塞，搖勻，60℃水浴20 min，室溫流水中放置10 min，加冰乙酸至5 ml，搖勻.以同法配置的空白溶液作參比，在紫外分光光度計(jì)上200-800 nm范圍內(nèi)掃描.結(jié)果顯示，人參皂苷在525nm波長處有最大吸收，齊墩果酸在545 nm波長處有最大吸收[1].因此，人參皂苷的測定波長為525 nm，齊墩果酸的測定波長為545 nm.

2.1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2.1.5.1 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密吸取齊墩果酸儲(chǔ)備液5 ml于25 ml容量瓶中，加甲醇定容，分別取0.6、1.2、1.8、2.4、3、3.6 ml，放置在干燥具塞試管中揮去甲醇，各加入新鮮配置的5%香草醛-冰醋酸0.4 ml和1.6 ml高氯酸，搖勻置于80℃水浴中加熱20 min，取出，用冰水冷卻至室溫，加10 ml乙酸乙酯，搖勻，以相同試劑為空白.在545 nm波長處測定吸光度，以吸光度A為縱坐標(biāo)，以齊墩果酸含量（mg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.計(jì)算回歸方程為Y=1.027x+0.03256，相關(guān)系數(shù)r=0.9998.

2.1.5.2 人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密吸取人參皂苷儲(chǔ)備液5 ml于25 ml容量瓶中，加甲醇定容，分別取0.6、1.2、1.8、2.4、3、3.6 ml，于干燥具塞試管中揮去甲醇，各加入0.4 ml新鮮配制的5%香草醛-冰醋酸和1.6 ml高氯酸，搖勻置于80℃水浴中加熱20 min，取出，用冰水冷卻至室溫，加10 ml乙酸乙酯，搖勻，以相同試劑為空白[3].在525 nm波長處測定吸光度，以吸光度A為縱坐標(biāo)，以人參皂苷Re含量（mg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.計(jì)算回歸方程為Y=2.8202x+ 0.0511，相關(guān)系數(shù)r=0.9994，人參皂苷Re在0.062～0.37 mg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.

2.1.6 不同提取方法皂苷含量測定

精密吸取上述不同方法提取的女貞根皮、莖皮、葉子提取液各10ml，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下方法進(jìn)行測定，依據(jù)回歸方程計(jì)算其中總皂苷含量，以人參皂苷Re，齊墩果酸為對照品，不同提取方法女貞根皮、莖皮、葉子含量如表1～3.

表1 不同提取方法根皮總皂苷含量測定結(jié)果

表2 不同提取方法莖皮總皂苷含量測定結(jié)果

表3 不同提取方法葉子總皂苷含量測定結(jié)果

由表1～3可知，乙醇回流提取法對女貞根莖葉皂苷含量提取率均高于超聲和微波提取法，因此，本實(shí)驗(yàn)采用的提取方法是乙醇回流提取法，并且對乙醇回流方法進(jìn)行單因素正交實(shí)驗(yàn)考察.

2.2 薄層鑒別分析

2.2.1 供試品溶液的制備

將烘干的女貞根皮、莖皮、葉子粉碎，過40目篩；分別稱取5.0 g放在3個(gè)錐形瓶中，加50 ml乙醇，超聲處理30 min，濾過，濾液于水浴上揮干，殘?jiān)?0 ml蒸餾水溶解后置于分液漏斗中加水飽和正丁醇萃取三次，每次20 ml，合并正丁醇層，再用60 ml正丁醇飽和的氨試液分3次萃取，合并正丁醇層與水浴上揮干，殘?jiān)蛹状既芙?，定容?0 ml，作為供試品溶液.

2.2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取對照品齊墩果酸和人參皂苷Re各5 mg，分別加5 ml甲醇溶液.配制為對照品溶液.

2.2.3 薄層色譜鑒別

精密吸取齊墩果酸對照品溶液10 μl、人參皂苷Re對照品溶液10 μl，根皮供試品10 μl、莖皮供試品溶液15 μl、葉子供試品20 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，將點(diǎn)好樣品的薄層板放入有丙酮∶氯仿（1∶1）展開劑中展開，待展開至規(guī)定距離展開約10 cm，取出，晾干，噴10%硫酸乙醇溶液于105℃烘至顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）和日光下檢視.檢測樣品的色譜圖和對照樣品的相應(yīng)位置，顯示相同的顏色點(diǎn)圖1.

