成　業(yè),么大軒,劉云婷,胡文靜,段會(huì)軍

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué),華北作物種質(zhì)資源研究與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 保定　071001)

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Mutator轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的玉米甜質(zhì)突變體側(cè)翼序列克隆

成業(yè),么大軒,劉云婷,胡文靜,段會(huì)軍

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué),華北作物種質(zhì)資源研究與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 保定071001)

摘要：為了探討Mu轉(zhuǎn)座子使玉米發(fā)生甜質(zhì)突變的分子機(jī)理,利用Mu-AFLP方法分離Mutator轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列,并根據(jù)側(cè)翼序列的延伸設(shè)計(jì)一對特異性引物P1、P2,驗(yàn)證轉(zhuǎn)座子插入的真實(shí)性,同時(shí)對插入位點(diǎn)所在的基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示:側(cè)翼序列長299 bp,插入位點(diǎn)位于第3染色體,該轉(zhuǎn)座子的插入屬于真實(shí)插入;突變基因全長5 746 bp,共編碼592個(gè)氨基酸;所編碼蛋白的理論分子量為67.5 kDa,疏水性氨基酸含量為42.06%,具有10個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域,屬于親水性內(nèi)膜蛋白。該結(jié)果為更好地利用Mutator轉(zhuǎn)座子創(chuàng)制甜玉米新種質(zhì)奠定了基礎(chǔ),也對揭示玉米胚乳發(fā)育與淀粉合成機(jī)制具有重要意義。

關(guān)鍵詞：甜玉米;Mutator轉(zhuǎn)座子;玉米;Mu-AFLP

甜玉米以其豐富的營養(yǎng)及甜、嫩、香等特點(diǎn)成為一種大眾化蔬菜[1-3]。由于甜玉米的遺傳基礎(chǔ)較窄,又沒有像普通玉米那樣有現(xiàn)成的雜種優(yōu)勢模式可供應(yīng)用,還需要利用SSR[4]、SNP[5]等分子標(biāo)記去劃分雜種優(yōu)勢類群,這給甜玉米的選育[6-7]帶來了困難,甜玉米育種已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后生產(chǎn)的需求,因此，創(chuàng)制甜玉米種質(zhì)資源顯得尤為重要。

Mutator介導(dǎo)法是創(chuàng)造玉米突變體的最有效的技術(shù)之一[8]。在玉米突變體庫的構(gòu)建中有物理、化學(xué)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA[9-12]和轉(zhuǎn)座子插入突變等多種方法,其中Mutator具有較高的誘變頻率、低插入位點(diǎn)偏愛性和基因組內(nèi)拷貝數(shù)多等特點(diǎn)。獲得Mu因子誘導(dǎo)的突變體后,必須通過對Mu插入位點(diǎn)側(cè)翼序列的生物信息學(xué)分析,才能預(yù)測突變基因功能。目前,用于分離Mu插入側(cè)翼序列的方法很多,主要包括PCR步移技術(shù)[13]、反向PCR技術(shù)[14-15]、熱不對稱交錯(cuò) PCR技術(shù)[16]、AFLP技術(shù)[17]等。其中AFLP所需DNA量少,擴(kuò)增效率高,標(biāo)記結(jié)果穩(wěn)定可靠,對Mu插入位點(diǎn)側(cè)翼序列分離的準(zhǔn)確性和反應(yīng)的效率高,適合于分離Mu介導(dǎo)的玉米突變位點(diǎn)側(cè)翼序列。

本研究通過對Mutator轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的玉米甜質(zhì)突變體側(cè)翼序列克隆及突變基因生物信息學(xué)分析,為玉米胚乳發(fā)育與淀粉合成機(jī)制的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1供試材料

