劉儒彪,胡驍飛,張改平,3,王　慧,王方雨,劉　璐,劉　璽,鄧瑞廣,宋照軍

(1.河南科技學(xué)院 食品學(xué)院，河南 新鄉(xiāng)　453003;2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 鄭州　450002;3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院,河南 鄭州　450002)

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沙拉沙星單克隆抗體制備及鑒定

劉儒彪1,胡驍飛2,張改平2,3,王慧1,王方雨2,劉璐1,劉璽1,鄧瑞廣2,宋照軍1

(1.河南科技學(xué)院 食品學(xué)院，河南 新鄉(xiāng)453003;2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 鄭州450002;3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院,河南 鄭州450002)

摘要：為制備敏感性好、親和力高、特異性強(qiáng)的抗沙拉沙星(Sarafloxacin,SARA)單克隆抗體,采用碳二亞胺法合成SARA人工抗原,通過免疫BALB/c小鼠,選擇血清效價(jià)高且敏感性好的小鼠,采用雜交瘤細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞融合,篩選分泌抗SARA單克隆抗體(Monoclonal antibody,mAb)的雜交瘤細(xì)胞株;采用體內(nèi)誘生腹水法制備SARA mAb,通過間接ELISA和間接競爭ELISA對SARA mAb的免疫學(xué)特性進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明:小鼠經(jīng)免疫原免疫后,小鼠多抗血清效價(jià)均達(dá)到1∶128 000。選擇敏感性較好的2號小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合,經(jīng)多次亞克隆后,篩選出1G3、3H3兩株雜交瘤細(xì)胞株,其中1G3所產(chǎn)SARA mAb效價(jià)較高,為1∶512 000,IC50為6.34 ng/mL,親和常數(shù)為8.55×108 L/mol,與諾氟沙星的交叉反應(yīng)率為1.06%,與其他藥物交叉反應(yīng)率均低于0.50%。

關(guān)鍵詞：沙拉沙星;單克隆抗體;雜交瘤細(xì)胞;免疫學(xué)特性

沙拉沙星(Sarafloxacin,SARA)又稱6-氟-1-(4-氟苯基)-1,4-二氫-4-氧代-7-(1-哌嗪基)-3-喹啉羧酸,是氟喹諾酮類藥物的一種,屬于第3代喹諾酮類藥物,于1995年上市并得到應(yīng)用,同時(shí)也是美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and drug administration,FDA)批準(zhǔn)用于食用動(dòng)物的第一個(gè)氟喹諾酮類藥物[1-2]。由于其具有良好的殺菌效果,且價(jià)格低廉而被廣泛應(yīng)用，主要用于治療家禽、水產(chǎn)、畜牧等養(yǎng)殖業(yè)中，由敏感細(xì)菌引起的泌尿系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等感染疾病以及霉形體病[3-5]。

雖然SARA被廣泛用于動(dòng)物疾病的治療,但其在食品動(dòng)物中的殘留,會(huì)經(jīng)過人食用動(dòng)物組織后轉(zhuǎn)移到人體內(nèi)并在人體內(nèi)蓄積,從而增加人體內(nèi)的病原體對氟喹諾酮類藥物的耐藥性,以致人在生病時(shí)服用氟喹諾酮類藥物會(huì)降低其藥性,從而影響該類藥物的臨床療效[6-7]。2002年,我國農(nóng)業(yè)部第235號公告《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》中對SARA在動(dòng)物性食品中的殘留作了明確限量要求,規(guī)定其在雞肌肉、脂肪、肝、腎中的最高殘留限量分別為10，20，80，80 μg/kg,在魚肌肉和皮中的最高殘留限量均為30 μg/kg。目前,對于SARA的殘留檢測方法,主要為高效液相色譜法以及液相色譜與質(zhì)譜串聯(lián)的檢測方法[8-11]。盡管這些檢測方法的精確度和靈敏度都很高,但是由于其設(shè)備昂貴且體積大,樣品處理繁瑣費(fèi)時(shí)、成本高且技術(shù)復(fù)雜,只能限于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)檢測,無法滿足現(xiàn)場大批量快速檢測需求。免疫學(xué)檢測方法具有檢測速度快、敏感且一次能檢測大量樣品的特點(diǎn),能實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測,且成本較低,能夠彌補(bǔ)儀器檢測的不足并已廣泛應(yīng)用于食品中抗生素殘留的檢測[12-15]。本研究通過雜交瘤細(xì)胞技術(shù)制備親和力高、強(qiáng)特異、強(qiáng)抗SARA的單克隆抗體,建立SARA免疫學(xué)快速檢測方法。