2.3 紫外分光光度法測定總皂苷含量

2.3.1 含量測定

分別精密稱取根皮、莖皮、葉子粗粉各2.0 g于錐形瓶中，按“2.2.1”方法制備供試液，在525 nm處測定吸光度，計(jì)算含量，結(jié)果見表4.結(jié)果表明：根皮中的總皂苷含量最高，其次為莖皮，葉子中總皂苷含量最低.因此本實(shí)驗(yàn)只對女貞根皮皂苷提取工藝進(jìn)行考察實(shí)驗(yàn).

圖1 女貞薄層色譜圖

表4 女貞不同部位總皂苷含量測定結(jié)果（n=3）

2.3.2 精密度試驗(yàn)

精密移取5份人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液各2 ml，按上述方法顯色后測定吸光度，結(jié)果吸光度的平均值為0.512，RSD為0.44%，表明儀器的精密度是良好的.

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取根皮粗粉5份，按照“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述方法顯色后，測定吸光度，計(jì)算總皂苷含量，結(jié)果平均含量為19.87%，RSD為1.7%，表明本方法重復(fù)性良好[2].

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液分別于0、0.5、1、1.5、2 h測其吸光度，結(jié)果吸光度的平均值為0.623，RSD為2.9%，表明樣品在2.0 h內(nèi)穩(wěn)定性良好.

2.4 女貞總皂苷提取因素實(shí)驗(yàn)研究

2.4.1 提取時(shí)間的考察

準(zhǔn)確稱取4份5.0 g根皮粗粉，置于4個(gè)圓底燒瓶中，加入75%乙醇100 ml，60℃水浴回流，回流的時(shí)間為1、1.5、2、2.5 h，將提取液過濾，揮干，再分別用甲醇溶液溶解過濾，定容至50 ml，其他因素不變，按上述方法在525 nm處測定吸光度值.實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5所示.

表5 不同提取時(shí)間總皂苷的含量

由表5可知，女貞根皮的總皂苷提取率隨提取時(shí)間的增加而增加，但隨時(shí)間增加不成正比.綜合考慮，選擇提取時(shí)間為2 h.

2.4.2 提取溫度的考察

準(zhǔn)確稱取4份5.0 g根皮粗粉，置于4個(gè)圓底燒瓶中，加入75%乙醇100 ml，分別置于40、50、60、70℃水浴上回流2 h，將提取液過濾，揮干，再分別用甲醇溶液溶解過濾，定容至50 ml，其它因素不變，按上述方法在525 nm處測定吸光度值[3].實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6所示.

由表6可知，隨著溫度的增加，女貞根皮的總皂苷提取率也會(huì)增加，但溫度超過60℃時(shí)，提取率變化不大.綜合考慮，選擇60℃.

表6 不同提取溫度總皂苷的含量

2.4.3 料液比的考察

準(zhǔn)確稱取4份5.0 g根皮粗粉，置于4個(gè)錐形瓶中，分別加入50 ml、100 ml、150 ml、200 ml 75%乙醇，水浴回流2 h，將提取液過濾，揮干，再分別用甲醇溶液溶解過濾，定容至50 ml，其他因素不變，按上述方法在525 nm處測定吸光度值.實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表7所示.

表7 不同料液比總皂苷的含量

由表7可知，其提取率隨料液比增加不成正比，但料液比越大一般提取率越高，1：20與1：30相差不明顯.綜合考慮，最終選擇料液比1：20.

2.4.4 乙醇濃度的考察

準(zhǔn)確稱取4份5.0 g根皮粗粉，置于4個(gè)錐形瓶中，分別用濃度為55%、65%、75%、85%的乙醇水浴回流2 h，將提取液過濾，揮干，再分別加甲醇溶液溶解過濾，定容至50 ml，其他因素不變，按上述方法在525 nm處測定吸光度值.實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表8所示.

表8 不同濃度乙醇提取皂苷結(jié)果

從表8可知，隨著乙醇濃度的增加，女貞的整體提取率會(huì)升高.其中選擇乙醇濃度為75%提取效果較好.

