代　欣,張秀麗,胡舉偉,孫廣玉

(東北林業(yè)大學 生命科學學院,黑龍江 哈爾濱　150040)

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過表達和抑制表達2-CysPrx基因煙草的生長、生理特性和葉片光合功能對模擬酸雨的響應

代欣,張秀麗,胡舉偉,孫廣玉

(東北林業(yè)大學 生命科學學院,黑龍江 哈爾濱150040)

摘要：為揭示2-Cys Peroxiredoxins (2-Cys Prx)基因在煙草龍江911抗逆中的功能,以過表達2-Cys Prx基因煙草、抑制表達2-Cys Prx基因煙草和非轉基因煙草幼苗為試材,研究了不同pH值的模擬酸雨對其生長指標、葉片生理生化特性和葉片光合生理的影響。結果表明:與對照相比,pH值4.0的模擬酸雨對3種基因型煙草的株高、葉面積、比葉重無明顯影響,pH值2.5的模擬酸雨處理下,與對照相比,過表達2-Cys Prx基因煙草幼苗的株高無明顯變化,抑制表達2-Cys Prx基因煙草和非轉基因煙草幼苗的株高顯著降低;隨著模擬酸雨pH值降低,3種基因型煙草葉片的硝酸還原酶(NR)活性、可溶性蛋白含量、SOD和APX活性、凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)、蒸騰速率(Tr)、實際光化學效率(ФPSⅡ)、光化學猝滅系數(shù)(qP)、光系統(tǒng)Ⅱ潛在光化學效率(Fv/Fo)和細胞膜穩(wěn)定指數(shù)逐漸下降,非光化學猝滅系數(shù)(qN)和H2O2含量逐漸增加,但在相同pH值的模擬酸雨處理下,過表達2-Cys Prx基因煙草各項生理指標均優(yōu)于抑制表達2-Cys Prx基因煙草和非轉基因煙草幼苗。由此可知,增強2-Cys Prx基因在煙草中的表達可能提高煙草在模擬酸雨處理下的硝態(tài)氮利用能力,并在模擬酸雨處理造成APX活性下降時,清除葉綠體中的H2O2,使光合電子傳遞鏈保持穩(wěn)定,增強煙草葉片的光合能力。

關鍵詞：煙草;2-Cys Prx基因;模擬酸雨;光合功能

隨著工業(yè)的發(fā)展,人類活動排放的SO2和氮氧化物(NOX)日益增多,并在大氣中發(fā)生一系列化學反應轉化為硫酸、硝酸和亞硝酸,溶于水中以雨水、凍雨、雪、雹、露等大氣降水的形式落到地面,形成pH值小于5.6的酸雨[1]。酸雨也稱作酸沉降(Acid deposition),有干沉降和濕沉降2種,通常所說的酸雨屬于濕沉降[2]。酸雨可對植物的正常生長造成不利影響,目前國內外關于酸雨對植物生長和生理活動的影響已有大量報道[3-6]。相關研究結果表明:酸雨脅迫可影響植物的正常生長、光合生理功能和生理代謝活動[7-13]。

植物葉綠體中的Peroxiredoxins(Prxs),即2-Cys Prx,是一類通過其所具有的半胱氨酸殘基(-Cys)清除葉綠體內H2O2的葉綠體蛋白[14-15]。非生物脅迫條件可促進2-CysPrx基因的表達,從而在非生物脅迫導致APX活性下降時,清除葉綠體內的H2O2,降低活性氧對植物光合機構的傷害,增強植物對非生物脅迫的耐受能力[16]。前人的研究指出在干旱和強光脅迫下,轉2-CysPrx基因煙草(Nicotianatabacum)光系統(tǒng)Ⅱ的光化學活性和光合電子傳遞鏈的穩(wěn)定性高于非轉基因煙草,有利于增強煙草對所處逆境的抗性[17-18],而目前關于轉2-CysPrx基因煙草對酸雨脅迫響應的研究尚未見報道。為此,本試驗比較了模擬酸雨脅迫對過表達2-CysPrx基因煙草、抑制表達2-CysPrx煙草和非轉基因煙草生長、生理生化特性和葉片光系統(tǒng)Ⅱ功能影響。旨在為探究2-CysPrx基因的功能提供基礎理論。

