陳文標(biāo)，楊維群，劉立飛，倪亞萍

1.泉州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部， 福建 泉州 362011; 2.解放軍第180醫(yī)院病理科；3.福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州市第一醫(yī)院病理科

胃癌組織中Keap1、IKKβ蛋白表達(dá)及意義

陳文標(biāo)1，楊維群1，劉立飛2，倪亞萍3

1.泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部， 福建 泉州 362011; 2.解放軍第180醫(yī)院病理科；3.福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州市第一醫(yī)院病理科

目的 探討Keich樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Keap1)和IκB 激酶β(inhibitor kappa B kinase β，IKKβ)在胃癌組織中的表達(dá)。方法 應(yīng)用免疫組化法檢測54例胃癌患者的胃癌組織及24例癌旁正常組織中Keap1和IKKβ蛋白的表達(dá)，分析Keap1和IKKβ蛋白的表達(dá)與胃癌臨床病理特征關(guān)系及二者表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果 Keap1與IKKβ在胃癌組織中的表達(dá)高于癌旁正常組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；胃癌組織中Keap1蛋白的表達(dá)與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移具有明顯相關(guān)性(P<0.05)，但與患者性別、年齡、腫瘤大小、組織學(xué)類型、組織分化程度無相關(guān)性(P>0.05)；胃癌組中IKKβ蛋白的表達(dá)與組織分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤大小、組織學(xué)類型均無相關(guān)性(P>0.05)；Keap1的表達(dá)與IKKβ的表達(dá)無相關(guān)性(r=0.2839，P>0.05)。結(jié)論 胃癌組織中Keap1、IKKβ蛋白表達(dá)異常，提示Keap1可能影響IKKβ介導(dǎo)的NF-κB信號通路，并在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

胃癌；Keap1；IKKβ；免疫組化

Keap1，又叫胞漿肌動蛋白伴侶分子(Kelch-like ECH-associated protein 1)，其主要功能是能夠與靶標(biāo)蛋白特異性結(jié)合，并通過與泛素蛋白激酶CUL3/RBX1組成復(fù)合體介導(dǎo)靶蛋白的泛素化降解，是體內(nèi)各信號通路中一種非常重要的調(diào)節(jié)蛋白[1]。IκB激酶β(inhibitor kappa B kinase β，IKKβ)是IKK復(fù)合物中的一個催化亞基，能夠激活核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear transcription factor kappa B，NF-κB)，在免疫應(yīng)答、炎癥、腫瘤發(fā)生、發(fā)展等過程中發(fā)揮重要作用[2]。Keap1最常見的靶標(biāo)蛋白是核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor-E2-re-lated factor 2，Nrf2)，主要調(diào)控細(xì)胞抗氧化應(yīng)激反應(yīng)，研究發(fā)現(xiàn)Keap1-Nrf2信號通路在神經(jīng)系統(tǒng)疾病、糖尿病、心血管疾病、炎癥、腫瘤等疾病中發(fā)揮重要作用[3-5]。研究也證實(shí)Keap1除了能調(diào)節(jié)Nrf2介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，還能直接作用于IKKβ，介導(dǎo)IKKβ的降解，Keap1可能在 NF-κB信號通路的調(diào)控中起重要作用[6-7]。有關(guān)Keap1與IKKβ二者在胃癌組織中表達(dá)的情況及二者相關(guān)性尚未見報道，本研究采用免疫組化法檢測Keap1和IKKβ在胃癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)，分析兩者之間在胃癌組織中表達(dá)的差異性與臨床病理特征的關(guān)系，探討二者表達(dá)差異與胃癌的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料標(biāo)本來源于福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州市第一醫(yī)院與解放軍第180醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除的胃癌組織存檔蠟塊54例和相應(yīng)癌旁正常組織(距癌≥5 cm)24例，所有病例的臨床和病理資料完整。胃癌組織中，男32例，女22例，年齡38～79歲，平均年齡(55.9±5.2)歲；胃癌標(biāo)本中鱗狀細(xì)胞癌9例，腺癌45例；中高分化38例，低分化16例?；颊咝g(shù)前均未進(jìn)行相關(guān)腫瘤放化療及其他針對腫瘤的治療。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器與試劑：全自動組織脫水機(jī)(LEIKA TP1020)、組織包埋儀(LEIKA EG1150H)、冷凍切片機(jī)(LEICA CM1950，德國)，兔抗人多克隆一抗Keap1和IKKβ購自武漢博士德生物工程有限公司，免疫組化試劑盒UltraSensitiveTMSP購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2.2 免疫組化檢測及結(jié)果判定：石蠟切片脫蠟水化，采用枸櫞酸鹽緩沖液、微波爐內(nèi)加熱進(jìn)行抗原熱修復(fù)。一抗按1∶300稀釋，按照免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行操作。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以細(xì)胞質(zhì)中Keap1和IKKβ蛋白出現(xiàn)均勻棕黃色顆粒為陽性表達(dá)，采用江蘇捷達(dá)顯微數(shù)碼采集系統(tǒng)對免疫組織化學(xué)染色切片進(jìn)行圖像分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用 SPSS 16.0 處理數(shù)據(jù)，采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)性檢驗(yàn)。以α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌及癌旁正常組織中Keap1與IKKβ蛋白的表達(dá)與癌旁正常組織比較，胃癌組織中Keap1與IKKβ蛋白多見于細(xì)胞質(zhì)中，呈淡黃色或棕褐色顆粒(見圖1)。Keap1與IKKβ在胃腺癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

