趙亞波,李培綱,陳澤愷,潘偉槐,莫億偉

(1.紹興文理學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院,浙江 紹興　312000;2.寧波大學(xué) 海洋學(xué)院,浙江 寧波　315211 )

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花期前后稻穗水分含量與水通道蛋白基因家族表達(dá)關(guān)系研究

趙亞波1,2,李培綱1,陳澤愷1,潘偉槐1,莫億偉1

(1.紹興文理學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院,浙江 紹興312000;2.寧波大學(xué) 海洋學(xué)院,浙江 寧波315211 )

摘要：水稻開(kāi)花期對(duì)水分脅迫非常敏感直接影響到結(jié)實(shí)率,水分供應(yīng)主要通過(guò)水通道蛋白來(lái)完成,為了研究花期稻穗的相對(duì)含水量與水通道蛋白基因家族表達(dá)關(guān)系,探討了花期前后6 d 內(nèi)稻穗相對(duì)含水量和水通道蛋白基因家族表達(dá)變化情況。結(jié)果表明:稻穗相對(duì)含水量呈現(xiàn)出花前最高、開(kāi)花期當(dāng)天最低、花后則再出現(xiàn)增加的規(guī)律;OsPIPs基因家族中各個(gè)基因表達(dá)的水平各有不同,其中OsPIP1-1、OsPIP1-2、OsPIP2-1、OsPIP2-4和OsPIP2-7的表達(dá)水平較高,而OsPIP2-2、OsPIP2-3和OsPIP2-8這3個(gè)基因在花期前后6 d內(nèi)均沒(méi)有表達(dá);所有OsTIPs基因均表達(dá),但不同OsTIPs基因表達(dá)水平在不同時(shí)間點(diǎn)也不同,除了OsTIP1-2 和OsTIP3-2的表達(dá)量比較低外,其他基因的表達(dá)量都非常高;OsNIPs基因家族表達(dá)量相對(duì)較低,如OsNIP1-2、OsNIP1-4、OsNIP3-2及OsNIP3-3在花期前后均不表達(dá),而OsNIP1-1和OsNIP2-1在開(kāi)花前后均有表達(dá),并在開(kāi)花當(dāng)天表達(dá)量較高;OsNIP2-2和OsNIP3-1只在開(kāi)花當(dāng)天表達(dá),其他時(shí)間點(diǎn)均不表達(dá);OsSIP1-1、OsSIP1-2在花前3 d 表達(dá)量最大,而OsSIP2-1在開(kāi)花當(dāng)天表達(dá)量最大,其他時(shí)間點(diǎn)略有下降。結(jié)果說(shuō)明,花期前后稻穗內(nèi)OsTIPs基因家族表達(dá)量最大,然后是OsPIPs基因家族,再次是OsSIPs和OsNIPs基因家族,但不同水通道蛋白家族各基因間的表達(dá)模式也不同,可能與對(duì)水分運(yùn)輸分工差異有關(guān),其中液泡膜水通道蛋白在水稻花期水分運(yùn)輸中的作用可能最大。

關(guān)鍵詞：水稻;稻穗;水通道蛋白;相對(duì)含水量;基因表達(dá)