1材料和方法

1.1試劑與溶液

SARA、諾氟沙星(Norfloxacin)、環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin)、甲硝唑(Metronidazole)、土霉素(Oxytetracycline)、四環(huán)素(Tetracycline)、金霉素(Aureomycin)、新霉素(Neomycin)標(biāo)準(zhǔn)品以及3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、弗氏完全佐劑(FCA)、弗氏不完全佐劑(FIA)、鼠源單克隆抗體亞型鑒定試劑、牛血清白蛋白(BSA)、雞卵清蛋白(OVA),均購自美國Sigma公司;司帕沙星(Sparfloxacin)標(biāo)準(zhǔn)品,購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS),購自美國Pierce Biotechnology公司;羊抗兔酶標(biāo)二抗(GaMIgG-HRP),購自美國Abbkine公司;細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI-1640、HAT、HT和PEG-1500,購自美國Gibco公司;其他試劑均為分析純;試驗(yàn)用水為超純水;包被液(CBS,0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液)、封閉液(豬血清含量為5%的PBST溶液)、顯色液(TMB磷酸-檸檬酸緩沖液)、終止液(濃度為2 mol/L的H2SO4溶液)、0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS),均為動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室配制。

1.2儀器與設(shè)備

恒溫恒濕試驗(yàn)箱,購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司;高速冷凍離心機(jī),購自美國Thermo Scientific公司;iMark 450/550酶標(biāo)儀,購自美國Bio-Rad公司;HI9321 pH計(jì),購自美國Hanna公司;One DropTMOD-1000+分光光度計(jì),購自美國NanoDrop公司;渦旋振蕩器、控溫磁力攪拌器,購自德國IKA公司;AE260電子天平,購自德國Mettler公司;超凈工作臺,購自美國Forma Scientific公司;倒置顯微鏡,購自德國Leica公司;CO2培養(yǎng)箱,購自美國Precision公司。

1.3供試動(dòng)物與瘤細(xì)胞

供試動(dòng)物為SPF級8周齡雌性BALB/c小鼠,由動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室繁殖飼養(yǎng)。瘤細(xì)胞為小鼠骨髓瘤細(xì)胞系NS0,由動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.4人工抗原合成及多抗血清鑒定

參照文獻(xiàn)[16-17]報(bào)道的方法,采用碳二亞胺(EDC)法制備免疫抗原SARA-BSA和包被抗原SARA-OVA,制備路線見圖1。以20 μg/只的劑量背部皮下多點(diǎn)注射免疫SPF級BALB/c小鼠,免疫4次(每次免疫間隔時(shí)間為3周),第4次免疫30 d后對小鼠進(jìn)行斷尾采血,ELISA測定小鼠多抗血清效價(jià)和敏感性,篩選效價(jià)高和敏感性好的小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合。

圖1　SARA人工抗原制備路線

1.5雜交瘤細(xì)胞株的建立

NS0骨髓瘤細(xì)胞與BALB/c小鼠脾細(xì)胞在PEG1500的作用下融合,將細(xì)胞懸液置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),7 d后用HT培養(yǎng)基置換半量細(xì)胞液,12～14 d后觀察細(xì)胞生長情況,并抽取細(xì)胞上清液,ELISA測定其效價(jià)和敏感性,篩選各項(xiàng)指標(biāo)均較高的細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋克隆化(部分凍存?zhèn)溆?,直至所有克隆鑒定結(jié)果一致。

1.6SARA mAb的大量制備

采用體內(nèi)誘生腹水法制備SARA mAb,取3只8周齡BALB/c小鼠,腹腔注射液體石蠟0.5 mL/只,10 d后將亞克隆后擴(kuò)大培養(yǎng)的細(xì)胞以2×106～5×106個(gè)/只注入小鼠腹腔。待小鼠腹部腫瘤明顯腫大時(shí)即可采集腹水,3 000 r/min離心15 min,除去細(xì)胞及雜質(zhì)沉淀,上清用飽和硫酸銨鹽析法純化得到SARA mAb。

1.7SARA mAb的免疫學(xué)特性鑒定

用間接ELISA測定SARA mAb效價(jià),用間接競爭ELISA測定SARA mAb對SARA的抑制率,橫坐標(biāo)為SARA標(biāo)準(zhǔn)液各質(zhì)量濃度的對數(shù)值,縱坐標(biāo)為抑制率(B/B0)(B為SARA標(biāo)準(zhǔn)液各質(zhì)量濃度的OD450值,B0是SARA標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度為0時(shí)的OD450值),繪制標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線,進(jìn)行回歸分析,計(jì)算SARA mAb對SARA的半數(shù)抑制濃度(IC50),并以此來衡量SARA mAb的敏感性[18-21],IC50越小,說明其敏感性越強(qiáng)。

