陸玉建,吳信明,管　宇,張松林,李樹芳,韓文瑜,沈志強(qiáng)1,

(1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院 博士后科研工作站,山東 濱州　256600;2.吉林大學(xué) 博士后科研流動(dòng)站,吉林 長(zhǎng)春　130062;3.濱州學(xué)院 生命科學(xué)系,山東 濱州　256603;4.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院,山東 濱州　256600;5.鄭州大學(xué) 生命科學(xué)院,河南 鄭州　450001)

?

SPF雞胚St3galⅠ基因的克隆及其在MDCK細(xì)胞中的表達(dá)

陸玉建1,2,3,吳信明4,管宇4,張松林4,李樹芳5,韓文瑜2,沈志強(qiáng)1,4

(1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院 博士后科研工作站,山東 濱州256600;2.吉林大學(xué) 博士后科研流動(dòng)站,吉林 長(zhǎng)春130062;3.濱州學(xué)院 生命科學(xué)系,山東 濱州256603;4.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院,山東 濱州256600;5.鄭州大學(xué) 生命科學(xué)院,河南 鄭州450001)

摘要：為了提高M(jìn)DCK細(xì)胞表面禽流感病毒(AIV)受體的水平,以12日齡的SPF雞胚為試材,通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增唾液酸轉(zhuǎn)移酶Ⅰ基因(St3galⅠ),并將回收的片段插入到pMD18-T載體中。酶切pMD18-T-St3galⅠ和pCI-neo質(zhì)粒,將目的片段進(jìn)行連接,構(gòu)建含有St3galⅠ基因的真核表達(dá)載體。利用脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞,在G418的篩選下,獲得具有抗性的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。通過(guò)細(xì)胞克隆化培養(yǎng)和PCR檢測(cè),篩選可穩(wěn)定表達(dá)St3galⅠ基因的細(xì)胞株。結(jié)果表明,從雞胚中克隆的St3galⅠ基因成功的插入到pCI-neo質(zhì)粒,從而實(shí)現(xiàn)真核表達(dá)載體pCI-neo-St3galⅠ的構(gòu)建。在G418選擇壓力下,初步獲得了穩(wěn)轉(zhuǎn)目的基因的MDCK細(xì)胞系。將抗性細(xì)胞混合克隆進(jìn)行稀釋,經(jīng)選擇后挑選出30個(gè)單克隆抗性細(xì)胞株。分別以轉(zhuǎn)染細(xì)胞基因組DNA和總RNA為模板,經(jīng)PCR檢測(cè)顯示,目的基因已整合入MDCK細(xì)胞的基因組中并可穩(wěn)定的進(jìn)行表達(dá)。