隨著全球氣候變暖,農(nóng)田干旱缺水問(wèn)題變得更加嚴(yán)重,有專家預(yù)測(cè)到2030年水稻產(chǎn)量至少需要增加50%,才能滿足以稻米為主食國(guó)家的糧食需求,但目前水稻產(chǎn)量已受制于水資源短缺和環(huán)境退化等因素的影響[1]。有研究表明,在稻穗生長(zhǎng)發(fā)育及花期前后的缺水脅迫對(duì)水稻籽粒形態(tài)性狀、產(chǎn)量構(gòu)成的影響最大[2]。植物體內(nèi)水分的運(yùn)輸主要通過(guò)水通道蛋白(Aquaporin)來(lái)完成,高等植物的細(xì)胞質(zhì)膜和液泡膜上均存在種類(lèi)豐富的水通道蛋白,分布廣泛且具組織特異性,水通道蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)水的效率也是其他轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白所無(wú)法比擬的[3],水通道蛋白在細(xì)胞膜上組成“孔道”,可控制水分進(jìn)出細(xì)胞的過(guò)程。植物水通道蛋白主要有4類(lèi),即質(zhì)膜嵌入蛋白(Plasma membrane intrinsicprotein,PIP)、液泡膜嵌入蛋白(Tonoplast intrinsicprotein,TIP)、類(lèi)Nod26嵌入蛋白(Nudolin 26-like intrinsic protein,NIP)和膜嵌入小分子堿性蛋白(Small basic intrinsic protein,SIP),正是這些蛋白家族的存在,使得水分子可以快速地跨膜運(yùn)輸[4]。水通道蛋白是細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)水分運(yùn)輸?shù)闹饕ǖ?其運(yùn)輸和調(diào)控對(duì)于植物細(xì)胞水分穩(wěn)定和脅迫的響應(yīng)均具重要作用[5]。如在干旱條件下,水通道蛋白可通過(guò)阻止水分丟失,為降低干旱脅迫贏得了時(shí)間[6]。有研究表明,玉米根系的PIP2-5基因,在水分虧缺條件下其表達(dá)量明顯增加,有利于根系對(duì)水分吸收[7],李仁等[8]發(fā)現(xiàn)番茄(Solanumlycopersicum)水通道蛋白SIAQP表達(dá)水平受逆境條件的調(diào)控,并影響到水分的供應(yīng)。超表達(dá)OsPIP2-6或OsPIP1-1能顯著提高水稻抗旱和抗鹽的能力[9-10],同時(shí)在淹水條件下OsPIP2-6還能發(fā)揮其水分外排的功能,將水分快速排出體外,以此來(lái)保證植物體水分平衡。

水稻幼穗分化和花期前后對(duì)水分最為敏感,此時(shí)受高溫脅迫對(duì)水稻的籽粒充實(shí)影響很大[11],水分虧缺脅迫導(dǎo)致水稻產(chǎn)量下降超過(guò)其他所有非生物脅迫影響的總和[12],高溫脅迫通常會(huì)引起植物水分脅迫[13],因?yàn)樵谒置{迫下,籽粒灌漿過(guò)程中多種淀粉合成酶活性降低,導(dǎo)致籽粒生長(zhǎng)和灌漿速率降低[14]。所以,花期前后水分供應(yīng)是否充足是影響受精和充實(shí)的關(guān)鍵因素之一,而單個(gè)穎花的水分供應(yīng)來(lái)源于稻穗的水分供應(yīng)能力,稻穗內(nèi)水分的供應(yīng)可能與水通道蛋白基因表達(dá)及活性有關(guān),有研究表明,水稻的4個(gè)類(lèi)型共有33種水通道蛋白,不同的水通道蛋白的功能可能也不盡相同[15],而且隨著全球溫度的上升加速,通過(guò)基因工程的方法提高糧食作物對(duì)干旱的耐性將是未來(lái)研究的熱點(diǎn)[16]。作為稻穗水分運(yùn)輸?shù)闹饕緩?水通道蛋白基因家族表達(dá)與稻穗水分供應(yīng)關(guān)系卻鮮有報(bào)道,本研究探討花期前后稻穗的水分供應(yīng)與水通道蛋白基因家族表達(dá)關(guān)系,為逆境條件下水稻花期稻穗的水分供應(yīng)提供新的指導(dǎo)。

1材料和方法

1.1試驗(yàn)材料與處理

供試水稻(OryzasativaL.)為粳稻品種中花11,于2014年4月20日在紹興文理學(xué)院生物實(shí)驗(yàn)基地盆栽(直徑45 cm、高25 cm),每個(gè)盆內(nèi)裝過(guò)篩并充分拌勻的沙壤土10 kg,按常規(guī)方式管理,水稻開(kāi)花期在2014年7月初到8月中旬,根據(jù)陳義芳等[17]研究發(fā)現(xiàn),水稻在花后0～12 d是穎果發(fā)育最快的時(shí)期,之后則趨于平穩(wěn),所以參照馮九煥等[18]的方法當(dāng)?shù)局曛髑o和次二莖處于幼穗分化第7期(即花粉粒內(nèi)容物充實(shí)期,開(kāi)花前6 d左右)時(shí)開(kāi)始,每個(gè)處理選取穗型大小基本一致的40～50個(gè)稻穗掛牌標(biāo)記發(fā)育時(shí)期,水稻盛花當(dāng)天標(biāo)記為開(kāi)花時(shí)期,在花前6 d至花后6 d內(nèi)每隔3 d 取樣1 次(分別稱前6、前3、0、后3、后6),分別用于測(cè)定稻穗相對(duì)含水量并提取RNA。相對(duì)含水量的測(cè)定方法是每次取新鮮稻穗5～6個(gè),先稱鮮質(zhì)量(FW1),再用清水浸泡12 h 后,吸水紙吸干表面水分,稱重(FW2),再用105 ℃殺青10 min,在75 ℃烘24 h至恒重,稱取干質(zhì)量(FW3),按公式:(FW1-FW3)/(FW2-FW3)×100% 計(jì)算稻穗相對(duì)含水量。

