張 杰，張 梅，姜相君

大連醫(yī)科大學(xué)附屬青島市市立醫(yī)院消化內(nèi)二科，山東 青島 266011

胃癌組織中ERCC1基因的高甲基化及DNMT1的表達(dá)

張 杰，張 梅，姜相君

大連醫(yī)科大學(xué)附屬青島市市立醫(yī)院消化內(nèi)二科，山東 青島 266011

目的 探討人切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1(excision repair cross-complementing gene 1，ERCC1)基因啟動(dòng)子CpG島甲基化和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNA methyltransferase 1，DNMT1)基因的表達(dá)與胃癌發(fā)生的關(guān)系及臨床意義。方法 采用甲基化特異性PCR(MSP)技術(shù)檢測(cè)60例胃癌組織及其相應(yīng)癌旁正常組織中ERCC1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)。同時(shí)應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(real-time RT-PCR)法和免疫組化(IHC)SP法分別檢測(cè)ERCC1及DNMT1基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 胃癌組織中ERCC1基因啟動(dòng)子CpG島甲基化陽性率為68.3%，明顯高于相應(yīng)的癌旁正常組織(23.3%)。胃癌組織中ERCC1 mRNA陽性率顯著低于癌旁正常組織(31.7%vs71.7%，P<0.05)，而胃癌組織中DNMT1 mRNA陽性率明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(78.3%vs16.7%，P<0.05)。ERCC1 mRNA 陰性表達(dá)的胃癌組織中基因啟動(dòng)子的甲基化率較ERCC1 mRNA陽性表達(dá)者明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(92.7%vs15.8%，P<0.001)。結(jié)論 ERCC1基因啟動(dòng)子CpG島高甲基化及DNMT1基因表達(dá)上調(diào)可能參與胃癌的發(fā)生與發(fā)展。DNMT1可能調(diào)控ERCC1基因的甲基化。

胃癌；ERCC1基因；甲基化；DNMT1

在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中，胃癌是主要的致死疾病之一，大部分患者診斷時(shí)已經(jīng)為晚期，所以胃癌的早期診斷尤為重要。胃癌發(fā)生與發(fā)展是一個(gè)多基因、多步驟參與的復(fù)雜過程，其中包括癌基因的過度表達(dá)與抑癌基因的表達(dá)失活等，表觀遺傳學(xué)機(jī)制起著重要作用，而其中最常見就是的DNA甲基化[1]。越來越多的研究[2-4]證實(shí)，抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的高甲基化參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。DNA甲基化是指在甲基化轉(zhuǎn)移酶的催化下DNA序列中的腺嘌呤(A)或胞嘧啶(C)堿基與甲基發(fā)生共價(jià)結(jié)合的過程[5]，DNMT1在甲基化過程中起最主要的、維持甲基化狀態(tài)的作用[6]。相關(guān)研究已經(jīng)表明：在胃癌組織中ERCC1基因的表達(dá)較正常的胃黏膜組織有所降低[7-10]。胃癌組織中ERCC1基因的低表達(dá)或許與DNMT1存在一定的關(guān)系。本研究采用甲基化特異性PCR檢測(cè)60例胃癌組織及其相應(yīng)的癌旁正常組織中ERCC1基因啟動(dòng)子CpG島甲基化狀態(tài)；同時(shí)應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(real-time RT-PCR)法和免疫組化(IHC)SP法分別檢測(cè)ERCC1及DNMT1基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平，并初步探討其與胃癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集青島市市立醫(yī)院2014年1月-2014年10月普外科切除的新鮮胃腫瘤標(biāo)本60例，標(biāo)本經(jīng)病理組織學(xué)確診為原發(fā)性胃癌，術(shù)前未行放化療等抗腫瘤治療，擁有完整的臨床資料。60例患者中男37例，女23例，年齡35～75歲，中位年齡55歲。胃癌組織取自癌灶中央非壞死區(qū)域，癌旁正常組織取距離癌組織5 cm以上，經(jīng)病理證實(shí)，組織均正常。所有標(biāo)本均于術(shù)后半小時(shí)內(nèi)獲得，液氮速凍后-80 ℃冰箱保存。