1材料和方法

1.1試驗材料

本試驗于2015年7月在東北林業(yè)大學植物生理學實驗室進行。試驗材料為過表達2-CysPrx基因煙草(Nicotianatabacum)幼苗(G)、抑制表達2-CysPrx基因煙草幼苗(Y)和非轉基因煙草幼苗(D)。過表達2-CysPrx基因和抑制表達2-CysPrx基因植株由東北林業(yè)大學植物生理學實驗室通過反轉錄克隆出2-CysPrx基因,分別構建了過表達和抑制表達載體,通過電擊法導入農桿菌LBA4404中,利用農桿菌葉盤法轉化煙草而獲得[19]。對過表達2-CysPrx基因和抑制表達2-CysPrx基因植株進行PCR陽性篩選,確保試驗所用試材為陽性植株。本試驗所用的煙草品種為龍江911。

1.2試驗設計

將生根培養(yǎng)后的煙草植株移栽到高15 cm、直徑12 cm的培養(yǎng)盆中,每盆一株,以草炭土、蛭石(V∶V=2∶1)的混合物作為栽培基質。移栽后在光照強度200 μmol/(m2·s),光周期12 h/12 h(光照/黑暗),溫度25～30 ℃,相對濕度60%左右的人工氣候室中培養(yǎng),并定期澆水。待植株生長至4葉1心時選取長勢一致的煙草植株進行酸雨處理。根據黑龍江省酸雨污染特征以及前人配制酸雨的方法[5,20],試驗中噴淋的酸雨按H2SO4∶HNO3=8∶1(V/V),用98%濃度H2SO4和68%濃度HNO3配制酸雨母液,用蒸餾水對酸雨母液進行稀釋,分別配制成pH值5.6(CK)、pH值4.0(中度)和pH值2.5(重度)3個模擬酸雨梯度。過表達2-CysPrx基因煙草幼苗(G)、抑制表達2-CysPrx基因煙草幼苗(Y)和非轉基因煙草幼苗(D)都分別噴淋3個梯度酸雨,以噴淋pH值5.6酸雨的處理為對照CK,每2 d噴淋一次,每株噴淋量約為200 mL,以葉片滴液為度,共處理20 d。每個處理設置3次重復。

1.3測定項目

用直尺測量煙草植株的株高,采用剪紙稱重法測定煙草植株從頂端往下數(shù)第2片完全展開葉的葉面積。葉綠素和類胡蘿卜素含量采用分光光度法測定[21]。超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定采用NBT還原法[22]?？箟难徇^氧化物酶(APX)活性的測定采用Streeter等[23]方法。按蘇州科銘公司生產的試劑盒說明書測定過氧化氫含量(H2O2)。硝酸還原酶(NR)活性的測定參照孔祥生等[24]方法。可溶性蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍G-250法[25]。采用電導率法測定細胞膜穩(wěn)定性指數(shù)[26]。

試驗于上午9:00-11:00時,采用英國Hansatch公司生產的便攜式脈沖調制熒光儀FMS-2測定從上至下第2片完全展開葉的實際光化學效率(ФPSⅡ)、電子傳遞速率(ETR)、光化學猝滅系數(shù)(qP)和非光化學猝滅系數(shù)(qN),以及葉片暗適應0.5 h后的初始熒光值(Fo)、最大熒光值(Fm)和光系統(tǒng)Ⅱ潛在光化學效率(Fv/Fo)。

利用Li-6400XT便攜式光合儀(美國LI-COR公司生產)的紅藍光源葉室,并控制樣品室CO2濃度為400 μmol/mol,葉室光照強度為400 μmol/(m2·s),葉片溫度控制為28 ℃,相對濕度60%。測定煙草植株從上至下第2片完全展開葉的凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)和蒸騰速率(Tr)[5]。以上各處理測定指標均重復3次。