關(guān)鍵詞：唾液酸;St3galⅠ基因;MDCK;轉(zhuǎn)染;G418;PCR

據(jù)統(tǒng)計(jì),每年有3 000～5 000萬(wàn)人感染流感病毒而引起嚴(yán)重的呼吸道疾病,在流感爆發(fā)的季節(jié),則可造成數(shù)百萬(wàn)人死亡[1]。流感病毒屬于正粘病毒科,具有分節(jié)的負(fù)鏈基因組,包括A、B、C3個(gè)屬,其中A型流感病毒可感染人、豬、馬等哺乳類和多種鳥類,在冬季較易發(fā)生[2]。禽流感(Avianinfluenza,AI)是由A型流感病毒引起的一種禽類感染病,自1871年首次在意大利報(bào)道以來(lái),世界各地多次出現(xiàn)AI的暴發(fā)和流行,不但給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,還對(duì)人類公共衛(wèi)生安全構(gòu)成嚴(yán)重的威脅[3-6]。禽流感病毒(Avianinfluenzavirus,AIV)如何感染宿主，相關(guān)的分子機(jī)制還不清楚。目前,人們普遍認(rèn)為AIV顆粒表面的血凝素(Hemagglutinin,HA)和宿主細(xì)胞表面受體起到了關(guān)鍵的作用[7]。HA是流感病毒最主要的糖蛋白,具有凝集紅細(xì)胞的能力和較強(qiáng)的免疫原性,能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體,是流感疫苗研究的首選抗原,它可以識(shí)別靶細(xì)胞受體并與之結(jié)合,是AIV產(chǎn)生致病力和決定宿主特異性的重要蛋白[6,8]。病毒的增殖一般要經(jīng)歷吸附、侵入、增殖、裂解和釋放等過(guò)程,AIV能夠吸附于宿主細(xì)胞,與細(xì)胞表面的唾液酸(Sialicacid,SA)具有密切的關(guān)系[3,9-10]。SA是指一系列含9個(gè)碳原子的羧基化單糖衍生物的總稱,在自然界分布廣泛,為構(gòu)成糖類復(fù)合物結(jié)構(gòu)和功能的重要單位[11-12]。SA常位于細(xì)胞表面糖蛋白、糖脂分子或其他多糖中糖鏈的最外側(cè)加帽位置,攜帶負(fù)電荷,對(duì)于細(xì)胞之間的識(shí)別及細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用有重要影響,可作為流感病毒的受體,流感病毒通過(guò)HA與宿主細(xì)胞SA特異性結(jié)合而感染宿主[13-15]。在唾液酸轉(zhuǎn)移酶(Sialyltransferases,STs)的作用下,SA可轉(zhuǎn)移到細(xì)胞表面的糖脂或糖蛋白末端[11,14-16]。SA常與糖鏈N末端的半乳糖(Galactoside,Gal)以α2,3或α2,6糖苷鍵連接[12,17-18]。流感病毒受體主要有2種:一種為唾液酸α-2,3半乳糖(SAα-2,3Gal);另一種為唾液酸α-2,6半乳糖(SAα-2,6Gal)[11,15]。大多數(shù)AIV優(yōu)先結(jié)合于SAα-2,3Gal受體,人流感病毒則優(yōu)先結(jié)合于SAα-2,6Gal受體[10,19]。生物體內(nèi)的STs分為兩類:介導(dǎo)SA以α2,6糖苷鍵形式連接到Gal上的是ST6Gal轉(zhuǎn)移酶;介導(dǎo)SA以α2,3糖苷鍵形式連接到Gal上的是ST3Gal轉(zhuǎn)移酶,編碼該酶的基因有6種(St3galⅠ～Ⅵ),其中ST3GalⅠ和Ⅱ能使Ⅲ型糖鏈(Galβ1,3GalNAc-R)唾液酸化[18,20]。ST3GalⅠ催化完成AIV α2,3糖苷鍵連接結(jié)構(gòu)的合成,負(fù)責(zé)把胞苷一磷酸-β-N-乙酰神經(jīng)氨酸(CMP-Neu5AC)底物中的SA以α2,3連鍵的方式轉(zhuǎn)移到Galβ1-3(4)GlcNAc糖鏈上,從而形成AIV的完整受體[13,21]。傳統(tǒng)方法制備禽流感疫苗,通常采用雞胚培養(yǎng)法,該方法存在周期過(guò)長(zhǎng),成本較高等諸多不足之處,而以細(xì)胞作為基質(zhì)培養(yǎng)AIV則不存在上述問(wèn)題。但通過(guò)細(xì)胞生產(chǎn)AIV,現(xiàn)階段產(chǎn)率還較低。已有的研究表明,宿主細(xì)胞表面SA的含量與AIV的增殖具有密切的關(guān)系,STs在此過(guò)程中發(fā)揮重要作用。因此,通過(guò)基因工程技術(shù)提高細(xì)胞中STs的含量,對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)法生產(chǎn)AIV疫苗具有重要的意義。本試驗(yàn)以12日齡的SPF雞胚為試材,利用RT-PCR擴(kuò)增St3galⅠ基因,通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞,在G418選擇壓力下,經(jīng)克隆化培養(yǎng)和分子檢測(cè),成功獲得了可穩(wěn)定表達(dá)St3galⅠ基因的細(xì)胞株。試驗(yàn)結(jié)果對(duì)于增加宿主細(xì)胞表面唾液酸化水平,促進(jìn)AIV在細(xì)胞基質(zhì)中的有效增殖具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1材料和方法