1.2根尖根毛區(qū)的水通道蛋白相關(guān)基因表達(dá)的檢測(cè)

為了檢測(cè)花期不同時(shí)間內(nèi)稻穗內(nèi)水通道蛋白基因家族表達(dá)的差異,取花期前后不同時(shí)期的稻穗,使用RNA plant Regeant(TIANGEN,北京)提取植物總RNA,cDNA第一鏈合成使用Reverse Transcriptase M-MLV(RNAase H)反轉(zhuǎn)錄酶(TIANGEN,北京),具體方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。采用半定量RT-PCR方法檢測(cè)不同基因在稻穗開(kāi)花前后的表達(dá),利用水通道蛋白基因RT-PCR引物(表1),以cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)體系(25 μL)(TIANGEN,北京):2×MasterMix 12.5 μL，Primer F(10 μmol/L)1.0 μL，Primer R(10 μmol/L)1.0 μL，cDNA第一鏈0.7～1.1 μL(根據(jù)Actin擴(kuò)增的電泳結(jié)果進(jìn)行調(diào)整)、加適量的ddH2O μL補(bǔ)足到25 μL。

表1　水通道蛋白基因家族表達(dá)半定量PCR檢測(cè)引物表

PCR反應(yīng)條件是:94 ℃變性5 min;94 ℃變性30 s,59.5 ℃退火45 s,72 ℃延伸45 s,32個(gè)循環(huán);72 ℃保溫5 min;內(nèi)參基因β-actin上游引物5′-CAGCACATTCCAGCAGATGT-3′,β-actin下游引物 5′-TAGGCCGGTTGAAAACTTTG-3′,內(nèi)參基因β-actin的PCR反應(yīng)條件是:94 ℃變性5 min;94 ℃變性30 s,56.5 ℃退火45 s,72 ℃延伸45 s,30個(gè)循環(huán);72 ℃保溫10 min,PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物以1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。以上所有試驗(yàn)重復(fù)取樣3次分別進(jìn)行試驗(yàn),取代表性的圖片表示試驗(yàn)結(jié)果,其中相對(duì)含水量的試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2結(jié)果與分析

2.1花期前后稻穗相對(duì)含水量變化

從圖1可知,在花前6,3 d 稻穗的含水量都很高,基本都保持在97%左右。在盛花期當(dāng)天,稻穗相對(duì)含水量下降到70.52%左右;在花后3 d及灌漿過(guò)程中,稻穗相對(duì)含水量又明顯增加,到花后第6天又恢復(fù)達(dá)到84.29%左右。因此,開(kāi)花前稻穗的相對(duì)含水量都表現(xiàn)出由高到低，然后再增加的變化規(guī)律,而盛花當(dāng)天稻穗相對(duì)含水量最低,可能是因?yàn)殚_(kāi)花所以大量的穎殼張開(kāi),穎果內(nèi)的水分過(guò)度散失所致,從而使相對(duì)含水量下降。

