呂　瀟,王聿雙,張曉倩,劉海學

(天津農(nóng)學院 農(nóng)學與資源環(huán)境學院,天津　300384)

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不同濃度鉛脅迫對向日葵幼苗蛋白質(zhì)結(jié)構和表達的影響

呂瀟,王聿雙,張曉倩,劉海學

(天津農(nóng)學院 農(nóng)學與資源環(huán)境學院,天津300384)

摘要：為揭示向日葵抗鉛脅迫的分子機理,采用傅立葉紅外光譜分析法和雙向電泳法探討向日葵試材HA89的幼苗在不同濃度(0,400,800 mg/L)鉛脅迫條件下蛋白質(zhì)水平發(fā)生的變化。結(jié)果表明:向日葵幼苗根、莖、葉的蛋白質(zhì)二級結(jié)構中的β-折疊結(jié)構和無規(guī)則卷曲結(jié)構對鉛脅迫最為敏感,同時,根據(jù)1 655 cm-1/1 637 cm-1比值可看出向日葵幼苗蛋白在鉛脅迫濃度為400 mg/L時蛋白質(zhì)二級結(jié)構較為穩(wěn)定,超過這一濃度到800 mg/L時,蛋白二級結(jié)構則趨于松散;試驗采用Tris酚提取法提取試驗材料全蛋白,經(jīng)雙向電泳分析后發(fā)現(xiàn)差異蛋白點9個。經(jīng)雙向電泳分析后匹配完全相同蛋白點數(shù)65對,差異倍數(shù)為2倍以上的9個,根據(jù)蛋白點的等電點和分子量對照蛋白庫對比后,推測變化較為顯著的蛋白是與感應有關的激酶。

關鍵詞：向日葵幼苗;鉛脅迫;傅立葉紅外光譜;SDS-PAGE電泳;雙向電泳

重金屬污染系環(huán)境污染的類型之一,其污染源能夠引起植物在生長過程中出現(xiàn)一系列問題,如減少生物產(chǎn)量,誘發(fā)植物疾病,以及一些形態(tài)上和生理上的改變[1]。植物體本身含有金屬離子,除了從根部攝取或者遷移到根部的金屬離子,還有一些存在于植物的細胞壁中,這些金屬離子屬于植物礦質(zhì)營養(yǎng),是植株生長發(fā)育的基本條件。然而,近些年來由于人類過度開發(fā)(如工業(yè)、采礦業(yè)等),造成環(huán)境中的無機元素迅速增長,從而出現(xiàn)了重金屬污染這一嚴重問題,影響到植株生長發(fā)育。鉛(Pb)是重金屬元素中較為常見的種類之一,鉛元素容易被植物吸收,滯留時間長而且較為穩(wěn)定[2]。向日葵(HelianthusannuusL.)作為世界第五大油料作物,在正常生長情況下可以在其根部和芽部累積高含量的金屬離子,同時,向日葵的自我修復能力很強,還可將土壤中過多的金屬離子遷移或回收再利用[3],但過多的鉛離子會造成向日葵出現(xiàn)缺水、萎蔫等代謝負擔過重癥狀。另外,向日葵在受到鉛脅迫時也會產(chǎn)生一些抵御機制,這種抵御機制可以使向日葵在一定濃度的鉛脅迫下正常生長。蛋白質(zhì)是較為敏感的結(jié)構,植物在生長期間的蛋白質(zhì)組會發(fā)生變化,已經(jīng)有人對這方面進行研究[4]。在不同逆境條件下(干旱、鹽脅迫、重金屬脅迫等),蛋白質(zhì)組也會發(fā)生變化,如肖清鐵等[5]對鎘脅迫后水稻葉片的蛋白質(zhì)組進行研究,檢測到差異表達蛋白點31個,并且利用MALDI-TOF/MS分析鑒定差異蛋白。Jerusa等[6]對多種重金屬脅迫后的向日葵葉片蛋白質(zhì)組學進行研究,發(fā)現(xiàn)23個差異顯著蛋白點,12個被成功鑒定,其中6種蛋白以前在向日葵蛋白庫中未發(fā)現(xiàn),而2種蛋白在蛋白庫里表現(xiàn)為新序列。