1.1試驗(yàn)材料

SPF雞胚和MDCK細(xì)胞由山東綠都生物科技有限公司提供;pMD18-T載體、T4DNA連接酶和限制性內(nèi)切核酸酶購(gòu)自TaKaRa公司;pCI-neo載體和DH5α菌株由山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院保存;反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqDNA聚合酶和DNA Marker3購(gòu)自蘭州鵬程生物公司;質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司;DNA提取試劑盒、RNA提取試劑盒、G418(新霉素)、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 Regeant購(gòu)自Invitrogen公司;胎牛血清(FBS)購(gòu)自GIBCO公司;引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1引物的設(shè)計(jì)根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)雞唾液酸轉(zhuǎn)移酶Ⅰ(ST3Gal Ⅰ)和β-actin基因序列信息,利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5設(shè)計(jì)引物(下劃線為添加的酶切位點(diǎn))。St3galⅠ LP:5′-GGGGAATTC ATGGTCACCGTCAGGAAA-3′(EcoRⅠ),St3galⅠ RP:5′-GGGGTCGACTCATCTGCCCTTGAAAAAT-3′(SalⅠ);β-actinLP:5′-CCTCTATGCCAACACAGT-3′,β-actinRP:5′-GTACTCC TGCTTGCTGAT-3′。

1.2.2目的基因的克隆以12日齡的SPF雞胚為試材,提取RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,用高保真Taq酶擴(kuò)增St3galⅠ基因。PCR反應(yīng)體系如下:5×phusion10μL,10mmol/LdNTP4μL,St3gal Ⅰ LP 2 μL,St3galⅠ RP 2 μL,DMSO 1.5 μL,Template cDNA 2 μL,Nuclease-free water 28 μL,Phusion DNA polymerase 0.5 μL,總體積為50 μL。反應(yīng)程序?yàn)?98 ℃預(yù)變性30 s;98 ℃變性10 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共35個(gè)循環(huán);72 ℃再延伸10 min;4 ℃保存。產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),回收目的片段并與pMD18-T載體進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。通過(guò)菌落PCR鑒定陽(yáng)性克隆。反應(yīng)程序如下:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共35個(gè)循環(huán);72 ℃再延伸10 min。挑取陽(yáng)性克隆,搖菌,提質(zhì)粒,用EcoRⅠ-SalⅠ進(jìn)行酶切鑒定。將含目的片段的質(zhì)粒pMD18-T-St3galⅠ進(jìn)行測(cè)序。1.2.3真核表達(dá)載體的構(gòu)建分別用Sal Ⅰ-EcoRⅠ酶切pMD18-T-St3galⅠ(圖1-A)和pCI-neo質(zhì)粒(圖1-B),將回收的目的片段連接,轉(zhuǎn)化,通過(guò)PCR和酶切篩選陽(yáng)性重組克隆,從而實(shí)現(xiàn)真核表達(dá)載體pCI-neo-St3galⅠ的構(gòu)建(圖1-C)。

圖1　pCI-neo-St3galⅠ載體構(gòu)建策略

1.2.4G418敏感性試驗(yàn)將MDCK 細(xì)胞接種 24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板,待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%左右時(shí)加入含G418的DMEM培養(yǎng)基,使其濃度分別為0,100,300,500,700,900 μg/mL,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每3～5 d更換一次篩選培養(yǎng)基。每日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況,培養(yǎng)2周后繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,確定G418的篩選濃度。