圖1 IKKβ(A1～A3)、Keap1(B1～B3)在胃癌組織、癌旁正常組織、空白對照組免疫組化檢測(SP 400×)

表1 Keap1和 IKKβ蛋白在胃癌組織與癌旁正常組織中的表達(dá)

2.2 胃癌中Keap1和IKKβ蛋白的表達(dá)與臨床病理資料之間的關(guān)系胃癌組織中Keap1蛋白的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性(P<0.05)，但與患者性別、年齡、腫瘤大小、組織分化程度、組織學(xué)類型無相關(guān)性(P>0.05)；胃癌組織中IKKβ蛋白的表達(dá)與組織分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性(P<0.05)，而與患者性別、年齡、腫瘤大小、組織學(xué)類型無相關(guān)性(P>0.05，見表2)。

表2 Keap1和IKKβ蛋白的表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

2.3 胃癌組織中Keap1與IKKβ蛋白表達(dá)之間的相關(guān)性Spearman相關(guān)性分析顯示，胃癌組織中Keap1與IKKβ的表達(dá)無相關(guān)性(r=0.2839，P>0.05，見表3)。

表3 胃癌組織中 Keap1和IKKβ蛋白表達(dá)之間的相關(guān)性分析

Tab 3 The correlation analysis of the expressions of Keap1 and IKKβ in gastric carcinoma

3 討論

胃癌是消化道常見的惡性腫瘤，研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)生、發(fā)展與多條信號通路調(diào)控改變相關(guān)。Keap1是分子量為69 KD的細(xì)胞質(zhì)蛋白伴侶分子，其一級結(jié)構(gòu)含有624個氨基酸，核心功能區(qū)主要由DGR、IVR、BTB/POZ等三個結(jié)構(gòu)域組成[8]。Keap1作為一種負(fù)調(diào)控蛋白,介導(dǎo)與之結(jié)合靶蛋白泛素化降解[1]，其中研究最多的靶蛋白是Nrf2，介導(dǎo)細(xì)胞的抗氧化反應(yīng)[9]，與疾病的發(fā)生關(guān)系密切。

然而越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，Keap1除了能調(diào)控Nrf2，同樣也可以作用NF-κB信號通路中關(guān)鍵的調(diào)控蛋白IKKβ[6,10-11]，是調(diào)控眾多信號通路的一個關(guān)鍵蛋白。IKKβ是經(jīng)典NF-κB信號通路IKK激酶復(fù)合物(由IKKα和IKKβ激酶及調(diào)節(jié)元件NEMO組成的三聚體)的核心組分。IKKβ活性增加或過表達(dá)可以有效刺激炎癥相關(guān)因子的分泌，如TNFα、IL-1、IL-6、IL-8、CSF-1和COX2等，在慢性炎癥和感染導(dǎo)致癌癥發(fā)生過程中起重要作用[2]。Lee等[6]研究發(fā)現(xiàn)Keap1的BTB/kelch區(qū)域能夠與IKKβETGE(NQE36TGE39)修飾區(qū)域特異性結(jié)合。Jiang等[11]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)IKKβ特異性結(jié)合Keap1的三個關(guān)鍵酪氨酸為Tyr525、Tyr574和Tyr334。Keap1特異性結(jié)合IKKβ，并與泛素連接蛋白CUL3-RBX1復(fù)合體相連,介導(dǎo)IKKβ的泛素化降解。因此，Keap1除了能調(diào)控Nrf2信號通路，同樣能調(diào)控NF-κB信號通路，可能是細(xì)胞內(nèi)信號通路相互溝通的橋梁[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌組織中，IKKβ的表達(dá)較癌旁正常組織高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明IKKβ在胃癌組織已出現(xiàn)異常表達(dá)。但作為IKKβ的負(fù)調(diào)控蛋白，Keap1在胃癌組織中的表達(dá)卻高于癌旁正常組織，與王敏等[13]在結(jié)腸腫瘤的研究結(jié)果相近。Spearman相關(guān)性分析顯示兩者的表達(dá)不具有相關(guān)性，推測可能與Keap1或者IKKβ基因發(fā)生突變有關(guān)。Thu等[14]對261份肺癌組織KEAP1/CUL3 E3泛素激酶復(fù)合體的基因功能進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，42%出現(xiàn)KEAP1/CUL3 E3基因的損傷，63%出現(xiàn)基因的異常表達(dá)，Keap1的基因敲除IKKβ與NF-κB的活性顯著增強(qiáng)，NF-κB靶基因的表達(dá)水平明顯升高。Keap1與IKKβ表達(dá)調(diào)節(jié)的失衡是否可能是腫瘤發(fā)生的一個重要因素有待進(jìn)一步研究。