1.4數(shù)據處理

采用Excel 2003軟件進行數(shù)據處理,采用SPSS軟件的最小顯著差異法(LSD)和多因素方差分析不同處理間的差異。

2結果與分析

2.1模擬酸雨對煙草生長特性、葉綠素含量的影響

由表1可以看出,隨著模擬酸雨pH值的降低,3種基因型煙草的株高、葉面積和比葉重都呈現(xiàn)減小的趨勢。在pH值4.0、pH值2.5處理下,過表達2-CysPrx基因煙草幼苗的株高、葉面積與對照差異不顯著。在pH值2.5處理下,非轉基因煙草、抑制表達2-CysPrx基因煙草的株高分別比對照降低了39.29%,62.74%,達到差異顯著水平,而葉面積與對照差異不顯著。對于過表達2-CysPrx基因煙草和非轉基因煙草,在pH值2.5處理下,比葉重分別比對照降低了13.48%,24.44%,達到差異顯著水平。對于抑制表達2-CysPrx基因煙草,pH值4.0、pH值2.5處理的比葉重與對照差異不顯著。

由表2可知,隨著模擬酸雨pH值的降低,3種基因型煙草葉片的葉綠素含量總體呈現(xiàn)降低的趨勢,在pH值2.5處理下,過表達2-CysPrx基因煙草、抑制表達2-CysPrx基因煙草葉片的總葉綠素含量與對照相比差異不顯著,對于非轉基因煙草,pH值2.5處理的總葉綠素含量比對照降低了31.32%,達到差異顯著水平。除非轉基因煙草在pH值2.5處理下,葉綠素a含量顯著低于對照;在pH值2.5處理下,過表達2-CysPrx基因煙草、抑制表達2-CysPrx基因煙草葉片的葉綠素a、葉綠素b與對照無顯著差異。

表1　模擬酸雨對煙草生長特性的影響

注:表中數(shù)據為均值±標準差。圖中標注的不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。表2、圖1～5同。

Note:Different letters mean significant difference(P<0.05).The same as Tab.2,Fig.1-5.

表2　模擬酸雨對煙草葉綠素含量的影響

2.2模擬酸雨對煙草葉片硝酸還原酶(NR)活性、可溶性蛋白含量的影響

由圖1可知,隨著模擬酸雨pH值的降低,3種基因型煙草葉片的硝酸還原酶活性(NR)、可溶性蛋白含量都呈現(xiàn)降低的趨勢。在pH值2.5處理下,過表達2-CysPrx基因煙草、非轉基因煙草和抑制表達2-CysPrx基因煙草葉片的硝酸還原酶(NR)活性分別比對照降低42.97%,66.14%,45.13%;可溶性蛋白含量分別比對照降低了38.88%,46.15%,57.95%,都達到差異顯著水平。在pH值2.5處理下,3種基因型煙草葉片的硝酸還原酶活性(NR)、可溶性蛋白含量仍呈現(xiàn)為過表達2-CysPrx基因煙草>非轉基因煙草>抑制表達2-CysPrx基因煙草。

圖1　模擬酸雨對煙草葉片硝酸還原酶(NR)活性、可溶性蛋白含量的影響

2.3模擬酸雨對煙草葉片光合特性的影響

由圖2可知,隨著模擬酸雨pH值的降低,3種基因型煙草的凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)、蒸騰速率(Tr)呈現(xiàn)降低的趨勢。在pH值2.5處理下,過表達2-CysPrx基因煙草、非轉基因煙草和抑制表達2-CysPrx基因煙草葉片的凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)和蒸騰速率(Tr)均明顯低于對照,且3種基因型煙草葉片的凈光合速率(Pn)呈現(xiàn)為過表達2-CysPrx基因煙草>非轉基因煙草>抑制表達2-CysPrx基因煙草。而隨著模擬酸雨pH值的降低,3種基因型煙草的胞間CO2濃度(Ci)呈現(xiàn)增加的趨勢,在pH值2.5處理下,過表達2-CysPrx基因的煙草、非轉基因煙草和抑制表達2-CysPrx基因煙草葉片的胞間CO2濃度(Ci)均顯著高于對照。