圖1　花期前后稻穗相對(duì)含水量的變化

2.2花期前后水通道蛋白OsPIPs基因家族表達(dá)分析

由圖2可知,OsPIPs基因家族成員在花期前后6 d內(nèi),對(duì)于OsPIP1基因家族來(lái)說(shuō),OsPIP1-1在花期前后表達(dá)均比較高,但在開(kāi)花當(dāng)天的表達(dá)量略有下降,花后表達(dá)量又明顯增加,在花后第6天達(dá)到最高水平;OsPIP1-2在花期前后的表達(dá)量均比較高,并在開(kāi)花當(dāng)天表達(dá)量最高;OsPIP1-3在花期前后均處于較低的表達(dá)水平,其中在花前、花后6 d及開(kāi)花當(dāng)天的表達(dá)量都很低,花前3 d及花后3 d表達(dá)量略有增加。而OsPIP2基因家族的8個(gè)基因中,OsPIP2-1從花前6 d表達(dá)量逐漸下降,在花后3 d達(dá)到最低值,花后第6天時(shí)又再明顯增加;OsPIP2-4在花前3 d和開(kāi)花當(dāng)天的表達(dá)量最高,花后3 d則出現(xiàn)下降的情況,花后6 d表達(dá)量又明顯增加;OsPIP2-5在花前6 d沒(méi)有表達(dá),但從花前3 d開(kāi)始至花后6 d表達(dá)量逐漸升高;OsPIP2-6在開(kāi)花前表達(dá)量均處于較低的水平,開(kāi)花當(dāng)天表達(dá)量明顯增加并達(dá)最高水平,然后花后3 d又明顯降低到花前表達(dá)水平,在花后6 d又明顯增加;OsPIP2-7在花前6,3 d的表達(dá)水平都比較高,在開(kāi)花當(dāng)天則表達(dá)量最低,花后3 d表達(dá)量又在增加。而OsPIP2-2、OsPIP2-3和OsPIP2-8這3個(gè)基因在花期前后6 d內(nèi)均沒(méi)有表達(dá)。結(jié)果說(shuō)明,在花期前后6 d內(nèi),OsPIPs基因家族中11個(gè)基因表達(dá)的水平各有不同,其中OsPIP1-1、OsPIP1-2、OsPIP2-1、OsPIP2-4、OsPIP2-7的表達(dá)水平相對(duì)較高,有些基因則在整個(gè)過(guò)程中完全沒(méi)有表達(dá)。

圖2　花期前后OsPIPs基因家族的相對(duì)表達(dá)水平

從圖3可知,在OsTIP1基因家族的2個(gè)基因中,OsTIP1-1在水稻花期前后均保持很高的表達(dá)水平,從花前6 d開(kāi)始表達(dá)量不斷增加,在開(kāi)花當(dāng)天明顯增加,并在花后第6天達(dá)到最大表達(dá)量;OsTIP1-2只有在開(kāi)花當(dāng)天及花后3 d有微量的表達(dá),其他時(shí)期均不表達(dá)。OsTIP2基因家族的2個(gè)基因中,OsTIP2-1在花前6 d表達(dá)水平非常低,然后花前3 d開(kāi)始增加,但開(kāi)花當(dāng)天的表達(dá)量則又降低,花后3 d增加到最大的表達(dá)量,然后又開(kāi)始下降;OsTIP2-2的表達(dá)量在整個(gè)時(shí)期都非常高,并在開(kāi)花當(dāng)天表達(dá)量達(dá)最高水平。

OsTIP3-1在開(kāi)花前期表達(dá)量逐漸增加,開(kāi)花當(dāng)天的表達(dá)量達(dá)到最大的峰值,花后表達(dá)量又逐漸下降;OsTIP3-2只在開(kāi)花當(dāng)天和花后6 d有較低的表達(dá),其他時(shí)期均不表達(dá);OsTIP4-1只有在花后3 d的表達(dá)量相對(duì)較低,其他各時(shí)期的表達(dá)量非常高;OsTIP4-2從花前6 d開(kāi)始表達(dá)量不斷增加,在開(kāi)花當(dāng)天達(dá)到最大值,然后表達(dá)水平開(kāi)始下降;OsTIP4-3在花前6 d到花前3 d時(shí)略有下降,然后在開(kāi)花當(dāng)天明顯增加,花后3 d又開(kāi)始下降,最后在花后6 d又明顯增加達(dá)最高的表達(dá)水平。OsTIP5-1在開(kāi)花前6 d及花前3 d的表達(dá)量很高,而開(kāi)花當(dāng)天及花后3 d表達(dá)量下降,花后6 d又開(kāi)始增加。結(jié)果說(shuō)明了OsTIPs家族的10個(gè)水通道蛋白基因中,在花期前后6 d內(nèi)每個(gè)基因均有表達(dá),但是表達(dá)量的大小和出現(xiàn)的時(shí)間順序卻是不同的。