采用間接ELISA對SARA mAb的亞型進(jìn)行鑒定。具體步驟按照鼠源單克隆抗體亞型鑒定試劑的說明書進(jìn)行操作。參照Beatty等[22]所述的方法測定SARA mAb的親和常數(shù)Ka。親和常數(shù)計(jì)算公式Ka=(n-1)/2(n[Ab′]t-[Ab]t)(其中n=[Ag]t/[Ag′]t,[Ag]t、[Ag′]t分別為2個(gè)不同的包被原濃度,[Ab]t、[Ab′]t分別為各包被原濃度下50%OD值時(shí)所對應(yīng)的SARA mAb濃度)。

以SARA的同類藥物諾氟沙星、環(huán)丙沙星、司帕沙星,以及新霉素、四環(huán)素、金霉素、土霉素、甲硝唑等其他藥物作為競爭物,測定SARA mAb對其競爭物的IC50,計(jì)算其交叉反應(yīng)率(Cross reactivity,CR),并以交叉反應(yīng)率的大小來判定SARA mAb的特異性,交叉反應(yīng)率越高,其特異性越低。

2結(jié)果與分析

2.1多抗血清效價(jià)測定

由ELISA檢測結(jié)果可知,被免疫的6只小鼠獲得了較好的免疫效果,小鼠多抗血清效價(jià)均在1∶128 000以上(圖2),2號小鼠多抗血清效價(jià)最高,達(dá)到了1∶25 600。

圖2　小鼠多抗血清效價(jià)

2.2抗SARA單克隆抗體(SARA mAb)雜交瘤細(xì)胞株的建立

選擇2號小鼠進(jìn)行融合,通過間接ELISA檢測融合的6塊細(xì)胞培養(yǎng)板中有189個(gè)陽性孔,陽性率為32.8%。選取其中6孔強(qiáng)陽性進(jìn)行多次亞克隆,通過間接競爭ELISA測定IC50,最終篩選出2株效價(jià)高、敏感性強(qiáng)的雜交瘤細(xì)胞,分別命名為1G3和3H3,經(jīng)過多次凍存與復(fù)蘇后,仍能夠穩(wěn)定分泌抗體。

2.3SARA mAb免疫特性的鑒定

2.3.1效價(jià)測定雜交瘤細(xì)胞上清和腹水效價(jià)測定結(jié)果見表1。2株雜交瘤細(xì)胞分泌的SARA mAb均具有較高的效價(jià),采用體內(nèi)誘生腹水法制備SARA mAb,經(jīng)檢測1G3株效價(jià)較高,可以達(dá)到1∶512 000。

表1　SARA mAb效價(jià)測定

2.3.2敏感性鑒定間接競爭ELISA測定2株細(xì)胞產(chǎn)生的SARA mAb抑制效價(jià),其中1G3株產(chǎn)生SARA mAb抑制效果較好,標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示,線性回歸方程為y=-0.446 8x+0.858 3,R2=0.991 1,IC50為6.34 ng/mL,表明SARA mAb對SARA具有很強(qiáng)的敏感性。

2.3.3亞型鑒定 通過鼠源單克隆抗體亞型檢測試劑鑒定,2株雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)SARA mAb的亞型均為IgG1型。

2.3.4親和常數(shù)測定 間接ELISA測定不同包被濃度下SARA mAb的親和常數(shù)曲線(圖4),以曲線上部接近水平線段的OD值為100%,計(jì)算出50%OD值對應(yīng)的SARA mAb濃度,經(jīng)計(jì)算,親和常數(shù)Ka=8.55×108L/mol。本試驗(yàn)采用Beatty飽和法測定Ka,該方法簡便易行,不需復(fù)雜的技術(shù)和設(shè)備。根據(jù)Goding[23]的結(jié)論,高親和力抗體的親和常數(shù)通常為107～1012L/mol,所以本試驗(yàn)制備的SARA mAb親和力較高,適用于免疫學(xué)檢測方法的建立。

圖3　SARA mAb間接競爭ELISA抑制曲線

圖4　親和常數(shù)測定曲線

2.3.5特異性鑒定間接競爭ELISA對SARA mAb特異性的鑒定結(jié)果如表2所示,SARA mAb與諾氟沙星交叉反應(yīng)率為1.06%,SARA mAb與其他競爭物的IC50均大于1.5×103,交叉反應(yīng)率均小于0.5%。說明SARA mAb對SARA特異性好,交叉反應(yīng)率低。