2.5 女貞提取工藝條件因素正交試驗(yàn)

上述實(shí)驗(yàn)針對的是對女貞提取有單方面影響的因素，但從實(shí)際生產(chǎn)考慮各影響因素的相互影響也會(huì)影響女貞中總皂苷提取率的[4].因此，要充分考慮物料的料液比、提取次數(shù)、萃取時(shí)間、乙醇濃度等的特殊設(shè)計(jì)，通過正交試驗(yàn)，找出最佳提取條件，然后進(jìn)行工業(yè)發(fā)展.

2.5.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用L9（34）正交方案，分別對提取時(shí)間、提取次數(shù)、料液比量、乙醇濃度等因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，因素水平安排見表9.

表9 正交試驗(yàn)因素水平表

2.5.2 試驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)分析

由表10可知，對女貞總皂苷提取率的影響因素大小順序?yàn)樘崛〈螖?shù)（A）＞提取時(shí)間（B）＞料液比（C）＞乙醇濃度（D）.所以，因素A對指標(biāo)的影響極顯著，而因素D對指標(biāo)的影響不顯著.最終得出最佳的因素組合為A2B2C3D1.但根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)考慮，最終選擇A2B2C2D1較好.所以，提取女貞總皂苷的最佳工藝條件為：乙醇濃度75%、提取次數(shù)2次、提取時(shí)間2 h、料液比為1：20.

表10 正交試驗(yàn)表

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過對女貞根莖葉皂苷提取方法、微波、超聲法、乙醇回流法等提取方法進(jìn)行比較，得出乙醇回流法＞微波法＞超聲法.因此，本實(shí)驗(yàn)采用乙醇回流提取女貞根莖葉中皂苷成分.通過上述實(shí)驗(yàn)可以得出女貞根皮、莖皮、葉子中均含有皂苷類成分，其中根皮中的總皂苷含量最高為1.934%.綜合考慮，女貞總皂苷的最佳提取工藝條件為提取時(shí)間2 h、料液比1：20、乙醇濃度75%、提取溫度60℃.通過方法學(xué)實(shí)驗(yàn)考察表明，該工藝簡單快速，得率較高，穩(wěn)定性較好，使用試劑單純，方法可行，是女貞根莖葉皂苷成分提取較佳工藝條件.本實(shí)驗(yàn)在第一次提取時(shí)應(yīng)考慮藥材吸水性；在測定吸光度時(shí)冰水冷卻后要快速測定時(shí)間過長對測定結(jié)果影響較大.皂苷種類較多對不同類型皂苷組成、提取分離有待今后進(jìn)一步實(shí)驗(yàn).為女貞綜合利用開發(fā)提供更好的研究基礎(chǔ).

[1]郭東艷，盧雪梅，王明耿.等.太白檧木提取工藝研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2010，21（2）：377-378.

[2]張恩戶，于妮娜，劉敏，等.女貞葉提取物及其成分熊果苷祛痰、鎮(zhèn)咳作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].江蘇中醫(yī)藥，2011，26（11）：69-71.

[3]寧德利，阮洪生，韓承偉，殷奎德，等.紫外分光光度法測定長白檧木根、莖、葉中多糖含量[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，21（3）：67-69.

[4]皺翔，林淋，曲中原，王超，劉影，寄宇彬，等.虎眼萬年青總皂苷提取工藝研究[J].工業(yè)藥學(xué)，2014，27（2）：322-324.

Analysis on the Total Saponins Content and Extraction Conditions in Different Parts ofLigustrum Lucidum

LI Qi-zhao
（School of Pharmacy，Anhui Xinhua University，Hefei，Anhui 230088）

The extraction conditions and content of saponins in the different parts（root bark,stem bark and leaves）ofligustrum lucidumwere studyed using orthogonal experiment and other technical methods.The results showed that the optimum extraction conditions were as follows∶extraction time 2 h，solid-liquid ratio 1：20，ethanol concentration 75%，extraction temperature 60℃.Saponins content in the root bark，stem bark and leaves was 1.934%，1.667%and 1.382%，respectively.The extraction conditions were accurate，stable and reliable using experimental methods such as precision test etc.

Ligustrum lucidum；total saponins；extraction condition；orthogonal test；content

Q946

A

1671－9743（2016）11－0001－05

2016-08-08

安徽教育廳自然科學(xué)研究項(xiàng)目（KJ2015A307）；安徽新華學(xué)院校級質(zhì)量工程（2012xwsjx072013xqjdx01；2015xqjdx04；2015xxk06）.

李啟照，1970年生，男，安徽金寨人，講師，研究方向：藥物合成研究.