圖3　花期前后水通道蛋白OsTIPs基因家族表達(dá)水平

2.4花期前后水通道蛋白OsNIPs基因家族表達(dá)的分析

從圖4可知,OsNIPs基因家族在花期前后6 d內(nèi)整體的表達(dá)水平相對(duì)最低,其中OsNIP1-1從花前6 d到花前3 d表達(dá)量出現(xiàn)下降的現(xiàn)象,在開(kāi)花當(dāng)天表達(dá)量又明顯增加,花后3 d又明顯下降,而花后6 d又出現(xiàn)明顯增加的現(xiàn)象;OsNIP2-1從花前6 d開(kāi)始表達(dá)量增加,到花前3 d及開(kāi)花當(dāng)天表達(dá)量明顯提高,之后表達(dá)量逐漸下降;OsNIP2-2、OsNIP3-1只在開(kāi)花當(dāng)天表達(dá),花期前后的其他時(shí)期均不表達(dá);OsNIP4-1只在花后6 d才表現(xiàn)出較高的水平,而其他時(shí)期不表達(dá)。OsNIP1-2、OsNIP1-4、OsNIP3-2以及OsNIP3-3在水稻的花期前后6 d內(nèi)均無(wú)表達(dá)。結(jié)果說(shuō)明OsNIPs家族的9個(gè)水通道蛋白基因中,在花期前后6 d內(nèi)只有5個(gè)基因在某個(gè)時(shí)期有表達(dá),其他基因均不表達(dá),其中在開(kāi)花當(dāng)天集中表達(dá)的有OsNIP1-1、OsNIP2-1、OsNIP2-2和OsNIP3-1,說(shuō)明這幾個(gè)基因的開(kāi)花當(dāng)天可能對(duì)稻穗的水分運(yùn)輸有著一定的作用,其他的時(shí)間點(diǎn)內(nèi)表達(dá)很少。

圖4　花期前后OsNIPs基因家族的相對(duì)表達(dá)量

從圖5可知,OsSIP1-1在花前6 d到花前3 d,表達(dá)量略有增加,隨后就開(kāi)始下降,OsSIP1-2與OsSIP1-1類(lèi)似,但是在開(kāi)花前期的表達(dá)量較低,在花后表達(dá)量則非常低;而OsSIP2-1在開(kāi)花前期表達(dá)量逐漸增加,開(kāi)花當(dāng)天表達(dá)量達(dá)到最大值,之后表達(dá)量逐漸降低。在OsSIPs基因家族中,OsSIP2-1的表達(dá)量最大,并在開(kāi)花當(dāng)天表達(dá)量最高,可能在水分運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程中起著關(guān)鍵的作用,其他的2個(gè)基因在花后的表達(dá)則比較低。

圖5　花期前后OsSIPs基因家族的相對(duì)表達(dá)量

3討論與結(jié)論

3.1花期前后稻穗水分含量的變化與水通道蛋白基因的關(guān)系

本研究發(fā)現(xiàn),在盛花期當(dāng)天,稻穗的相對(duì)含水量下降到最低水平,可能與穎殼均處于開(kāi)張狀態(tài)有關(guān),水分過(guò)度散失所致,這與我們前期研究發(fā)現(xiàn),不同年份的溫度下,開(kāi)花當(dāng)天的稻穗的水分含量是最低的相一致。因?yàn)橛醒芯勘砻?相對(duì)含水量下降過(guò)大可能是整個(gè)稻穗的蒸騰強(qiáng)度增強(qiáng)所致,而在高溫脅迫下,穎花開(kāi)穎時(shí)間長(zhǎng)開(kāi)張角度變大,水分散失就更多[19],正是由于水分過(guò)度散失,使水稻開(kāi)花當(dāng)天對(duì)高溫、干旱等逆境脅迫更為敏感,從而使受精率和結(jié)實(shí)率下降[20-21]。而花前和花后穎殼處于關(guān)閉狀態(tài),水分散失機(jī)率相對(duì)較少,所以花后稻穗內(nèi)的相對(duì)含水量重新增加,再加上花后隨著胚乳發(fā)育和灌漿物質(zhì)積累也促進(jìn)水分向籽粒運(yùn)輸,相應(yīng)地提高了稻穗的相對(duì)含水量。因此,開(kāi)花當(dāng)天稻穗相對(duì)含水量很低,更易受逆境條件引起的水分脅迫影響,因此,水稻花期必須保證充足水分供應(yīng)以利于受精過(guò)程正常進(jìn)行。