圖2　模擬酸雨對煙草葉片光合特性的影響

2.4模擬酸雨對煙草葉片葉綠素熒光參數(shù)的影響

由圖3可以看出,隨著模擬酸雨pH值的降低,3種基因型煙草葉片PSⅡ的實際光化學效率(ФPSⅡ)、光化學猝滅系數(shù)(qP)和光系統(tǒng)Ⅱ潛在光化學效率(Fv/Fo)呈現(xiàn)下降趨勢。在pH值2.5處理下,過表達2-CysPrx基因煙草、非轉基因煙草和抑制表達2-CysPrx基因煙草葉片PSⅡ的實際光化學效率(ФPSⅡ)、光化學猝滅系數(shù)(qP)分別比對照降低了29.77%,27.85%,31.83%;26.62%,25.23%,25.23%,均達到差異顯著水平。3種基因型煙草的非光化學猝滅系數(shù)(qN)在pH值4.0、pH值2.5處理下與對照差異不顯著。在pH值2.5處理下,過表達2-CysPrx基因煙草、抑制表達2-CysPrx基因煙草的PSⅡ潛在光化學效率(Fv/Fo)分別比對照降低了18.65%,21.88%,達到差異顯著水平。

圖3　模擬酸雨對煙草葉片葉綠素熒光參數(shù)的影響

2.5模擬酸雨對煙草葉片SOD、APX活性的影響

由圖4可以看出,隨著模擬酸雨pH值的降低,3種基因型煙草葉片的SOD、APX活性逐漸降低。在pH值2.5處理下,過表達2-CysPrx基因煙草、非轉基因煙草和抑制表達2-CysPrx基因煙草葉片的SOD、APX活性分別比對照降低了31.35%,34.99%,71.63%;26.06%,38.59%,33.60%,達到差異顯著水平,且在pH值2.5處理下SOD、APX活性均表現(xiàn)為過表達2-CysPrx基因煙草>非轉基因煙草>抑制表達2-CysPrx基因煙草。

圖4　模擬酸雨對煙草葉片SOD、APX活性的影響

2.6模擬酸雨對煙草葉片H2O2含量和細胞膜穩(wěn)定指數(shù)的影響

由圖5可知,隨著模擬酸雨pH值的降低,3種基因型煙草葉片的H2O2含量逐漸增加,在pH值2.5處理下,過表達2-CysPrx基因煙草、非轉因煙草和抑制表達2-CysPrx基因煙草葉片的H2O2含量分別比對照增加了45.81%,17.11%,15.36%,達到差異顯著水平,且在pH值2.5處理下H2O2含量表現(xiàn)為過表達2-CysPrx基因煙草<非轉基因煙草<抑制表達2-CysPrx基因煙草;而3種基因型煙草葉片的細胞膜穩(wěn)定指數(shù)隨模擬酸雨pH值的降低,逐漸下降,在pH值2.5處理下細胞膜穩(wěn)定指數(shù)表現(xiàn)為過表達2-CysPrx基因煙草>非轉基因煙草>抑制表達2-CysPrx基因煙草,與對照相比均差異不顯著。

圖5　模擬酸雨對煙草葉片H2O2含量和細胞膜穩(wěn)定指數(shù)的影響

3討論

較多研究表明,酸雨對植物生長產生影響的臨界點pH值為2～3[27-28],本試驗研究結果表明:3種基因型煙草的株高、葉面積和比葉重隨模擬酸雨pH值的降低而逐漸降低,在pH值2.5處理下,與對照相比,過表達2-CysPrx基因煙草株高無顯著變化,而抑制表達2-CysPrx基因煙草和非轉基因煙草株高顯著降低,且3種基因型煙草的株高表現(xiàn)為過表達2-CysPrx基因煙草>非轉基因煙草>抑制表達2-CysPrx基因煙草,說明增強2-CysPrx基因在煙草葉片中的表達可減輕酸雨脅迫對煙草生長的影響。葉綠素參與對光能的吸收、傳遞以及轉換,其含量的高低可直接影響植物的光合作用。關于酸雨脅迫對植物葉片葉綠素含量影響的報道較多,張遠兵等[28]研究發(fā)現(xiàn)隨著酸雨pH值的降低,吊竹梅(Zebrinapendula)葉片葉綠素含量逐漸降低;袁遠爽等[29]對白簕(Acanthopanax)的研究則表明,隨著模擬酸雨pH值的降低,白簕葉片葉綠素含量呈先升高后降低趨勢。本試驗研究結果表明,隨著模擬酸雨pH值的降低,3種基因型煙草葉片的葉綠素(葉綠素(a+b))含量總體呈降低趨勢,但降低幅度較小,這與魯美娟等[30]的研究結果相似。這可能是由于煙草葉綠素的代謝對酸雨脅迫不敏感。