1.2.5MDCK細(xì)胞的轉(zhuǎn)染用無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒,測(cè)定濃度。將MDCK細(xì)胞平鋪到24孔板,第2天細(xì)胞匯合度達(dá)到80%～90%時(shí)轉(zhuǎn)染。用無(wú)血清的DMEM稀釋質(zhì)粒使其濃度達(dá)到2 μg/100 μL。在離心管中混合如下成分。溶液A:稀釋4 μg質(zhì)粒DNA,溶于250 μL無(wú)血清DMEM中,混勻,在室溫下孵育約5 min。溶液B:取10～20 μL Lipofectamine 2000至250 μL無(wú)血清DMEM中,混勻,室溫下靜置約5 min。將溶液A與溶液B混合均勻,室溫孵育約20～25 min,使之形成DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。將此復(fù)合物逐滴加到細(xì)胞表面,補(bǔ)加無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)4～6 h之后,除去培養(yǎng)物,更換含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基。1.2.6細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)稀釋轉(zhuǎn)基因細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度約為50個(gè)/100 μL。取2 μL細(xì)胞懸液加入96孔板,補(bǔ)加含G418的DMEM培養(yǎng)基100 μL。單細(xì)胞經(jīng)10 d培養(yǎng)后可形成克隆群,將細(xì)胞消化后繼續(xù)培養(yǎng),當(dāng)匯合度達(dá)到90%時(shí)接入24孔板擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2.7轉(zhuǎn)染細(xì)胞的分子檢測(cè)采用DNA提取試劑盒提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞的基因組DNA,進(jìn)行PCR鑒定;通過(guò)RNA提取試劑盒提取轉(zhuǎn)基因細(xì)胞總RNA,利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,以雞β-actin基因作為內(nèi)參照,經(jīng)RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中St3galⅠ的表達(dá)情況。

2結(jié)果與分析

2.1真核表達(dá)載體pCI-neo-St3galⅠ的構(gòu)建

提取SPF雞胚總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,用高保真PCR擴(kuò)增St3galⅠ(圖2-A)。回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,連入pMD18-T載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌。菌落PCR鑒定結(jié)果顯示,擴(kuò)增條帶和St3galⅠ基因大小一致(圖2-B)。挑取大腸桿菌陽(yáng)性重組克隆,搖菌,提質(zhì)粒。用EcoRⅠ-SalⅠ進(jìn)行酶切,電泳后檢測(cè)發(fā)現(xiàn),含目的基因的質(zhì)粒可以切出2條合適大小的條帶(圖2-C),表明St3galⅠ基因已插入pMD18-T載體。用EcoRⅠ-SalⅠ酶切pMD18-T-St3galⅠ和pCI-neo質(zhì)粒,回收相應(yīng)的目的片段,利用T4連接酶進(jìn)行連接,然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌。通過(guò)對(duì)重組克隆進(jìn)行PCR和酶切鑒定,表明St3galⅠ基因已插入pCI-neo質(zhì)粒,從而實(shí)現(xiàn)真核表達(dá)載體pCI-neo-St3galⅠ的構(gòu)建(圖2-D、E)。

A.RT-PCR擴(kuò)增St3galⅠ基因的結(jié)果;B.菌落PCR篩選陽(yáng)性克隆pMD18-T-St3galⅠ;C.EcoRⅠ-SalⅠ雙酶切鑒定

2.2MDCK穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的建立

2.2.1G418篩選濃度的確定G418(新霉素)是一種氨基糖苷類抗生素,通過(guò)抑制部分轉(zhuǎn)座子基因,干擾核糖體功能而阻斷蛋白質(zhì)合成,當(dāng)neo基因被整合進(jìn)真核細(xì)胞DNA后,通過(guò)氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶的高效表達(dá),使細(xì)胞獲得抗性,從而能在含有G418的選擇性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。由于不同細(xì)胞對(duì)G418的選擇壓不同,因此需要進(jìn)行抗生素敏感性試驗(yàn)。在24孔板中接種MDCK細(xì)胞,加入不同濃度的G418,觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,從而確定G418的篩選濃度。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(圖3),G418 濃度達(dá)到500 μg/mL時(shí),MDCK細(xì)胞于10～14 d全部死亡,高于此濃度,細(xì)胞在培養(yǎng)的早期大量死亡;低于此濃度,細(xì)胞在培養(yǎng)2周后仍有大量的細(xì)胞存活。因此選擇500 μg/mL為試驗(yàn)中MDCK細(xì)胞壓力篩選培養(yǎng)基中G418的濃度。圖4為G418篩選14 d時(shí)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài),可以發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)基中不添加G418時(shí),細(xì)胞的生長(zhǎng)基本正常,沒(méi)有明顯的細(xì)胞脫落(圖4-A);當(dāng)G418的濃度達(dá)到100 μg/mL時(shí),細(xì)胞已開始脫落,但貼壁細(xì)胞仍占優(yōu)勢(shì)(圖4-B);當(dāng)G418的濃度達(dá)到300 μg/mL時(shí),細(xì)胞脫落已十分明顯,但仍有少量細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)(圖4-C);當(dāng)G418的濃度達(dá)到500 μg/mL時(shí),細(xì)胞幾乎全部脫落死亡,漂浮于培養(yǎng)基中(圖4-D);而當(dāng)G418的濃度達(dá)到700～900 μg/mL時(shí),培養(yǎng)基中幾乎觀察不到明顯的細(xì)胞(圖4-E、F)。