稻穗內(nèi)水分向穎果供應(yīng)需要水通道蛋白的參與,因?yàn)橛醒芯勘砻?在根系內(nèi)流經(jīng)根細(xì)胞的水約70%～90%都要通過(guò)水通道蛋白運(yùn)輸作用,水通道蛋白還控制著氣孔開(kāi)關(guān)等生理生化的過(guò)程[4-5],前人研究表明,干旱脅迫條件下,超表達(dá)后PIP1能促進(jìn)氣孔的關(guān)閉,并能顯著提高轉(zhuǎn)基因植株的耐旱能力[22],并且發(fā)現(xiàn)玉米的ZmPIPs蛋白主要分布在氣孔的復(fù)合物內(nèi)[23],因此,水通道蛋白對(duì)維持細(xì)胞的水勢(shì)平衡起著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn),在水稻花期需要多種水通道蛋白基因的表達(dá),如在開(kāi)花當(dāng)天有很多個(gè)水通道蛋白表達(dá)量明顯提高或者表達(dá)量明顯的下調(diào),這可能是與不同的基因?qū)Υ藭r(shí)的水分運(yùn)輸有不同的分工有關(guān),因?yàn)橛醒芯堪l(fā)現(xiàn)超表達(dá)OsPIP1-1后顯著增強(qiáng)水稻水分的運(yùn)輸能力[10],這與本研究發(fā)現(xiàn)OsPIP1-1表達(dá)量在開(kāi)花當(dāng)天明顯下降與稻穗相對(duì)含水量降低的結(jié)果類(lèi)似,但也有研究發(fā)現(xiàn),過(guò)量表達(dá)OsPIP2-1還能抑制過(guò)多的水分進(jìn)入水稻根細(xì)胞的現(xiàn)象,或超表達(dá)某些水通道蛋白基因后,反而促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)水分脅迫更為敏感,加促植株的死亡的現(xiàn)象[24]。因此,稻穗內(nèi)水通道蛋白可能也有著雙重的作用,一方面保證水分通過(guò)水通道蛋白的調(diào)控進(jìn)入稻穗的細(xì)胞,另一方面,還可能同時(shí)具有將水分排到細(xì)胞外的能力,如何維持水稻開(kāi)花當(dāng)天的稻穗內(nèi)水分的動(dòng)態(tài)平衡,對(duì)提高稻穗的相對(duì)含水量則顯得非常重要,但水通道蛋白基因家族通過(guò)何種途徑調(diào)控稻穗水分供應(yīng)機(jī)制還需進(jìn)行深入研究。

3.2花期前后水通道蛋白基因家族間不同基因的表達(dá)差異

本研究發(fā)現(xiàn),在水稻花期前后6 d內(nèi),不同類(lèi)型的水通道蛋白基因家族的表達(dá)模式是不同的,相同類(lèi)型的水通道蛋白不同基因間的表達(dá)模式也不盡相同。其中整體表達(dá)水平最高的是OsTIPs,在OsTIPs的10個(gè)基因中全部表達(dá),其次是OsPIPs,在OsPIPs基因家族的11個(gè)基因中,有8個(gè)表達(dá)水平比較高,只有3個(gè)基因在此時(shí)期內(nèi)沒(méi)有表達(dá);再次是OsSIPs,在OsSIPs的3個(gè)基因全部表達(dá);表達(dá)最低的是OsNIPs基因家族,可能是OsNIPs基因家族的水稻的花器官內(nèi)的整體表達(dá)水平較低,這與前人在葉片和根系及花藥中研究發(fā)現(xiàn),OsNIPs基因家族在花藥中的表達(dá)量明顯低于葉片和根系的結(jié)果類(lèi)似[15]。所以基于本研究結(jié)果可知,不同類(lèi)型的水通道蛋白基因家族的表達(dá)模式可能有組織特異性。其中,OsTIPs基因家族表達(dá)水平最高,整個(gè)基因家族在不同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)均有表達(dá),說(shuō)明花期前后液泡膜上的水通道蛋白可能在水分運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程中起著非常重要的調(diào)控作用。因?yàn)橛蓄?lèi)似研究表明,種子在發(fā)育和成熟過(guò)程中通常伴隨著細(xì)胞質(zhì)滲透勢(shì)的協(xié)同變化,而滲透勢(shì)改變則通過(guò)水通道蛋白快速的調(diào)節(jié)水分的供給水平從而達(dá)到滲透平衡,為種子發(fā)育提供最佳條件[25],此外,人參(Panaxginsengy)水通道蛋白基因PgTIP1在擬南芥中超表達(dá)時(shí),顯著促進(jìn)了擬南芥種子發(fā)育速度，種子體積和重量均顯著高于野生型[26],所以稻穗內(nèi)液泡水通道蛋白OsTIPs基因家族的表達(dá)量增加,可能更利于通過(guò)液泡的滲透調(diào)節(jié)對(duì)水分的吸收,促進(jìn)花器官細(xì)胞體積的膨大,以便利于開(kāi)花和籽粒的充實(shí)。