表2　交叉反應(yīng)率測定

3結(jié)論與討論

在細(xì)胞融合過程中,融合劑的選擇很重要,正常情況下細(xì)胞融合效果與PEG的分子質(zhì)量及其濃度呈正比,但PEG的分子質(zhì)量越大、濃度越高,對細(xì)胞的毒性越大。另外,PEG的pH值和滴加PEG的速度也會(huì)對細(xì)胞融合產(chǎn)生影響[24]。本研究采用PEG1500作為融合劑,pH值在8.0～8.2,滴加1 mL PEG,時(shí)間為1 min(前15 s加入0.3 mL,30 s加入0.4 mL PEG,后15 s 加入0.3 mL PEG)。反應(yīng)1.5 min后向離心瓶加入15 mL預(yù)熱的GNK溶液進(jìn)行終止反應(yīng),(加入時(shí)間分別為1 mL/30 s、3 mL/30 s、11 mL/30 s),細(xì)胞融合效果最佳。

脾細(xì)胞與瘤細(xì)胞的融合是一個(gè)隨機(jī)結(jié)合過程,融合后的細(xì)胞可能會(huì)以多種形態(tài)存在,需將非目的融合細(xì)胞的細(xì)胞除去。HAT選擇性培養(yǎng)基是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上加入氨基蝶呤、次黃嘌呤、胸腺嘧啶核苷等,其中氨基蝶呤能阻止細(xì)胞DNA的合成,且瘤細(xì)胞本身又不能進(jìn)行自身繁殖。因此,在HAT選擇性培養(yǎng)基上進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí),只有脾細(xì)胞與瘤細(xì)胞融合后的細(xì)胞才能正常存活,即目的融合細(xì)胞。采用有限稀釋法對篩選出的目的融合細(xì)胞進(jìn)行亞克隆,間接ELISA和間接競爭ELISA鑒定抗體,多次亞克隆至篩選出能穩(wěn)定分泌效價(jià)高、特異性好的抗體的雜交瘤細(xì)胞株[25]。

本研究利用已獲得免疫反應(yīng)的小鼠,通過雜交瘤細(xì)胞融合技術(shù)篩選出了2株敏感性高、特異性強(qiáng)的雜交瘤細(xì)胞株,采用體內(nèi)誘生法制備腹水,經(jīng)純化、鑒定后,獲得了效價(jià)高、敏感性好、親和力高、特異性好的SARA mAb,可用于SARA殘留免疫分析方法的建立和SARA殘留檢測產(chǎn)品的開發(fā)。

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Preparation and Identification of Monoclonal Antibody for Sarafloxacin

LIU Rubiao1,HU Xiaofei2,ZHANG Gaiping2,3,WANG Hui1,WANG Fangyu2,LIU Lu1,LIU Xi1,DENG Ruiguang2,SONG Zhaojun1

(1.College of Food Science and Technology,Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang453003,China;2.Henan Key Laboratory of Animal Immunology,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou450002,China;3.College of Animal Science and Veterinary Medicine,Henan Agricultural University,Zhengzhou450002,China)

Abstract：In order to preparation of sarafloxacin(SARA)monoclonal antibody with good sensitivity,high affinity and strong specificity,synthesized SARA artificial antigen by carbodiimide method.It was used to immunize BALB/c mice.The mice which possessed high serum titer and good sensitivity were selected for cell fusing through cell hybridoma technique.Then to filtrate the hybridoma cell strain which secreted SARA monoclonal antibody(mAb).Prepared SARA mAb by inducing ascites in vivo,and identificated the immunity characteristics of SARA mAb via indirect ELISA and indirect competitive ELISA.The result indicated that after mice were immune by immunogen,their serum antibody titer were all up to 1∶128 000.Number 2 mouse with good sensitivity was chosen for cell fusion.After multiple sub cloning,1G3 and 3H3 hybridoma cell strain were filtered.The titer of SARA mAb from 1G3 was 1∶512 000,IC50was 6.34 ng/mL,affinity constant was 8.55×108 L/mol,cross-reactivity with norfloxacin was 1.06%,cross-reactivity with other drugs were below 0.50%,higher than that of 3H3.

Key words:Sarafloxacin;Monoclonal antibody;Hybridoma cell;Immunological characteristics

doi:10.7668/hbnxb.2016.02.015

中圖分類號：S859.84

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-7091(2016)02-0087-05

作者簡介：劉儒彪(1987-),男,河南商丘人,在讀碩士,主要從事農(nóng)產(chǎn)品深加工技術(shù)研究。通訊作者：宋照軍(1973-),男,河南新鄉(xiāng)人,副教授,主要從事肉品加工與質(zhì)量安全控制研究。鄧瑞廣(1960-),男,河南平頂山人,研究員,碩士,主要從事動(dòng)物疫病及食品安全免疫學(xué)檢測技術(shù)研究。

基金項(xiàng)目：2015年河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目(152102310094);河南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃項(xiàng)目(13IRTSTHN006)

收稿日期：2016-02-26