圖3　G418耐受細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

A～F.DMEM培養(yǎng)基中依次添加0,100,300,500,700,900 μg/mL G418第14 天時(shí)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。

2.2.2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的建立純化pCI-neo和重組質(zhì)粒pCI-neo-St3galⅠ,利用脂質(zhì)體Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染貼壁MDCK細(xì)胞,使用含500μg/mLG418的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行篩選。在含G418的培養(yǎng)液中,未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞死亡,而轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞由于獲得G418抗性而存活。從圖5可以觀察到,在篩選培養(yǎng)基中生長(zhǎng)12d的對(duì)照細(xì)胞全部死亡(圖5-A);而轉(zhuǎn)染pCI-neo和pCI-neo-St3galⅠ質(zhì)粒的MDCK細(xì)胞成簇排列,生長(zhǎng)旺盛(圖5-B、C)。試驗(yàn)結(jié)果表明,通過(guò)G418篩選,初步獲得了穩(wěn)轉(zhuǎn)目的基因的MDCK細(xì)胞系。

A.未轉(zhuǎn)染的MDCK細(xì)胞;B.轉(zhuǎn)染pCI-neo質(zhì)粒的MDCK細(xì)胞;C.轉(zhuǎn)染pCI-neo-St3galⅠ質(zhì)粒的MDCK細(xì)胞。

2.3單克隆抗性細(xì)胞株的篩選及分子檢測(cè)

將獲得的抗性細(xì)胞混合克隆進(jìn)行稀釋,經(jīng)選擇后挑選出30個(gè)單克隆抗性細(xì)胞株。連續(xù)篩選培養(yǎng)多代以后,單克隆細(xì)胞株生長(zhǎng)狀態(tài)依然良好。顯微觀察發(fā)現(xiàn),正常的MDCK細(xì)胞(野生型,WT)和空轉(zhuǎn)細(xì)胞的形態(tài)呈梭形(圖6-A、B);而部分轉(zhuǎn)染細(xì)胞近似棱形,排列更緊密,但形態(tài)差異并不太明顯(圖6-C)。提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞基因組DNA,通過(guò)PCR檢測(cè)顯示,WT對(duì)照和轉(zhuǎn)入空載體的細(xì)胞均無(wú)擴(kuò)增出合適的條帶,而轉(zhuǎn)入目的基因的細(xì)胞株則可擴(kuò)增出1 kb左右的條帶,與St3galⅠ基因的大小一致(圖6-D);提取細(xì)胞的總RNA,RT-PCR鑒定后看出,穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株均可擴(kuò)增出合適大小的條帶,而對(duì)照組正常和空轉(zhuǎn)的MDCK細(xì)胞未見有擴(kuò)增條帶(圖6-E)。上述分子檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明目的基因已成功整合入MDCK細(xì)胞的基因組中并可穩(wěn)定的進(jìn)行表達(dá)。

A.正常的MDCK細(xì)胞(WT);B.轉(zhuǎn)染pCI-neo質(zhì)粒的MDCK細(xì)胞;C.轉(zhuǎn)染pCI-neo-St3galⅠ質(zhì)粒的細(xì)胞;