OsPIPs基因家族中的OsPIP1-1和OsPIP1-2在整個(gè)開(kāi)花期間的表達(dá)量一直很高,OsPIP2-4、OsPIP2-6在開(kāi)花當(dāng)天的表達(dá)量升高,這與前人發(fā)現(xiàn)超表達(dá)OsPIP2-6或OsPIP1-1均能提高水稻抗旱和抗鹽能力結(jié)果相似[9-10],說(shuō)明這些基因在維持稻穗內(nèi)的水分平衡可能發(fā)揮著重要作用。前人研究還發(fā)現(xiàn),在OsPIP2-1表達(dá)的前提下,超表達(dá)OsPIP1-1后顯著增強(qiáng)水的運(yùn)輸能力[10],說(shuō)明水通道蛋白基因家族間還有相互協(xié)作的過(guò)程[27]。本研究發(fā)現(xiàn),雖然OsPIP1-1的表達(dá)水平保持很高,但是開(kāi)花當(dāng)天OsPIP1-1、OsPIP1-3和OsPIP2-7表達(dá)量卻有一定程度的下降,其下降的原因可能是可以抑制水分從稻穗內(nèi)的輸出,這與前人發(fā)現(xiàn)在水分脅迫下,有些基因表達(dá)上調(diào),有些基因表達(dá)下降類(lèi)似[28]。其中OsPIP2-3表達(dá)很低,這與Liu等[25]在水稻種子萌發(fā)過(guò)程中得到的結(jié)果一致。

在OsNIPs的9個(gè)基因中,有OsNIP1-1、OsNIP2-1、OsNIP2-2、OsNIP3-1等5個(gè)基因只在某個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)有表達(dá),在另外的時(shí)間點(diǎn)則不表達(dá)。這5個(gè)基因在開(kāi)花期的增加可能更有利于水分從稻穗內(nèi)的運(yùn)輸,而其他的4個(gè)基因在稻穗內(nèi)根本不表達(dá),這種表達(dá)差異可能是OsNIPs基因家族對(duì)稻穗水分運(yùn)輸作用不大,或這些基因本身就在水稻花器官內(nèi)的表達(dá)較低。此外,這一類(lèi)基因可能還有其他的功能,如在擬南芥(Arabidopsisthaliala)芽中超表達(dá)OsNIP3-1后,明顯減少了芽對(duì)砷的吸收,說(shuō)明OsNIPs基因家族對(duì)砷的運(yùn)輸具有一定的抑制作用[29]。而在OsSIPs的3個(gè)基因中,在開(kāi)花期間也均有表達(dá),但是表達(dá)量相對(duì)較低,在葉片、根尖和花藥內(nèi)也是OsSIPs基因家族表達(dá)顯著低于其他的基因家族[15],相對(duì)于其他基因家族來(lái)說(shuō),OsSIPs的作用可能更為基礎(chǔ)[30],有研究發(fā)現(xiàn)超表達(dá)PgTIP1后,明顯提高擬南芥耐旱和耐鹽能力[31],同時(shí)Ma等[32]則發(fā)現(xiàn),反義干涉擬南芥的AtTIP1:1后,卻極易引起植株的死亡,說(shuō)明OsSIPs基因也是不可替代的。