酸雨對植物膜系統(tǒng)的損傷必然會引起光合器官的傷害和功能的下降[32-33],西洋杜鵑在酸雨pH值≤3.0時,Pn、Tr和Gs明顯降低,其凈光合速率的下降是由氣孔限制導致的[34]。本試驗研究結果發(fā)現(xiàn),在酸雨處理下,3種基因型煙草隨著酸雨pH降低葉片凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)逐漸降低,胞間CO2濃度(Ci)逐漸增加,這說明煙草凈光合速率(Pn)下降導致氣孔導度(Gs)的降低,酸雨脅迫下凈光合速率的下降是由非氣孔限制引起的。結合酸雨處理下,3種基因型煙草葉片可溶性蛋白含量顯著降低,而核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)是植物葉片中可溶性蛋白的主要組成部分,因此，酸雨處理下核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶含量可能顯著降低,這將直接影響卡爾文循環(huán)中CO2的羧化速率,表現(xiàn)為凈光合速率的下降。由于在相同pH值模擬酸雨處理下,過表達2-CysPrx基因煙草葉片的可溶性蛋白含量均顯著高于抑制表達2-CysPrx基因煙草和非轉基因煙草,這可能是造成過表達2-CysPrx基因煙草葉片凈光合速率在相同pH值模擬酸雨處理下顯著高于非轉基因煙草和抑制表達2-CysPrx基因煙草的原因之一,這同時也說明,增強2-CysPrx基因有利于提高煙草葉片在酸雨脅迫下的光合能力。

葉綠素熒光技術是研究植物對逆境耐受能力的常用技術[35],杉木幼苗在pH值2.5酸雨處理下,qP、Fv/Fo顯著降低,qN顯著增加[36]。本試驗中,隨著模擬酸雨pH值的降低,在3種基因型煙草葉片光系統(tǒng)Ⅱ的ФPSⅡ、qP顯著降低,非轉基因煙草和抑制表達2-CysPrx基因煙草葉片光系統(tǒng)Ⅱ的qN明顯增加,Fv/Fo明顯降低,表明酸雨脅迫可引起煙草葉片PSⅡ的光化學活性降低,PSⅡ捕獲的激發(fā)能用于光化學反應的比例下降,非光化學猝滅耗散掉的激發(fā)能明顯增加,從而導致光合電子傳遞鏈的同化力(ATP和NADPH)產額降低,可用于暗反應的同化力減少,引起暗反應光合碳同化能力降低,表現(xiàn)為凈光合速率的下降。但在不同pH值模擬酸雨處理下,過表達2-CysPrx基因煙草葉片PSⅡ的ФPSⅡ、qP均明顯高于非轉基因煙草和抑制表達2-CysPrx基因煙草,這可能是由于增強2-CysPrx基因在煙草葉片中的表達可減輕模擬酸雨脅迫下葉綠體中的H2O2對PSⅡ光化學活性的抑制,使光合電子傳遞鏈基本保持穩(wěn)定。酸雨對植物產生傷害主要是由于酸雨脅迫下抗氧化酶活性降低,導致活性氧代謝平衡失調,相對過剩的活性氧的膜質過氧化作用增強,造成氧化傷害[4-5]。本試驗研究結果表明:隨著模擬酸雨pH值的降低,3種基因型煙草的細胞膜穩(wěn)定性指數(shù)明顯降低,且在不同pH處理下細胞膜穩(wěn)定指數(shù)均表現(xiàn)為過表達2-CysPrx基因煙草>非轉基因煙草>抑制表達2-CysPrx基因煙草,說明酸雨脅迫下過表達2-CysPrx基因煙草膜質過氧化水平低于非轉基因煙草和抑制表達2-CysPrx基因煙草。同時,3種基因型煙草葉片中SOD、APX活性隨模擬酸雨pH值的降低而下降,對活性氧的清除能力下降,本試驗中3種基因型煙草葉片中的H2O2含量增加也證明了這一點。H2O2的積累量增加可導致膜透性增加,造成葉綠體結構受損,還會破壞D1蛋白上的His殘基從而抑制光合電子傳遞鏈的電子傳遞、降低PSⅡ反應中心的光化學活性、抑制植物的光合作用等[37],但過表達2-CysPrx基因煙草可通過2-CysPrx基因過表達合成2-Cys Prx,在APX活性降低的情況下,清除葉綠體內的H2O2,減輕H2O2對PSⅡ光化學反應的抑制作用。