玉米優(yōu)良自交系綜31(Z31)為母本與具有原始來源活性的MuDR轉(zhuǎn)座子的Mu為父本進(jìn)行雜交構(gòu)建誘變?nèi)后wM1,M1自交獲得M2果穗,篩選出Mu轉(zhuǎn)座子誘導(dǎo)的甜玉米突變體,作為本研究Mu-AFLP技術(shù)分離甜玉米突變體目標(biāo)基因的試材。提取母本Z31、父本Mu和突變體的DNA作為分離Mu插入位點(diǎn)側(cè)翼序列的模板。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1玉米基因組DNA的提取和純化采用液氮研磨,CTAB抽提的方法[18]提取玉米基因組DNA,并放于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2Mu-AFLP方法分離插入位點(diǎn)側(cè)翼序列參照2008年,Wang等[19]的方法,研究分離Mu因子插入位點(diǎn)側(cè)翼序列。

1.2.3差異片段的回收、連接、轉(zhuǎn)化和測序利用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測選擇性擴(kuò)增的差異片段,把Z31、Mu親本和突變體的選擇性擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行對比,發(fā)現(xiàn)突變體的差異片段,回收差異條帶,用選擴(kuò)體系及PCR程序再次擴(kuò)增。1.5%瓊脂糖回收檢測后連接到PMG-T載體上,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌,藍(lán)白斑篩選陽性克隆,進(jìn)行菌液PCR鑒定重組子,之后送上海生工有限公司測序。

1.2.4側(cè)翼序列的基因比對將去除載體后的序列在MaizeGDB(http://www.maizegdb.org)上與B73序列進(jìn)行對比。

1.2.5插入位點(diǎn)真實(shí)性驗(yàn)證在MaizeGDB將側(cè)翼序列上下延伸100～200 bp,使用Primer Premier 6.0軟件對該序列設(shè)計(jì)一對特異引物來進(jìn)行插入位點(diǎn)的真實(shí)性檢測,并分別命名引物為P1、P2(圖1)。

圖1　Mu插入位點(diǎn)的真實(shí)性驗(yàn)證引物設(shè)計(jì)示意圖

1.2.6ZmEMP70的生物信息學(xué)分析利用Mu-AFLP方法得到Mu轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)側(cè)翼序列,將所獲得的序列在MaizeGDB(http://www.maizegdb.org/)中比對基因組獲得基因的全長。借助NCBI中的ORF Finder(http://www.nvbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)工具尋找基因完整的ORF并且利用EditSeq軟件對該基因ORF進(jìn)行分析。利用DNASTAR的Protean對蛋白質(zhì)所含的氨基酸殘基和理論分子量,以及等電點(diǎn)和組成氨基酸的化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析。利用http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/對ZmEMP70編碼的蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。利用TMHMM-2.0對ZmEMP70 編碼的蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。

2結(jié)果與分析

2.1插入位點(diǎn)側(cè)翼序列分離

預(yù)擴(kuò)增后吸取10 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測,得到彌散條帶(圖2),再進(jìn)行下一步選擇性擴(kuò)增。

1.DL2000 Marker;2.Mu親本;3.Z31親本;4.突變體。

通過選擇性擴(kuò)增進(jìn)行檢測,檢測結(jié)果見圖3。圖中明顯檢測到了突變體與親本的差異(A、B箭頭)條帶,并通過回收、測序等操作分離得到插入位點(diǎn)側(cè)翼序列為299 bp。

Z31.母本;Mu.父本;T.突變體。

2.2插入位點(diǎn)真實(shí)性檢測

利用P1、P2和S9、P2這2對引物分別對Mu活性親本、Z31、突變體進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示,以P1、P2為引物,Mu親本、Z31和突變體均有擴(kuò)增條帶;用S9、P2這對引物檢測,Z31與Mu親本在約300 bp處均無帶而突變體有帶(圖4),證實(shí)其為真實(shí)插入。

1.Z31、2.Mu、3.突變體,是P1、P2擴(kuò)增引物檢測結(jié)果;