3討論

以細(xì)胞作為基質(zhì)培養(yǎng)流感病毒,具有均質(zhì)性，保持流感病毒的抗原性不變及可操作性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[22]。但目前這種方法生產(chǎn)流感病毒還存在產(chǎn)率低、流感病毒不適應(yīng)宿主細(xì)胞或適應(yīng)慢等缺點(diǎn),這已成為制約細(xì)胞培養(yǎng)法生產(chǎn)流感病毒的瓶頸。因此,如何在細(xì)胞培養(yǎng)體系中有效地增殖流感病毒,已成為疫苗生產(chǎn)中亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。已有的研究表明,宿主細(xì)胞表面SA的含量與流感病毒的增殖具有密切的關(guān)系[13,19]。SA可以作為流感病毒的受體,與流感病毒HA蛋白結(jié)合,介導(dǎo)流感病毒侵入宿主細(xì)胞[1,7]。唾液酸轉(zhuǎn)移酶ST3GalⅠ能夠以胞苷一磷酸-β-N-乙酰神經(jīng)氨酸(CMP-Neu5Ac)為底物將SA殘基轉(zhuǎn)移至新的糖基受體上形成唾液酸糖苷化合物[14]。本試驗(yàn)從SPF雞胚中克隆出St3galⅠ基因,構(gòu)建了pCI-neo-St3galⅠ真核表達(dá)載體。通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞,利用G418篩選轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。由于不同種類的細(xì)胞或來(lái)源不同的同類細(xì)胞對(duì)G418的耐受性可能存在差異,因此,在篩選轉(zhuǎn)基因細(xì)胞之前,必須進(jìn)行抗生素敏感性試驗(yàn)[23]。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果,最終確定轉(zhuǎn)染的MDCK細(xì)胞合適的G418篩選濃度為500μg/mL。在擬轉(zhuǎn)染的pCI-neo質(zhì)粒上帶有抗性篩選標(biāo)記,其表達(dá)的產(chǎn)物氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶能夠抑制G418的活性,因此,轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞在含有G418的培養(yǎng)基中可以生長(zhǎng)。此外,需要注意的是,細(xì)胞轉(zhuǎn)染后需經(jīng)歷一段時(shí)間之后才會(huì)表達(dá)出蛋白質(zhì),一般要在轉(zhuǎn)染24h后方可加入G418進(jìn)行篩選;G418添加過(guò)早,細(xì)胞難以存活,難以篩選到轉(zhuǎn)基因細(xì)胞;添加過(guò)晚,又會(huì)導(dǎo)致未轉(zhuǎn)染細(xì)胞大量增殖,從而抑制轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生長(zhǎng)。通過(guò)G418篩選獲得的具有抗性的轉(zhuǎn)基因MDCK細(xì)胞具有異質(zhì)性,因此需要進(jìn)行克隆化培養(yǎng),進(jìn)而篩選到性狀穩(wěn)定的St3galⅠ基因高表達(dá)細(xì)胞株。由于1次克隆化培養(yǎng)獲得的細(xì)胞往往不純,所以需要將獲得的單克隆細(xì)胞再次進(jìn)行克隆化。通過(guò)觀察獲得的細(xì)胞克隆,發(fā)現(xiàn)和正常的MDCK細(xì)胞形態(tài)差異并不明顯,由此可以推測(cè),St3galⅠ基因在受體細(xì)胞基因組中整合的位點(diǎn)比較合適,幾乎沒(méi)有破壞細(xì)胞中原有基因的功能。本研究中,選取的表達(dá)載體中缺少熒光蛋白報(bào)告基因,雖然增加了對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選的難度,但對(duì)于將來(lái)基因工程疫苗的開發(fā)卻極為有利,可以避免熒光蛋白對(duì)疫苗效果產(chǎn)生不良的影響。通過(guò)PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞目的基因整合和轉(zhuǎn)錄情況,發(fā)現(xiàn)獲得的大部分克隆化細(xì)胞均可有效地表達(dá)St3galⅠ基因。并且,轉(zhuǎn)染細(xì)胞持續(xù)傳代后,St3galⅠ基因的表達(dá)情況并沒(méi)有發(fā)生明顯的變化。這些試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明,篩選的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞性狀穩(wěn)定,外源基因可以持續(xù)有效地表達(dá)。