紅外光譜是一種用來檢測高分子化合物等物質(zhì)結(jié)構的儀器,尤其是本試驗采用的傅立葉紅外光譜儀更是以靈敏度高、檢測數(shù)值準確、高效快速等優(yōu)點而廣泛應用于蛋白結(jié)構解析方面的研究。關于傅立葉紅外光譜法檢測蛋白結(jié)構方面,已經(jīng)有不少研究予以應用,趙昕等[7]采用傅立葉紅外光譜法對NaCl脅迫后的鹽芥和擬南芥的蛋白結(jié)構的變化進行了研究,發(fā)現(xiàn)在高濃度鹽脅迫下鹽芥的蛋白質(zhì)結(jié)構較擬南芥的蛋白結(jié)構更為穩(wěn)定[7];另外,胡瑞省等[8]用紅外光譜法對不同溫度下的酵母蛋白二級結(jié)構進行分析,進一步證明酵母蛋白中的β-折疊結(jié)構熱不穩(wěn)定性。

蛋白結(jié)構的變化導致其功能也隨之改變，這種調(diào)節(jié)方式是蛋白質(zhì)中普遍存在的功能調(diào)節(jié)方式。所以，任何導致蛋白質(zhì)分子結(jié)構細微變化，都將導致該蛋白質(zhì)的生理功能發(fā)生相應的改變[9]。本試驗結(jié)合紅外光譜法和雙向電泳法對鉛脅迫下的向日葵幼苗蛋白質(zhì)進行研究，從向日葵幼苗的蛋白二級結(jié)構變化到蛋白質(zhì)表達及功能上的變化，可充分得出向日葵幼苗在響應鉛脅迫后產(chǎn)生的分子機理。雙向電泳是研究蛋白質(zhì)組的主要技術之一,在目前蛋白質(zhì)組學研究中,多采用雙向電泳技術用于分析蛋白的混合物,或者對經(jīng)過特殊處理后的組織、細胞發(fā)生的變化進行研究。本試驗結(jié)合這2種技術來分析鉛脅迫處理后的向日葵蛋白質(zhì)組發(fā)生的變化,旨在為進一步研究向日葵抗逆境脅迫的分子生理機制及向日葵蛋白質(zhì)組學奠定可靠基礎。

1材料和方法

1.1試驗材料

試驗采用的向日葵品種為HA89,由天津農(nóng)學院農(nóng)業(yè)分析實驗教學示范中心提供。

1.2試驗方法

1.2.1植株培養(yǎng)將向日葵種子培養(yǎng)在20 cm×20 cm的發(fā)芽盒中,每盒放入40粒種子,發(fā)芽前用純水浸泡8 h進行催芽,然后采用3種不同方式進行處理,第1種是對照處理即只澆水,第2，3種處理分別澆含Pb+濃度400,800 mg/L的溶液,所有處理每天澆3 mL溶液,每種處理3次重復。所有向日葵種子的發(fā)芽和生長都在環(huán)境溫度約25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每天日照8 h。1.2.2向日葵幼苗傅立葉紅外光譜采集試驗采用IR200傅立葉紅外光譜儀對不同濃度鉛脅迫下30 d的向日葵幼苗進行紅外光譜采集,分別檢測鉛脅迫濃度為0,400,800 mg/L的向日葵幼苗及其根、莖、葉3個部分的蛋白二級結(jié)構變化。為避免植株中水分對紅外光譜的干擾,采集前用60 ℃烘箱將樣品烘干約10 h,每種樣品測3次重復,掃描次數(shù)累積為27次。由于蛋白為聚酰胺化合物,所以檢測蛋白結(jié)構變化主要包括3段酰胺區(qū)的吸收峰值,分別為:酰胺Ⅰ區(qū)為1 600～1 700 cm-1,酰胺Ⅱ區(qū)為1 600～1 500 cm-1,酰胺Ⅲ區(qū)為1 300～1 200 cm-1[10]。其中酰胺Ⅰ區(qū)對蛋白二級結(jié)構的特征峰值最為敏感,所以本試驗主要研究蛋白在酰胺Ⅰ區(qū)的變化特點,基本可以反映出鉛脅迫后向日葵幼苗的蛋白結(jié)構變化[11]。

