唐慧+王朵勤+沈燕蕓+徐金華

摘 要 目的：闡明屋塵螨變應(yīng)原Derp1對(duì)人肥大細(xì)胞HMC-1釋放類(lèi)胰蛋白酶水平的影響。方法：流式細(xì)胞法測(cè)定HMC-1細(xì)胞表面蛋白酶激活受體2（PAR2）表達(dá)水平；將Derp1、SLIGRL-NH2（PAR2激活劑）、LRGILS-NH2（PAR2對(duì)照肽）及Derp1+ FSLLY（ PAR2拮抗劑）分別處理HMC-1細(xì)胞，用ELISA檢測(cè)藥物刺激后類(lèi)胰蛋白酶水平；采用鈣綠實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PAR2生物學(xué)功能。結(jié)果：肥大細(xì)胞表面表達(dá)PAR2受體；Derp1單獨(dú)作用于HMC-1可明顯引起HMC-1細(xì)胞內(nèi)鈣流釋放及類(lèi)胰蛋白酶的釋放，類(lèi)胰蛋白酶釋放水平明顯高于SLIGRL-NH2及正常對(duì)照；將Derp1與FSLLY共同作用于HMC-1時(shí)，可部分抑制HMC-1細(xì)胞內(nèi)的鈣流釋放及類(lèi)胰蛋白酶的釋放。結(jié)論：屋塵螨變應(yīng)原Derp1可以通過(guò)激活人肥大細(xì)胞HMC-1表面PAR2受體引起肥大細(xì)胞脫顆粒釋放類(lèi)胰蛋白酶。

關(guān)鍵詞 屋塵螨 肥大細(xì)胞 蛋白酶激活受體2 類(lèi)胰蛋白酶

中圖分類(lèi)號(hào)：R758.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2016）09-0010-04

Effect of house duct mite on the degranulation of the mast cells

TANG Hui， WANG Duoqin， SHEN Yanyun， XU Jinhua*

（Department of Dermatology， Huashan Hospital， Fudan University， Shanghai 200040， China）

ABSTRACT Objective： To study the effects of the house dust mite allergen Derp1 on the secretion of tryptase from the human mast cell line HMC-1. Methods： Flow cytometry assay was performed to determine the expression levels of protease activated receptor 2 （PAR2） on the surface of HMC-1 cells. HMC-1 cells were treated with Derp1， SLIGRL-NH2 （PAR2 agonist）， LRGILS-NH2 （control peptide for PAR2） or Derp 1 + FSLLY （PAR2 antagonist）， respectively， then the tryptase levels were measured using enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. Biological functions of PAR2 were determined using the calcium green indicator. Results： PAR2 receptor was expressed on the surfaces of mast cells. Derp1 alone induced a significant release of intracellular calcium and tryptase in HMC-1 cells. The level of tryptase release was significantly higher compared with the SLIGRL-NH2 treatment group and the normal control group. The combination of Derp1 with FSLLY could partly inhibit intracellular calcium and tryptase release in HMC-1 cells. Conclusion： Derp1 can induce HMC-1 cells degranulation to release tryptase by activating the PAR2 receptor on the cell surface.

KEY WORDS house dust mite； mast cell； protease activated receptor 2； tryptase

肥大細(xì)胞是變態(tài)反應(yīng)性皮膚病及慢性瘙癢發(fā)生中的關(guān)鍵細(xì)胞之一，其活化脫顆粒后可產(chǎn)生多種介質(zhì)，如組胺、類(lèi)胰蛋白酶等，其中類(lèi)胰蛋白酶是重要的致癢介質(zhì)[1-2]。屋塵螨是引起變態(tài)反應(yīng)性疾病最常見(jiàn)的環(huán)境變應(yīng)原之一，同時(shí)也是PAR2的激活劑[3]。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在研究屋塵螨變應(yīng)原Derp1對(duì)人肥大細(xì)胞HMC-1脫顆粒的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

人肥大細(xì)胞HMC-1細(xì)胞株由Dr. Butterfield 實(shí)驗(yàn)室（Mayo Clinic， Rochester， USA）友情饋贈(zèng)，類(lèi)胰蛋白酶ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)RND公司，SLIGRL-NH2（PAR2活化肽）、LRGILS-NH（2PAR2對(duì)照肽）和FSLLRY（PAR2抑制肽）購(gòu)自Tocris公司，屋塵螨Derp1購(gòu)自Abnova公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗鼠PAR2單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司，倒置顯微鏡（Nikon， japan），細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Electron Co.， USA），胎牛血清和青霉素（Gibco），PolyL-lysine （Sigma， USA）。

1.2 人肥大細(xì)胞HMC-1 表面PAR2表達(dá)