目前,MDCK細(xì)胞被認(rèn)為是培養(yǎng)甲型和乙型流感病毒最合適的細(xì)胞系,轉(zhuǎn)染成功的MDCK細(xì)胞內(nèi)ST3GalⅠ的含量升高,可以增加宿主細(xì)胞表面的受體豐度,促進(jìn)AIV與細(xì)胞的吸附,從而提高AIV在細(xì)胞基質(zhì)中的產(chǎn)量。因此,在高質(zhì)量、快速流感疫苗生產(chǎn)上有著廣闊的應(yīng)用前景,特別是對(duì)于減少養(yǎng)禽業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失和降低人類感染AIV的風(fēng)險(xiǎn)具有更重要的意義。

參考文獻(xiàn)：

[1]江經(jīng)緯,潘德敏.流感病毒受體識(shí)別以及流感病毒跨宿主感染的分子機(jī)理[J].廣東畜牧獸醫(yī)科技,2006,31(1):24-27.

[2]Webster R G,Bean W J,Gorman O T,et al.Evolution and ecology of influenza A viruses[J].Microbiological Reviews,1992,56(1):152-179.

[3]陳俊霞,孫鵬,許書珍,等.H9N2亞型禽流感病毒HA基因的表達(dá)及其單因子血清的制備[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2015,42(11):2888-2894.

[4]楊婧,劉宇卓,趙冬敏,等.2013年蘇皖地區(qū)4株H9N2亞型禽流感病毒HA,NA基因的遺傳演化分析[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2015,27(11):1896-1902.

[5]王光鋒,李舫,王洪利.山東部分地區(qū)H9N2亞型禽流感病毒分離鑒定及HA和NA基因的遺傳進(jìn)化分析[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2015,36(6):13-18.

[6]王善輝,汪鵬旭,呂顏枝,等.H9N2亞型禽流感病毒HA-M2融合基因的真核表達(dá)及免疫原性研究[J].中國(guó)家禽,2015,37(13):18-21.

[7]Blanco J C,Pletneva L M,Wan H A,et al.Receptor characterization and susceptibility of cotton rats to avian and 2009 pandemic influenza virus strains[J].Journal of Virology,2013,87(4):2036-2045.

[8]陳瑞玲,鐘穎,鄧穎琦,等.表達(dá)H9N2亞型禽流感病毒HA蛋白重組乳酸桿菌的構(gòu)建[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào),2015,35(12):1917-1920.

[9]Resa-Infante P,Jorba N,Coloma R,et al.The influenza RNA synthesis machine advances in its structure and function[J].RNA Biology,2011,8(2):207-215.

[10]戈勝?gòu)?qiáng),王志亮.禽流感病毒受體研究歷程[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào),2013,33(10):1615-2622.

[11]Ito T,Kawaoka Y.Host-range barrier of influenza A viruses[J].Veterinary Microbiology,2000,74(1/2):71-75.

[12]魏冬旭,江連洲,王辰,等.唾液酸生物活性及其應(yīng)用的研究進(jìn)展[J].中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng),2011,17(7):64-68.

[13]劉媛媛,王俊亞,張曉娟,等.雞α-2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶Ⅰ基因的克隆和真核表達(dá)載體的構(gòu)建[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2013,40(1):21-24.

[14]吳亞麗,徐倩,武志丹,等.真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES-ST3GAL I的構(gòu)建及其在大腸桿菌中的初步表達(dá)[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2015,31(1):2284-2289.

[15]Harduin-Lepers A,Mollicone R,Delannoy P,et al.The animal sialyltransferases and sialyl tranferase-related genes:a phylogenetic approach[J].Glycobiology,2005,15:805-817.