2.3生物信息學(xué)分析

2.3.1基因定位及基因全長的獲得使用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)去除載體序列,將去除載體后的序列在MaizeGDB(http://www.maizegdb.org)上與B73序列進(jìn)行對比,發(fā)現(xiàn)該側(cè)翼序列與B73第3染色體上的一段區(qū)域完全匹配并上下延伸獲得基因全長(圖5)。

圖5　在基因組及染色體上的位置

2.3.2ZmEMP70的克隆及序列分析將側(cè)翼序列在MaizeGDB(http://www.maizegdb.org/)上進(jìn)行比對并延伸得到基因的全長共5 746 bp。借助NCBI中的ORF Finder (http://www.nvbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)工具尋找完整的基因ORF 1 896 bp,編碼592個(gè)氨基酸,5′UTR 117 bp,3′UTR 230 bp。2.3.3ZmEMP70編碼蛋白質(zhì)的分析將ZmEMP70的1 896 bp的核苷酸序列翻譯成氨基酸序列并利用DNAStar的Protean進(jìn)行分析,得到該基因編碼的蛋白含有592個(gè)氨基酸殘基,理論分子量67.5 kDa,等電點(diǎn)7.814;在pH=7時(shí)帶電量為3.317;疏水性氨基酸含量為42.06%,為親水性蛋白;酸性氨基酸含量為7.60%,堿性氨基酸含量為7.49%,極性氨基酸含量為26.69%(表1)。

2.3.4ZmEMP70編碼的蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域利用TMHMM-2.0對ZmEMP70編碼的蛋白跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,可見該蛋白具有10個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域,屬于內(nèi)膜蛋白(圖6)。

表1　ZmEMP70編碼的氨基酸組成分析

圖6　ZmEMP70所編碼蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域

3討論

Mutator轉(zhuǎn)座子具有較高的突變頻率、較低的插入專一性、基因組拷貝數(shù)多等特點(diǎn),因此，能夠在較少的群體內(nèi)產(chǎn)生覆蓋全基因組的大量突變體[20-23],圍繞Mu轉(zhuǎn)座子,國內(nèi)外構(gòu)建了不少突變體庫,如斯坦福大學(xué)的RescueMu突變體庫[24],冷泉港實(shí)驗(yàn)室的MTMdB突變體庫[25],華中農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室等單位構(gòu)建的Mu突變體庫[26]。通過Mu突變體庫己經(jīng)成功分離克隆了諸多基因。利用Mu突變體庫篩選甜玉米突變體進(jìn)行研究,將加速甜玉米新種質(zhì)的創(chuàng)制。并有助于對玉米胚乳發(fā)育與淀粉合成機(jī)制的認(rèn)識(shí)。本研究報(bào)道的甜玉米突變體,即是來自于Mu誘導(dǎo)的玉米突變體庫。

通過插入真實(shí)性檢測證明Mu轉(zhuǎn)座子插入到玉米基因組,該插入使得基因結(jié)構(gòu)改變而失活。普通玉米發(fā)生突變而變甜涉及復(fù)雜的生化過程,玉米的可溶性糖含量可能與胚乳發(fā)育機(jī)制、淀粉的生物合成等有關(guān)。推測該基因能影響玉米胚乳的發(fā)育,但該基因的具體功能以及作用機(jī)理尚未明確,有望通過RNAi技術(shù)[27-29]對該基因進(jìn)行進(jìn)一步研究,從而更好地從分子水平控制玉米淀粉的合成。