應(yīng)用免疫組化方法分析Keap1、IKKβ在不同臨床病理學(xué)因素下的表達(dá)特征，對于判斷胃癌局部生物學(xué)行為、復(fù)發(fā)及預(yù)后具有重要意義。本研究結(jié)果表明，胃癌組織中Keap1蛋白的表達(dá)在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者中要高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者；提示Keap1蛋白與胃癌的浸潤和轉(zhuǎn)移可能相關(guān)，在胃癌的早期即發(fā)揮抑癌作用，隨著癌癥的進(jìn)展其抑制作用減弱，是否與Keap1結(jié)構(gòu)發(fā)生突變有關(guān)尚需進(jìn)一步研究。胃癌組中IKKβ蛋白的表達(dá)與組織分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)(P<0.05)，表明IKKβ在促進(jìn)腫瘤的發(fā)展及浸潤轉(zhuǎn)移中起到重要作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Keap1與IKKβ在胃癌組織中的表達(dá)高于癌旁正常組織，二者表達(dá)調(diào)節(jié)失衡，可能是腫瘤發(fā)生的一個重要因素。Keap1的表達(dá)與胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，IKKβ的表達(dá)與胃癌的分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性，有可能成為判斷胃癌惡性程度和預(yù)后的參考指標(biāo)，因此，對二者調(diào)控是否有可能成為胃癌治療的一個新方向值得進(jìn)一步研究。此外，有關(guān)Keap1與IKKβ調(diào)節(jié)失衡的原因，有待后續(xù)進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯：馬 軍)

Expression and significance of Keap1 and IKKβ in human gastric carcinoma

CHEN Wenbiao1, YANG Weiqun1, LIU Lifei2, NI Yaping3

1. Department of Basic Medicine, Quanzhou Medical College, Quanzhou 362011; 2. Department of Pathology, the 180th Hospital of PLA; 3. Department of Pathology, the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University in Quanzhou, China

Objective To investigate the expressions of Keap1 and IKKβ in gastric carcinoma．Methods The expressions of Keap1 and IKKβ were detected by immunohistochemistry in 48 cases of gastric carcinoma and 24 cases of adjacent normal tissue. The relationship of the expressions of Keap1 and IKKβ with the clinicopathological features of gastric cancers was analyzed. Results The expressions of Keap1 and IKKβ in gastric carcinoma tissue were higher than those in adjacent normal tissue (P<0.05). The expression of Keap1 was significantly correlated with lymph node metastasis (P<0.05), but was not correlated with the gender, age, tumor size, histologic type, degree of differentiation (P>0.05). The expression of IKKβ was significantly correlated with lymph node metastasis and the degree of differentiation (P<0.05),but was not correlated with gender, age, tumor size and histologic type. There was no correlation between the expressions of Keap1 and IKKβ (r=0.2839,P>0.05).Conclusion The expressions of Keap1 and IKKβ in gastric carcinoma are abnormal. The abnormal expressions of Keap1 and IKKβ may induce the signaling pathways of NF-κB, which result in the occurrence of gastric carcinoma．

Gastric carcinoma; Keap1; IKKβ; Immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.06.011

泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校校級課題(2009XJ02)

陳文標(biāo)，講師，碩士，研究方向：腫瘤免疫。E-mail：abiao-66@163.com

楊維群，教授，研究方向：病理學(xué)教學(xué)與科研。E-mail：745687571@qq.com

R735．2

A

1006-5709(2016)06-0638-04

2015-04-20