[16]白榮德,沈志強(qiáng),王長(zhǎng)江,等.禽流感病毒研究的進(jìn)展[M].北京:科學(xué)出版社,2007.

[17]劉志東,王蔭榆,郭本恒,等.唾液酸的研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技,2010,31(4):368-373.

[18]Ferreira S A,Vasconcelos J L,Silva R C,et al.Expression patterns of α2,3-sialyltransferase I and α2,6-sialyltransferase I in human cutaneous epithelial lesions[J].European Journal of Histochemistry,2013,57(1):e7.

[19]Russell R J,Stevens D J,Haire L F,et al.Avian and human receptor binding by hemagglutinins of influenza A viruses[J].Glycoconjugate Journal,2006,23(1/2):85-92.

[20]錢進(jìn),章雄文,丁健.唾液酸轉(zhuǎn)移酶對(duì)腫瘤中唾液酸化結(jié)構(gòu)的影響[J].生命科學(xué),2006,18(3):227-232.

[21]馬汝海,鐘連生,潘忠誠(chéng),等.α-2,3-唾液酸糖基轉(zhuǎn)移酶ST3家族分子序列生物信息學(xué)分析[J].中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2011,40(6):497-511.

[22]史愛華,張建偉,沈佳,等.H9N2亞型禽流感病毒在MDCK細(xì)胞中增殖最佳條件研究[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2011,32(11):42-45.

[23]弗雷謝尼.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)[M].章靜波,譯.北京:科學(xué)出版社,2008.

TheCloningofSt3galⅠGeneofSPFChickenEmbryoandItsExpressioninMDCKCells

LU Yujian1,2,3,WU Xinming4,GUAN Yu4,ZHANG Songlin4,LI Shufang5,HAN Wenyu2,SHEN Zhiqiang1,4

(1.Postdoctoral Programme,Binzhou Animal Science & Veterinary Medicine Academy,Binzhou256600,China;2.Postdoctoral Programme,Jilin University,Changchun130062,China;3.Department of Life Sciences,Binzhou University,Binzhou256603,China;4.Binzhou Animal Science & Veterinary Medicine Academy,Binzhou256600,China;5.School of Life Sciences,Zhengzhou University,Zhengzhou450001,China)

Abstract：In order to improve the abundance of avian influenza virus(AIV)receptor on the surface of MDCK cells,12-day-old SPF chicken embryos was as material and St3galⅠgene was cloned by RT-PCR.Next,the target fragment was inserted to the pMD18-T vector.Subsequently,the pMD18-T-St3galⅠ and pCI-neo plasmids were digested and connected.Thus,the eukaryotic expression vector containing St3galⅠgene was constructed.Afterwards,the pCI-neo-St3galⅠ plasmid was purified and transfected into MDCK cell by liposome-mediated method.The transgenic cell lines were screened by G418.The cell strains expressing St3gal Ⅰ gene stably were initially obtained by cell cloning culture and PCR assay.The results showed that St3galⅠgene from chicken embryo was successfully inserted into pCI-neo plasmid,leading to the construction of the eukaryotic expression vector pCI-neo-St3galⅠ.In the G418 selection pressure,MDCK cells stably transfected target gene were initially obtained.The resistant cells were diluted,and 30 selected monoclonal resistant cell lines were selected.With genomic DNA and total RNA of transfected cells as a template,PCR analysis showed that the target gene had been integrated into the genome of MDCK cells and stably expressed.

Key words:Sialic acid;St3galⅠgene;MDCK;Transfection;G418;PCR

doi:10.7668/hbnxb.2016.02.009

中圖分類號(hào)：Q78

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-7091(2016)02-0045-07

作者簡(jiǎn)介：陸玉建(1979-),男,河南南陽(yáng)人,講師,博士,主要從事細(xì)胞工程及分子生物學(xué)研究。通訊作者：沈志強(qiáng)(1963-),男,山東榮成人,研究員,博士，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究。

基金項(xiàng)目：山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(ZR2012CL14);山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院博士后科研基金項(xiàng)目(BSH2014001)

收稿日期：2016-02-03