1.2 主要試劑基因組DNA提取試劑， DNA甲基化試劑盒，Trizol、RT-PCR反應(yīng)試劑盒，免疫組化試劑盒。

1.3 方法

1.3.1 組織DNA提取和甲基化修飾：每個(gè)樣本取30 mg左右組織塊進(jìn)行勻漿處理，參照組織基因組DNA提取試劑盒說明書提取基因組DNA，紫外分光光度儀測(cè)定 DNA 濃度和純度，OD260/OD280 比值在1.8～2.0之間的DNA用于甲基化修飾。各樣本DNA取800 ng參照EZ DNA甲基化試劑盒說明書進(jìn)行甲基化修飾，修飾好的DNA洗脫后保存于-20 ℃冰箱中。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)：根據(jù)ERCC1基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島DNA序列，設(shè)計(jì)ERCC1甲基化引物為：M，F(xiàn):5′-TTTAGGATTATAGAGAGTAGCGCGA-3′，R:5′-CAAAAAAAATAAAAACGATACAACG-3′。非甲基化引物：U，F(xiàn):5′-TTTAGGATTATAGAGAGTAGTGTGA-3′,R:5′-AAAAAAATAAAAACAATACAACACC-3′。

1.3.3 甲基化特異性PCR(methylation specific PCR，MSP)：取修飾后的DNA 2 μl進(jìn)行MSP反應(yīng)。反應(yīng)體系按照PCR試劑盒的推薦量25 μl體系進(jìn)行，其中PCR混合液12.5 μl，上下游引物各0.5 μl，修飾后的DNA 2 μl，滅菌雙蒸水9.5 μl。MSP循環(huán)條件為：97 ℃預(yù)變性5 min后，95 ℃變性45 s，甲基化引物和非甲基化引物分別在57 ℃、55 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，共40個(gè)循環(huán)，最后于72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增后，每種PCR產(chǎn)物取10 μl在2.5%的瓊脂糖凝膠上電泳，染色用溴化乙錠，并在紫外光照射下觀察分析。

1.3.4 組織RNA提?。喝?.5 g組織用研磨棒充分研磨，然后放入Trizol(日本TakaRa公司)1 ml中，按照試劑說明書進(jìn)行操作，得到的RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性，并用核酸蛋白分析儀檢測(cè)其濃度及其A值，測(cè)得1.8～2.0，符合純度要求，置于-80 ℃冰箱保存。

1.3.5 逆轉(zhuǎn)錄-多聚合酶鏈反應(yīng)(real-time RT-PCR)：取RNA 1 μg，嚴(yán)格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)說明書操作合成cDNA。用β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行PCR，其上游引物為：5′-CCTTCCTTCCTGGGCATGGAGTCCTG-3′,其下游引物為：5′-GGAGCAATGATCTTGACTTC-3′；ERCC1上游引物為：5′-TCACACAACCTGCACCCAGACTAC-3′，下游引物為：5′-CTGACTGTCTTTGTTGACTGA-3′；DNMT1上游引物為：5′-CGGTTCTTCCTCCTGGAGAATGTCA-3′，下游引物為：5′-CACTGATAGCCCATGCGGACCA-3′，引物均由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為20 μl，由SYBR? Premix Ex TaqTM Ⅱ(×2)10.0 μl，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μl，cDNA模板2.0 μl，ROX Reference Dye(×50)0.4 μl，滅菌蒸餾水6.0 μl。PCR反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃ 5 s、65 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物于2.5%瓊脂糖凝膠電泳，Gel ID凝膠圖像分析系統(tǒng)攝片并分析測(cè)定其光密度。計(jì)算各個(gè)樣本mRNA的表達(dá)相對(duì)值，表達(dá)相對(duì)值=ERCC1積分光密度/β-actin內(nèi)對(duì)照積分光密度，積分光密度=條帶強(qiáng)度×條帶面積。