1.2.3蛋白樣品制備參照盧丞文等[12]的Tris飽和酚提取法提取試驗材料全蛋白。

1.2.4蛋白定量參照張云貴等[13]的生物化學實驗指導中Bradford定量法,測定3次取平均值。1.2.5雙向電泳采用pH值3～10,長度為11 cm的IPG膠條,一向IEF聚焦時間約6.5 h,上樣量2 mg左右,水化12 h,最高電壓6 000 V;第二向電泳采用濃度為12.5%,厚度為1 mm的聚丙烯酰胺凝膠,電泳設30 mA/100 V,時間約4 h,考馬斯亮藍G-250染色約10 h后用去離子水脫色,直到背景透明。

2結(jié)果與分析

2.1不同濃度鉛脅迫下向日葵幼苗的全蛋白二級結(jié)構變化

試驗采用Origin Pro 9.0程序?qū)悠吩技t外光譜圖進行Gaussian方程擬合處理,確定樣品在酰胺I區(qū)主要可分成1 637,1 646,1 655,1 664 cm-1幾個主要波峰,分別相當于蛋白二級結(jié)構中的β-折疊、無規(guī)則卷曲、α螺旋和β轉(zhuǎn)角結(jié)構(圖1)。

圖1　原始紅外光譜圖在Origin Pro 9.0軟件上經(jīng)

鉛脅迫后向日葵幼苗蛋白二級結(jié)構組成變化的4個波峰構成見圖2-A、B、C,由圖2看出,植株的根莖葉之間變化不大,但能明顯看出同一處理下根在1 637 cm-1波數(shù)下的子峰占總面積比值最高,說明同一處理中根部含有α-螺旋的數(shù)量較莖、葉多;隨著鉛脅迫濃度增加,所有根部的蛋白二級結(jié)構變化趨勢相似,但變化的比值有所差異,向日葵幼苗根受400 mg/L鉛脅迫處理后在1 646 cm-1波數(shù)下變化最大,與對照處理的向日葵幼苗根相比增加了67.6%,而脅迫濃度達到800 mg/L的向日葵幼苗根則增加了278.0%,因此,向日葵幼苗根部無規(guī)則卷曲結(jié)構的數(shù)量隨著鉛脅迫濃度的增加而增加;經(jīng)不同濃度鉛脅迫處理的向日葵幼苗莖部和葉部含有的無規(guī)則卷曲結(jié)構的數(shù)量變化也較為明顯,隨著鉛脅迫濃度的增加,向日葵幼苗莖部無規(guī)則卷曲結(jié)構的數(shù)量先下降后上升，與對照莖相比上升了118.0%；而向日葵幼苗葉部的無規(guī)則卷曲結(jié)構的數(shù)量則隨著鉛脅迫濃度增加而增加，與對照葉相比上升了140.9%。因此,向日葵幼苗根、莖、葉的蛋白二級結(jié)構中β-折疊結(jié)構和無規(guī)則卷曲結(jié)構對鉛脅迫最為敏感。

另外,2個主要波峰面積的相對比值能更好地反映蛋白質(zhì)結(jié)構的變化趨勢,所以,采取2個主要波峰面積的相對比值,即通過1 655 cm-1/1 637 cm-1比值的變化來研究受鉛脅迫處理后向日葵幼苗蛋白二級結(jié)構的整體變化,圖3為向日葵幼苗的根、莖、葉分別在不同濃度鉛脅迫下的蛋白二級結(jié)構2個主要波峰面積的相對比值,比值越低,則維持蛋白二級結(jié)構穩(wěn)定性的H鍵數(shù)量越低，說明蛋白結(jié)構越松散；相反，比值越高，則維持蛋白質(zhì)二級結(jié)構穩(wěn)定性的H鍵數(shù)量越高，說明蛋白結(jié)構越穩(wěn)定[14]。由圖3看出,經(jīng)過鉛脅迫處理后向日葵幼苗根部的1 655 cm-1/1 637 cm-1的比值總體呈上升趨勢,而莖和葉部的比值總體呈下降趨勢;而從整個植株的比值來看,對照處理到400 mg/L再到800 mg/L鉛脅迫處理的向日葵幼苗的1 655 cm-1/1 637 cm-1比值則呈先上升后下降的趨勢，說明向日葵幼苗蛋白在鉛脅迫濃度為400 mg/L時蛋白質(zhì)二級結(jié)構較為穩(wěn)定，當鉛脅迫處理濃度達800 mg/L時，蛋白二級結(jié)構趨于松散。