HMC-1細(xì)胞接種于75 cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，用細(xì)胞培養(yǎng)液[0%（v/v）胎牛血清（FBS），20 mmol/L4-羥乙基哌嗪乙磺酸，0.01%（v/v）硫代甘油，2 mmol/L L-谷氨酰胺，鏈霉素和1%青霉素]于37 ℃、5%（v/v） CO2、濕度為95%的無(wú)菌環(huán)境培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，經(jīng)20 g/L多聚甲醛固定30 min后用含10 g/L BSA的PBS洗滌FITC標(biāo)記的羊抗鼠PAR2 mAb以及同型對(duì)照4 mg/L 37 ℃ 孵育1 h ?？贵w標(biāo)記后細(xì)胞用含10 g/L BSA的PBS洗滌2次，重懸細(xì)胞以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肥大細(xì)胞PAR2表達(dá)。

1.3 人肥大細(xì)胞HMC-1培養(yǎng)與激發(fā)[4]

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)， 6孔板每孔5×105，設(shè)3個(gè)重復(fù)，用5 μg/ml Derp1、100 μmol/L SLIGRL-NH2、100 μmol/L LRGILS-NH2及100 μmol/L FSLLY+5 μg/ml Derp1分別處理細(xì)胞，于30 min后終止反應(yīng)，4 ℃條件下600×g離心10 min后收集上清置于一80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 ELISA方法檢測(cè)類(lèi)胰蛋白酶水平

用類(lèi)胰蛋白酶ELISA試劑盒按照操作說(shuō)明檢測(cè)上述實(shí)驗(yàn)收集的上清液中類(lèi)胰蛋白酶水平。

1.5 屋塵螨及類(lèi)胰蛋白酶刺激下人肥大細(xì)胞HMC-1鈣熒光強(qiáng)度的變化

將HMC-1用Poly-L-lysine固定至載玻片上，用凡士林固定在顯微鏡槽中，在顯微鏡下觀察。用5 μg/ml Derp1、100 μmol/L SLIGRL-NH2、100 μmol/L LRGILSNH2、100 μmol/L FSLLY+5 μg/ml Derp1、100 ng/L類(lèi)胰蛋白酶及100 ng/L 類(lèi)胰蛋白酶+100 μmol/L FSLLY（PAR2拮抗劑）分別處理HMC-1細(xì)胞30 min，計(jì)算處理前后細(xì)胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度的變化，將取得的數(shù)據(jù)歸一化處理。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

全部數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05時(shí)判定為統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 人肥大細(xì)胞HMC-1 表面PAR2表達(dá)

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，人肥大細(xì)胞HMC-1表面表達(dá)PAR2受體（圖1）。

2.2 屋塵螨變應(yīng)原Derp1對(duì)人肥大細(xì)胞HMC-1釋放類(lèi)胰蛋白酶水平的影響

Derp1、SLIGRL-NH2、LRGILS-NH2細(xì)胞培養(yǎng)液組作用于HMC-1 30 min后類(lèi)胰蛋白酶水平分別為（70.40±1.55）ng/ml、（64.45±1.36）ng/ml（24.29±2.60）ng/ml及（31.12±3.60）ng/ml。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，HMC-1組釋放類(lèi)胰蛋白酶的水平明顯高于SLIGRL-NH2、LRGILS-NH2和細(xì)胞培養(yǎng)液組（P<0.05），差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Derp1與FSLLY共同作用HMC-1 30 min后類(lèi)胰蛋白酶水平為（56.72±2.66）ng/ml，較Derp1單獨(dú)作用時(shí)明顯降低（P<0.05），較LRGILS-NH2和細(xì)胞培養(yǎng)液組依然明顯增高（P<0.05），差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

2.3 屋塵螨及類(lèi)胰蛋白酶刺激下人肥大細(xì)胞HMC-1表面PAR2活性測(cè)定

首先測(cè)定在細(xì)胞培養(yǎng)液中HMC-1的胞內(nèi)熒光強(qiáng)度。將取得的數(shù)據(jù)歸一化處理后繪制成圖2所示?？梢钥吹皆?0 min時(shí)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度下降至初始狀態(tài)的72.71%±2.21%，反應(yīng)了熒光淬滅的過(guò)程。分別用Derp1、SLIGRL-NH2、LRGILS-NH2、類(lèi)胰蛋白酶作用于HMC-1 30 min時(shí)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度下降至初始狀態(tài)的100.30%±2.37%、82.38%±2.24%、72.77%±3.16%、89.95%±2.25%。用Derp1+FSLLY，類(lèi)胰蛋白酶+FSLLY作用于HMC-1 30 min時(shí)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度下降至初始狀態(tài)的78.63%±3.15%及82.60%±3.29%。