1.3.6 免疫組化SP法：SP染色按照試劑盒說明書操作，以3%過氧化氫室溫孵育15 min消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，抗原熱修復(fù)，常規(guī)IHC標(biāo)記，DAB染色，蘇木素襯染，中性樹膠封片，顯微鏡觀察。取已知陽性片在同一條件下染色作為陽性對(duì)照，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3.7 IHC結(jié)果判定：ERCC1、DNMT1陽性主要位于細(xì)胞核中，細(xì)胞漿可有少量表達(dá)，顯微鏡下隨機(jī)觀察5個(gè)高倍鏡視野(400×)，著色打分：不著色為0分；淡黃色為1分；棕黃色為2分；褐色為3分。染色細(xì)胞所占比例打分：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。兩者相乘，0分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～8分為陽性(++)，9～12分為強(qiáng)陽性(+++)，將陰性與弱陽性視為陰性表達(dá)，陽性與強(qiáng)陽性視為陽性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料數(shù)據(jù)組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，P為雙側(cè)性檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織與癌旁正常組織中ERCC1啟動(dòng)子區(qū)的甲基化情況胃癌組織中ERCC1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率為68.3%(41/60)，明顯高于癌旁正常組織(23.3%,14/60)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=24.47，P<0.001，見圖1、表1)。

2.2 胃癌組織與癌旁正常組織中ERCC1與DNMT1的mRNA表達(dá)情況胃癌組織中ERCC1 mRNA陽性率(31.7%，19/60)顯著低于癌旁正常組織(71.7%，43/60，P<0.05)；而胃癌組織中DNMT1 mRNA陽性率(78.3%，47/60)明顯高于癌旁正常組織(16.7%，10/60，P<0.05)。在ERCC1 mRNA表達(dá)下調(diào)的胃癌組織中DNMT1 mRNA的表達(dá)高于ERCC1 mRNA表達(dá)正常的組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.26，P<0.05，見表2)。

A：胃癌組織；B：癌旁正常組織；MP：甲基化陽性對(duì)照；M：甲基化條帶；U：非甲基化條帶。

圖1 ERCC1基因MSP產(chǎn)物的電泳圖譜

Fig 1 The electrophoretic pattern of ERCC1 MSP production

表1 胃癌組織的ERCC1蛋白的陽性率和ERCC1基因甲基化[例數(shù)(%)]

表2 ERCC1與DNMT1在胃癌組織中表達(dá)的相關(guān)性

Tab 2 Correlation between ERCC1 and DNMT1 in gastric cancer

ERCC1mRNADNMT1mRNA高表達(dá)正常表達(dá)χ2值P值低表達(dá)36712．26<0．05正常表達(dá)711

2.3 胃癌組織與癌旁正常組織ERCC1、DNMT1蛋白表達(dá)情況胃癌組織與癌旁正常組織中ERCC1、DNMT1蛋白表達(dá)率與mRNA基本一致，ERCC1蛋白在癌旁正常組織中的表達(dá)陽性率為93.3%(56/60)，明顯高于胃癌組織(56.7%，34/60)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=21.21，P<0.001)。DNMT1蛋白在胃癌組織中的表達(dá)陽性率為71.7%(43/60)，明顯高于癌旁正常組織(16.7%，10/60)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=26.81，P<0.001)。

2.4 胃癌組織中ERCC1基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)與ERCC1 mRNA表達(dá)之間的關(guān)系在41例ERCC1 mRNA陰性表達(dá)的胃癌組織中，檢測(cè)出38例(92.7%)該基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化，而在ERCC1 mRNA表達(dá)陽性的19例胃癌組織中，僅檢測(cè)出3例(15.8%)基因啟動(dòng)子甲基化，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=35.48，P<0.001)。

2.5 胃癌組織中ERCC1與DNMT1蛋白表達(dá)之間的相關(guān)性分析胃癌組織中的ERCC1與DNMT1蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.669，P<0.001，見圖2)。

圖2 ERCC1積分值與DNMT1積分值相關(guān)分析

3 討論

ERCC1基因位于染色體19q13.2，全長(zhǎng)15 kb，含10個(gè)外顯子，該基因在核苷酸切除修復(fù)(NER)途徑中起著重要作用，是NER過程中的先導(dǎo)基因[11]，該基因編碼一種單鏈DNA核酸內(nèi)切酶，與化學(xué)交聯(lián)聚乙烯(XPE)形成二聚體，識(shí)別損傷切割DNA，使突變的基因得到修復(fù)，防止細(xì)胞進(jìn)一步癌變，降低腫瘤的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[12]。