圖2　向日葵幼苗受不同濃度鉛脅迫處理

圖3　向日葵幼苗分別在0,400,800 mg/L鉛溶液

2.2蛋白定量

由于此方法采用紫外分光光度計測定,蛋白樣品中一些試劑(如尿素、Chaps等)會影響結(jié)果,出現(xiàn)誤差,故試驗采取測定3次取平均值的方法,基本可以得到可靠結(jié)果。蛋白濃度如表1所示。從表1可以看出,經(jīng)過不同濃度鉛脅迫處理后,向日葵幼苗的蛋白含量出現(xiàn)變化,總體表現(xiàn)先上升后下降的趨勢,具體變化還要經(jīng)雙向電泳分離蛋白后分析得出結(jié)果。

表1　不同濃度鉛脅迫后向日葵幼苗蛋白定量

2.3不同濃度鉛脅迫對向日葵幼苗蛋白影響的雙向電泳分析

試驗采用ImagemasterTM2D Platinum軟件檢測分析雙向電泳圖譜,半自動檢測蛋白點,即人工對自動檢測的蛋白點校對和剔除。試驗重復3次雙向電泳,經(jīng)軟件分析結(jié)果相似,得到較為可靠的結(jié)果。軟件檢測到對照處理的向日葵幼苗全蛋白雙向電泳圖譜中蛋白點為148個,鉛脅迫400 mg/L的向日葵幼苗蛋白點為135個,鉛脅迫800 mg/L的向日葵幼苗蛋白點為137個;匹配完全相同蛋白點數(shù)65對,差異蛋白點占總蛋白點比率分別為:56%,51.9%,52.6%,差異倍數(shù)為2倍以上的9個。本試驗針對差異倍數(shù)2倍以上的蛋白點進行分析,蛋白點1、2均在圖4-A中有表達,在圖4-B、C中未見表達;蛋白點3、4在圖4-B、C中表達量明顯高于A中的表達量;蛋白點5在圖4-C中表達量明顯低于在A、B中的表達量;蛋白點6在圖4-B、C中的表達量明顯低于在A中的表達量;蛋白點7、8在圖4-C中有表達,在A、B中未見表達。對這些蛋白點的等電點范圍和分子量范圍進行分析,與http://www.arabidopsis.org/蛋白數(shù)據(jù)庫查詢對比蛋白點的基本功能后[15],初步推測部分蛋白點結(jié)果見表2,其中變化最為顯著的蛋白點8推測為與感應蛋白有關的激酶[16]。

A、B、C 分別為鉛脅迫濃度0,400,800 mg/L向日葵幼苗全蛋白的雙向電泳。

蛋白點編號ProteinspotsNo.蛋白描述Proteindescription分子量/kDaMass1核糖體蛋白RibosomalproteinS8(chloroplast)15.6783MGMT家族蛋白MGMTfamilyprotein(Pseudomonassyringaepv.helianthi)12.7346過氧化物酶Peroxidase,partial(Helianthusannuus)10.3377假定葉綠體RF1HypotheticalchloroplastRF1(chloroplast)(Helianthusannuus)20.4588雙組分管理系統(tǒng)(感應蛋白)Two-componentsystemregulatoryprotein(Pseudomonassyringaepv.he-lianthi)21.197