本研究利用玉米轉(zhuǎn)座子Mutator插入突變的方法獲得甜玉米,由于Mutator轉(zhuǎn)座子屬于玉米的內(nèi)源轉(zhuǎn)座子,所以不會(huì)對生態(tài)環(huán)境和食品安全構(gòu)成威脅。然而,通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)也可以有目的地創(chuàng)制甜玉米新種質(zhì),但當(dāng)前學(xué)術(shù)界對轉(zhuǎn)基因食品安全性仍然存在很大爭議,并沒有一個(gè)確切的定論。就各國政府而言,各國對轉(zhuǎn)基因食品均抱有比較謹(jǐn)慎的態(tài)度。就我國而言,還是比較保守的,對于含有的任何轉(zhuǎn)基因成分,所有市售食品都必須明確標(biāo)注。同時(shí),大規(guī)模種植轉(zhuǎn)基因甜玉米品種還要防止基因污染,以免給生態(tài)環(huán)境帶來不良影響。因此,利用玉米內(nèi)源Mu轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座而誘導(dǎo)甜玉米的方法更為安全。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉學(xué)銘,陳智毅,唐道邦.甜玉米的營養(yǎng)功能成分、生物活性及保鮮加工研究進(jìn)展[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,37(12):90-94.

[2]姚文華,韓學(xué)莉,汪燕芬,等.我國甜玉米育種研究現(xiàn)狀與發(fā)展對策[J].中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào),2011,13(2):1-8.

[3]王曉東.我國甜玉米育種的研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué),2014(10):146-148.

[4]黃華如,梁凱光,蟻珩鑫,等.利用SSR技術(shù)分析我國16種甜玉米的遺傳特性[J].生物技術(shù)通報(bào),2014,05(5):57-61.

[5]盧柏山,史亞興,宋偉,等.利用SNP標(biāo)記劃分甜玉米自交系的雜種優(yōu)勢類群[J].玉米科學(xué),2015(1):58-62,68.

[6]王慧,盧有林,孫大鵬,等.超甜玉米新品種申科甜1號的選育[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2015(5):96-99.

[7]杜如珊,盧保紅,魏榮業(yè),等.晉超甜1號水果玉米的選育與栽培技術(shù)[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,43(6):654-656.

[8]張少斌,張力,劉慧,等.玉米Mutator轉(zhuǎn)座子的研究進(jìn)展[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,41(6):5-7.

[9]Shimpei Magori，Vitaly Citovsky．Epigenetic control ofAgrobacteriumT-DNA integration[J].Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene Regulatory Mechanisms,2011，1809(8)：388-394.

[10]Azpiroz-leehan R,Feldmann K A.T-DNA insertion mutagenesis inArabidopsis:going back and forth[J].Trends in Genetics,1997,13(4):152-156.

[11]Katie A C，Patrick J K．Chromosomal translocations are a common phenomenon inArabidopsisthalianaT-DNA insertion lines[J]．The Plant Journal,2010，64(6)：990-1001.

[12]Li A H,Zhang Y F,Wu C Y,et al.Screening for and genetic analysis on T-DNA-inserted mutant pool in rice[J].Acta Genetica Sinica,2006,33(4):319-329.

[13]Siebert P D,Chenchik A,Kellogg D E,et al.An improved pcr method for walking in uncloned genomic DNA[J].Nucleic Acids Research,1995,23(6):1087-1088.

[14]Triglia T,Peterson M G,Kemp D J.A procedure forinvitroamplification of DNA segments that lie outside the boundaries of known sequences[J].Nucleic Acids Research,1988,16(16):8186.

[15]Does M P,Dekker B M,Degroot M J,et al.A quick method to estimate the t-dna copy number in transgenic plants at an early stage after transformation,using inverse PCR[J].Plant Molecular Biology,1991,17(1):151-153.

[16]Liu Y G,Whittier R F.Thermal asymmetric interlaced PCR:automatable amplification and sequencing of insert end fragments from P1 and YAC clones for chromosome walking[J].Genomics,1995,25(3):674-681.

[17]Cruz-Requenaa M，Aguilar-Gonzáleza C N，Espinoza-Velázquezb J，et al．AFLPs loci associated with polyembryonic maize using selective genotyping analysis[J]．Israel Journal of Plant Sciences,2013，61(1-4)：46-50．

[18]Murray M G,Thompson W F.Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J].Nucleic Acids Research,1980,8(19):4321-4325.