檢測(cè)腫瘤抑癌基因的甲基化可以用于癌癥的診斷與治療。目前有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化在一定程度上是可逆的，而DNA甲基化需要DNMT的催化，因此可以應(yīng)用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑阻斷DNA維持甲基化狀態(tài)，稱為去甲基化[5]。大量的體外研究證實(shí)，應(yīng)用5-氮雜-2-脫氧胞苷處理后，抑癌基因表達(dá)缺失的胃癌細(xì)胞株均重新表達(dá)該基因，故通過抑癌基因去甲基化可恢復(fù)基因的正常功能，為腫瘤的治療提供了一個(gè)新的方法[13-14]。

本研究發(fā)現(xiàn)：胃癌組織中ERCC1啟動(dòng)子區(qū)的甲基化率較正常組織明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，推測(cè)ERCC1表達(dá)的缺失與該基因啟動(dòng)子的甲基化存在一定的關(guān)系，抑癌基因高甲基化可能導(dǎo)致表達(dá)的降低或缺失，而DNMT1在甲基化的過程中起著維持甲基化的作用。我們對(duì)ERCC1的甲基化與DNMT1的關(guān)系進(jìn)行了初步的研究。本研究結(jié)果顯示：DNMT1蛋白在胃癌組織中的表達(dá)較正常組織明顯升高，DNMT1與ERCC1蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。綜合以上研究結(jié)果，初步推測(cè)：胃癌組織中DNMT1的mRNA及蛋白表達(dá)顯著增高，導(dǎo)致抑癌基因ERCC1基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生異常甲基化，使抑癌基因mRNA及蛋白表達(dá)減少或缺失，失去抑制作用，具體發(fā)生機(jī)制還有待大樣本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究證實(shí)。

目前胃癌仍是世界上最常見的惡性腫瘤之一，外科手術(shù)治療是目前的主要手段，但是早期診斷及早期手術(shù)是降低胃癌病死率的關(guān)鍵。本研究結(jié)果有助于進(jìn)一步完善胃癌發(fā)生過程中的表觀遺傳修飾理論，為胃癌的診治提供新的思路，為胃癌的預(yù)防、早期診斷及治療提供試驗(yàn)和理論依據(jù)。

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(責(zé)任編輯：馬 軍)

Promoter methylation of the ERCC1 genes and DNMT1 expression in gastric cancer

ZHANG Jie, ZHANG Mei, JIANG Xiangjun

Department of Gastroenterology, the Affiliated Qingdao Municipal Hospital of Dalian Medical University, Qingdao 266011, China

Objective To investigate promoter methylation of ERCC1 gene,expression of DNMT1 and the relationship between expression of DNMT1 and gastric cancer.Methods Methylation status of the ERCC1 gene in 60 gastric cancer tissues and 60 normal tissues adjacent to cancer were detected by methylation-specific PCR (MSP). RT-PCR was used to detect the mRNA expressions of ERCC1 and DNMT1, immunohistochemistry (IHC) was employed to detect the protein expressions of ERCC1 and DNMT1 in the above samples.Results The positive rate of promoter methylation of the ERCC1 in gastric cancer was 68.3%, higher than that in normal tissues adjacent to cancer (23.3%,P<0.001).The positive rate of ERCC1 expression in gastric cancer was significantly lower than that in normal tissues adjacent to cancer (31.7%vs71.7%,P<0.05). DNMT1 mRNA expression was higher compared with normal tissues adjacent to cancer(78.3%vs16.7%，P<0.05). Methylation rate of ERCC1 mRNA negative expression in gastric cancer was significantly higher than that of ERCC1 mRNA positive expresion in gastric cancer (92.7%vs15.8%,P<0.001).Conclusion The promoter methylation of the ERCC1 gene and high expression of DNMT1 may be associated with the occurrence of gastric cancer.

Gastric cancer; ERCC1 gene; Methylation; DNMT1

張杰，碩士在讀，研究方向：消化系疾病。E-mail：zj382506550@163.com

姜相君，教授，博士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，研究方向：消化系疾病。E-mail：drjxj@163.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.06.008

R735.2

A

1006-5709(2016)06-0626-04

2015-07-22