3 討論

皮膚瘙癢是皮炎、濕疹、蕁麻疹、 接觸性皮炎、 結(jié)節(jié)性癢疹和特應(yīng)性皮炎等過(guò)敏性皮膚疾病最常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量， 需要及時(shí)有效的治療[5]， 然而，皮膚瘙癢的發(fā)病機(jī)制至今仍不清，導(dǎo)致抗瘙癢治療效果有限。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)吸入性的變應(yīng)原（主要是屋塵螨和粉塵螨）是引起過(guò)敏性皮膚病的重要誘因[6] ，在具有慢性瘙癢的過(guò)敏性皮膚病中，持續(xù)性的接觸屋塵螨與疾病的加重有關(guān)[7]。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)屋塵螨的提取物通過(guò)活化PAR2，可導(dǎo)致呼吸道黏膜下腺體的分泌增加，并可引起肺的感覺(jué)神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣離子內(nèi)流增加[8]，由此可見(jiàn)屋塵螨可以通過(guò)與PAR2的作用參與疾病的發(fā)生。

蛋白酶激活受體（PARs）屬于與G蛋白偶聯(lián)受體家族，這個(gè)家族有四個(gè)成員：PAR1， PAR2， PAR3和PAR4。PAR2分布于各種組織和細(xì)胞表面，主要包括人皮膚肥大細(xì)胞，上皮細(xì)胞，活化的內(nèi)皮細(xì)胞，肌細(xì)胞，神經(jīng)元和星形細(xì)胞等[5，9]。肥大細(xì)胞又是瘙癢發(fā)病中的關(guān)鍵細(xì)胞之一，其釋放的組胺和類(lèi)胰蛋白酶都是重要的致瘙癢的介質(zhì)，其中以類(lèi)胰蛋白酶的含量為最大，約占肥大細(xì)胞分泌顆粒中蛋白質(zhì)總量的1/2。由此可見(jiàn)，肥大細(xì)胞表面存在PAR2受體，而屋塵螨可以通過(guò)與PAR2的作用參與疾病的發(fā)生，因此我們推測(cè)，屋塵螨可以通過(guò)活化肥大細(xì)胞表面的PAR2受體進(jìn)一步引起類(lèi)胰蛋白酶的釋放，從而導(dǎo)致瘙癢的發(fā)生。有效地阻斷這一環(huán)節(jié)可能是治療慢性瘙癢尤其是對(duì)抗組胺藥效果不佳的瘙癢的潛在靶點(diǎn)，因此我們針對(duì)屋塵螨變應(yīng)原-PAR2信號(hào)通路-肥大細(xì)胞-類(lèi)胰蛋白酶途徑進(jìn)行研究，以期闡明這一途徑的分子機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)研究通過(guò)流式細(xì)胞檢測(cè)法證實(shí)HMC-1細(xì)胞表面PAR2受體的存在。屋塵螨變應(yīng)原Derp1單獨(dú)作用于HMC-1細(xì)胞可明顯引起HMC-1細(xì)胞脫顆粒釋放類(lèi)胰蛋白酶，其水平明顯高于PAR2活化劑、PAR2對(duì)照肽及正常對(duì)照，表明屋塵螨變應(yīng)原Derp1是人肥大細(xì)胞HMC-1活化的重要刺激物。而將屋塵螨變應(yīng)原Derp1與PAR2拮抗劑FSLLRY共同作用于HMC-1細(xì)胞時(shí)，可部分抑制HMC-1細(xì)胞脫顆粒引起的類(lèi)胰蛋白酶的釋放。PAR2激活的一個(gè)重要特征在于誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣流釋放，本研究通過(guò)檢測(cè)HMC-1細(xì)胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度的變化，發(fā)現(xiàn)Derp1及類(lèi)胰蛋白酶可明顯引起HMC-1細(xì)胞內(nèi)鈣流釋放，這一作用可部分被PAR2拮抗劑FSLLRY所拮抗。因此，我們認(rèn)為屋塵螨變應(yīng)原Derp1可以通過(guò)激活人肥大細(xì)胞HMC-1表面PAR2受體引起肥大細(xì)胞脫顆粒釋放類(lèi)胰蛋白酶，但這并不是唯一途徑。

慢性瘙癢性皮膚病的治療一直是臨床的難題，由于其發(fā)生機(jī)制并未完全明確，因此蛋白酶抑制劑、PAR2拮抗劑等理論上可以抑制瘙癢的藥物均尚未應(yīng)用于臨床治療，對(duì)其的研究多僅停留在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段。對(duì)于我們課題中這些問(wèn)題的解答將有助于明確慢性瘙癢的新靶點(diǎn)，也有助于明確屋塵螨變應(yīng)原-PAR2信號(hào)通路-肥大細(xì)胞-類(lèi)胰蛋白酶這一途徑在慢性瘙癢中所發(fā)揮的作用及其分子機(jī)制，從而為臨床新的治療提供切實(shí)的理論基礎(chǔ)，為真正解決臨床實(shí)際問(wèn)題提供幫助。

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