綜上所述,在pH值2.5酸雨處理下,對3種基因型煙草生長的影響表現(xiàn)為過表達2-CysPrx基因煙草<非轉基因煙草<抑制表達2-CysPrx基因煙草,這可能是由于過表達2-CysPrx基因煙草可在重度酸雨脅迫下,保持相對較高硝態(tài)氮利用能力,有利于植物合成蛋白質,使核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶含量維持在較高水平有利于CO2羧化的進行;同時通過2-CysPrx基因過表達合成的2-Cys Prx清除葉綠體內的H2O2,減輕H2O2對光合機構的破壞,相對增強光合電子傳遞鏈的穩(wěn)定性,從而使過表達2-CysPrx基因煙草的凈光合速率基本保持穩(wěn)定。這也可能是過表達2-CysPrx基因煙草對酸雨抗性優(yōu)于非轉基因煙草、抑制表達2-CysPrx基因煙草的原因。

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Responses of Growth and Physiological Features,Photosynthetic Function in Overexpression and Inhibition of Expression of Transgenic Tobacco Plants with 2-CysPrxto the Simulated Acid Rain

DAI Xin,ZHANG Xiuli,HU Juwei,SUN Guangyu

(College of Life Science,Northeast Forest University,Harbin150040,China)

Abstract：The overexpression and inhibition of expression of transgenic tobacco plant with 2-Cys Prx (Longjiang 911),non transgenic tobacco were chosen to investigate the effects of simulated acid rain on their growth,physiological features and photosynthesis.The results showed that simulated acid rain at pH 4.0 had no significant effects on the plant height,leaf area and specific leaf weight,but at pH 2.5,the plant height of overexpression and inhibition of expression of transgenic tobacco plant with 2-Cys Prx reduced significantly,With the pH value of the simulated acid rain decreased,chlorophyll content,nitrate reductase activity,soluble protein content,superoxide dismutase and ascorbate peroxidase activity,net photosynthetic rate(Pn),stomatal conductance(Gs),transpiration rate(Tr),the actual photochemical efficiency of PSⅡ(ΦPSⅡ),photochemical quenching coefficient(qP),potential photochemical efficiency of PSⅡ(Fv/Fo)and cell membrane stability index decreased,the non-photochemical quenching(qN)and hydrogen peroxide content increased,but at the same pH value,these above-mentioned indexes of overexpression of transgenic tobacco plant with 2-Cys Prx were better than inhibition of expression of transgenic tobacco plant with 2-Cys Prx and non transgenic tobacco plant.The results suggest that enhanced expression of 2-Cys Prx in tobacco plant can promote the capability of tobacco against acid rain,the capability of utilizing nitrate nitrogen,and remove of excess H2O2 while APX activity decreases,and enhance the photosynthetic capability of tobacco.

Key words:Tobacco;2-Cys Prx gene;Simulated acid rain;Photosynthetic function

doi:10.7668/hbnxb.2016.02.010

中圖分類號：S572.01

文獻標識碼：A

文章編號：1000-7091(2016)02-0052-08

作者簡介：代欣(1991-),女,黑龍江建三江人,在讀碩士,主要從事植物生理生態(tài)學研究。通訊作者：孫廣玉(1963-),男,黑龍江巴彥人,教授,博士,主要從事植物生理生態(tài)學研究。

基金項目：哈爾濱市科技創(chuàng)新人才研究專項(2013RFXXJ063)

收稿日期：2016-02-20