3討論

3.1不同濃度鉛脅迫對向日葵幼苗蛋白二級結(jié)構的影響

本試驗采用傅立葉紅外光譜法檢測了不同濃度鉛脅迫后向日葵幼苗根、莖、葉蛋白二級結(jié)構,試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),向日葵幼苗根、莖、葉的蛋白二級結(jié)構中無規(guī)則卷曲結(jié)構對鉛脅迫最為敏感,變化比率較大;由整個植株的比值可看出,從對照處理到400 mg/L再到800 mg/L鉛脅迫處理的向日葵幼苗的 1 655 cm-1/1 637 cm-1比值總體呈先上升后下降的趨勢,表明一定濃度的鉛脅迫處理可以使向日葵幼苗的H鍵數(shù)增加,蛋白二級結(jié)構更加穩(wěn)定,而鉛脅迫超過一定程度后,向日葵幼苗的蛋白二級結(jié)構由于受損傷程度較為嚴重致使蛋白二級結(jié)構趨于松散。因此,由紅外光譜檢測說明了在濃度為400 mg/L的鉛脅迫以內(nèi)可以使向日葵幼苗的蛋白二級結(jié)構更趨于穩(wěn)定。這一結(jié)果為研究向日葵抵御逆境脅迫提供新途徑。

3.2不同濃度鉛脅迫對向日葵幼苗蛋白表達的影響

本試驗綜合前人經(jīng)驗[16-19],通過對不同濃度鉛脅迫處理的向日葵幼苗全蛋白進行雙向電泳分析,經(jīng)過ImagemasterTM2D Platinum軟件匹配差異蛋白點后,針對其中差異顯著的9個差異蛋白點進行研究。根據(jù)蛋白點的等電點范圍和分子量范圍進行分析,與蛋白數(shù)據(jù)庫查詢對比蛋白點的基本功能后,初步推測出部分蛋白點的結(jié)果,其中變化較為顯著的蛋白點推測為感應蛋白相關的激酶,蛋白激酶是基于環(huán)境條件改變后，生物體受到刺激發(fā)生相應的改變而產(chǎn)生的聯(lián)合機制，主要由感應蛋白和轉(zhuǎn)錄激活蛋白組成，這種蛋白可以使生物體在受到逆境環(huán)境，如干旱、高/低溫、鹽脅迫、重金屬脅迫后，做出相應的保護反應[20]。其他蛋白點還需要進一步深入研究,例如通過質(zhì)譜分析或?qū)Π被嵝蛄蟹治?可以對這些蛋白點的生理生化功能有更加具體的了解。

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Effects of Lead Stress on Structure and Expression of Sunflower Seedlings Proteins

Lü Xiao,WANG Yushuang,ZHANG Xiaoqian,LIU Haixue

(College of Agronomy & Resources and Environment,Tianjin Agricultural University,Tianjin300384,China)

Abstract：In order to explore the molecular mechanism of plumbum tolerance in sunflower,the alterations of sunflower seedlings in protein level under different concentrations of lead stress (0,400,800 mg/L),had been analyzed by FTIR infrared spectrometry and two-dimensional electrophoresis.The results showed that the irregular structurs structure in proteins from the roots,stems,and leaves of sunflower seedlings was significantly sensitive to lead stress compared with other structures.Measurements on the ratio of 1 655 cm-1/1 637 cm-1under lead stress indicated that secondary structures of proteins were relatively stable under 400 mg/L of lead solution,while the structures were loosely organized under 800 mg/L.The total proteins of materials mentioned above were extracted by Tris-phenol extraction method.Then 65 same protein spots were found by two-dimensional electrophoresis analysis in comparison with control treatment,more than 9 spots were differences in two times multiples.According to the protein isoelectric and molecular mass to protein databank,speculated that change is more significant with kinase.

Key words:Sunflower seedlings;Lead stress;FTIR;SDS-PAGE electrophoresis;Two-dimensional electrophoresis

doi:10.7668/hbnxb.2016.02.011

中圖分類號：S565.03

文獻標識碼：A

文章編號：1000-7091(2016)02-0060-05

作者簡介：呂瀟(1988-),女,黑龍江大慶人,在讀碩士,主要從事生物化學與分子生物學研究。通訊作者：劉海學(1965-),男,內(nèi)蒙古通遼人,研究員,博士,主要從事生物化學與分子生物學研究。

基金項目：天津市大型科學儀器協(xié)同開放共享平臺建設項目

收稿日期：2016-02-28