綜上所述,OsPIP2-1、OsPIP2-2、OsPIP2-4、OsPIP2-6、OsNIP1-1、OsTIP3-1、OsTIP3-2、OsTIP4-2、OsTIP4-3和OsSIP2-1在水稻開(kāi)花當(dāng)天的表達(dá)量都明顯增加,這些基因表達(dá)增加可能利于促進(jìn)水分從植株其他部分向稻穗運(yùn)輸,從而有利于水稻盛花期大量水分散失的補(bǔ)充。在水分最需要的時(shí)期,并不是所有的水通道蛋白基因表達(dá)量都增加。而且,相同類(lèi)型基因家族間的不同基因表達(dá)也有明顯差異,可能是各基因間分工不同所致。

本研究表明,在盛花期當(dāng)天稻穗的相對(duì)含水量下降到最低水平,可能是水分過(guò)度散失所致,稻穗內(nèi)不同的水通道蛋白基因家族的表達(dá)模式在花期前后的表達(dá)模式也不同,有些基因在開(kāi)花期當(dāng)天明顯提高表達(dá)量,有些明顯下降甚至不表達(dá),說(shuō)明不同的水通道蛋白對(duì)稻穗水分的運(yùn)輸作用也不同,將來(lái)應(yīng)該在基因表達(dá)水平與水通道蛋白活性的方面進(jìn)行深入研究,才能更好理解相關(guān)的水通道蛋白基因家族在稻穗的水分供應(yīng)上的作用機(jī)制。

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The Variation of Relative Water Content and Expression of Aquaporins Genes in Rice Panicle During before and after Flowering

ZHAO Yabo1,2,LI Peigang1,CHEN Zekai1,PAN Weihuai1,MO Yiwei1

(1.College of Life Science,Shaoxing University,Shaoxing312000,China;2.School of >Marine Sciences,Ningbo University,Ningbo315211,China)

Abstract：Rice flowering period is very sensitive to water stress and directly effect on setting rate;water supplies are affected by aquaporin genes expression and its activities.In order to investigate relationship between the relative water content and the aquaporin genes expression in rice panicle,the genes expression level of aquaporin and the relative water content in rice panicle were studied during the time before and after flowering for 6 days.The results showed that:The relative water content in pancile of rice was highest before flowering,and then lowest in the day of flowering,but after flowering the relative water content increased to highest value;Different OsPIPs showed at different expressional patterns,for example,OsPIP1-1,OsPIP1-2,OsPIP2-1,OsPIP2-4 and OsPIP2-7 displayed high level during these time.However,OsPIP2-2,OsPIP2-3 and OsPIP2-8 did not show any expression throughout the flowering period;All OsTIPs were expressed throughout the flowering period,but there were some differences in the expression level in different time,compared to high expression of others OsTIPs,OsTIP1-2 and OsTIP3-2 kept very lower expression level during these time;The expression of OsNIPs displayed very lower level during these time,for example OsNP1-2,OsNIP1-4,OsNIP3-2 and OsNIP3-3 were not expressed throughout the flowering period, OsNIP1-1 and OsNIP2-1 could express in the whole time,However,OsNIP2-2 and OsNIP3-1 could have a certain amount of expression only in flowering day,rather than in the other times;OsSIP1-1,OsSIP1-2 showed at the high value before the flowering day,while OsSIP2-1 reached its maximum during the flowering day.This experiment results showed that,the highest expression level was OsTIPs,followed by OsPIPs,then were OsSIPs and OsNIPs,but different water channel protein genes showed at different expression pattern during these time,and OsTIPs that displayed high expression level might be need more tonoplast intrinsic protein activities to keep water supply during the flower time of rice panicle.

Key words:Rice;Rice panicle;Aquaporin;Relative water content;Gene expression

doi:10.7668/hbnxb.2016.02.008

中圖分類(lèi)號(hào)：Q78;S511.03

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-7091(2016)02-0038-07

作者簡(jiǎn)介：趙亞波(1992-),男,河北保定人,在讀碩士,主要從事植物分子生物學(xué)研究。通訊作者：莫億偉(1971-),男,廣西融安人,副教授,博士,主要從事植物生理生化與分子生物學(xué)研究。

基金項(xiàng)目：浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(LY16C130004);國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31071353)

收稿日期：2016-01-10