[19]Wang Yijun,Yin Guangming,Yang Qin,et al.Identification and isolation ofMu-flanking fragments from maize[J].Journal of Genetics and Genomics,2008,35(4):207-213.

[20]Walbot V.Reactivation of the mutator transposable element system following gamma irradiation of seed[J].Molecular & General Genetics,1988,212(2):259-264.

[21]Walbot V.Reactivation of mutator transposable elements of maize by ultraviolet light[J].Molecular & General Genetics,1992,234(3):353-360.

[22]Walbot V.Strategies for mutagenesis and gene cloning using transposon tagging and T-DNA insertional mutagenesis[J].Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol,1992(43):49-92.

[23]Walbot V.The Mutator transposable element family of maize[J].Genet Eng,1991,13:1-37.

[24]Fernandes J,Dong Q F,Schneider B,et al.Genome-wide mutagenesis ofZeamaysL.using RescueMutransposons[J].Genome Biology,2004,5(10):82.

[25]May B P,Liu Hong,Vollbrecht E,et al.Maize-targeted mutagenesis:A knockout resource for maize[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2003,100(20):11541-11546.

[26]劉文婷,高友軍,騰峰,等.Mutator轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的玉米插入突變體庫的構(gòu)建及遺傳評價(jià)[J].科學(xué)通報(bào),2006,51(17):2030-2036.

[27]張桂堂，盧東長城，孫重霞，等．利用正義RNAi技術(shù)提高玉米直鏈淀粉含量效果的研究[J]．華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2010，25(4):92-96．

[28]張志勇，崔艷，黃作喜，等．RNAi技術(shù)在玉米遺傳改良中的研究進(jìn)展[J]．內(nèi)江師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2013(8)：42-45．

[29]郭新梅,宋希云,張曉東.RNAi沉默淀粉分支酶基因SBEI對玉米直鏈淀粉合成的影響[J].植物學(xué)報(bào),2010,06(6):670-678.

Cloning Flanking Sequences Sweet Corn Mutant of Maize Inserted byMutatorTransposon

CHENG Ye,YAO Daxuan,LIU Yunting,HU Wenjing,DUAN Huijun

(Agricultural University of Hebei,North China Key Laboratory for Crop Germplasm Resources of Education Ministry,Baoding071001,China)

Abstract：In order to investigate the molecular mechanism of Mu gene transfer in sweet corn mutant,the flanking sequence of the insertion site of Mutator gene was isolated by Mu-AFLP method,and the authenticity of transposon insertions was verified by a pair of specific primers P1 and P2 designed according to the extension of the flanking sequences.Meanwhile the genetic biological information of the insertion site was analyzed.The results showed that the flanking sequence was 299 bp,which was located on the third chromosome.The full length of the mutant gene was 5 746 bp,encoding 592 amino acid.The theoretical molecular weight of the encoding protein was 67.5 kDa,the hydrophobic amino acid content was 42.06%,which had 10 transmembrane.It belonged to hydrophilic membrane protein.This result laid a foundation for the better use of Mutator to create new germplasm of sweet corn and it was very important for the development of endosperm and starch synthesis in maize.

Key words:Sweet corn;Mutator transposons;Maize;Mu-AFLP

doi:10.7668/hbnxb.2016.02.006

中圖分類號：Q785

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號：1000-7091(2016)02-0028-04

作者簡介：成業(yè)(1992-),女,河北邢臺(tái)人,主要從事作物分子設(shè)計(jì)育種研究。通訊作者：段會(huì)軍(1965-),男,河北保定人,教授,博士,主要從事作物分子設(shè)計(jì)育種研究。

基金項(xiàng)目：國家“十二五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目“糧食豐產(chǎn)科技工程”課題(2011BAD16B08;2012BAD04BO6;2013BAD07B05);河北農(nóng)業(yè)大學(xué)創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目

收稿日期：2016-02-11