孫大元,陳冠州,張景欣,周丹華,王　慧,朱小源,楊祁云,陳志強

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學院 植物保護研究所,廣東省植物保護新技術重點實驗室,廣東 廣州　510640;2.華南農(nóng)業(yè)大學,國家植物航天育種工程技術研究中心,廣東 廣州　510642)

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空間誘變水稻品系T2的稻瘟病抗性分析及抗病基因定位

孫大元1,陳冠州1,張景欣1,周丹華2,王慧2,朱小源1,楊祁云1,陳志強2

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學院 植物保護研究所,廣東省植物保護新技術重點實驗室,廣東 廣州510640;2.華南農(nóng)業(yè)大學,國家植物航天育種工程技術研究中心,廣東 廣州510642)

摘要：為了弄清水稻空間誘變稻瘟病抗性變異遺傳機理,以一個空間誘變抗稻瘟病突變體T2為研究對象,采取抗譜測定,遺傳分析及基因定位等方法,結果發(fā)現(xiàn):2013年晚造T2抗譜達到90.6%,高于部分廣東主栽品種;遺傳分析表明,其對GD0193的抗性由1個顯性主效基因控制,暫命名為PiTH;并通過SSR和InDel標記將該基因定位于水稻11號染色體SSR 標記T5與InDel標記K10之間約1.63 cM 的遺傳區(qū)域內。目前,該位點包含Pik抗病基因簇,因抗性差異,PiTH可能為該位點一新基因。

關鍵詞：水稻;稻瘟病;抗病基因;基因定位

稻瘟病是由稻瘟病菌(Magnaportheoryzae(Hebert)barr)引起的一種水稻全球性的毀滅性病害,嚴重威脅世界糧食生產(chǎn)安全。據(jù)統(tǒng)計,每年因稻瘟病造成的全球水稻產(chǎn)量損失達11%～30%,直接經(jīng)濟損失約50億美元,損失的糧食足以養(yǎng)活6 000萬人口[1]。稻瘟病在水稻全生育期內均可發(fā)生,經(jīng)常在水稻區(qū)造成巨大損失。近年來,我國西南、長江中游和東北等幾個重要稻區(qū)持續(xù)大流行,年發(fā)病面積高達570萬hm2,損失稻谷數(shù)億公斤,給我國的糧食安全帶來隱患[2]。長期的生產(chǎn)實踐證明,通過鑒定和利用廣譜抗性基因進行水稻抗病育種成為了防治病害的有效、經(jīng)濟的策略。然而,由于稻瘟病菌小種致病性的演變和遺傳的復雜易變性,新選育的抗病品種往往在推廣3～5 年后因為能侵染該品種優(yōu)勢小種的形成而喪失抗性[3]。因此,挖掘新的抗病資源、鑒定新的抗病基因以改良水稻品種的抗病持久性,是當前稻瘟病抗病育種的當務之急。

目前，至少已有84個主效稻瘟病抗病基因位點報道,這些基因成簇地分布于除第3 染色體外的所有水稻染色體上(2個隱性,其他顯性),其中,Pb1、Pia、Pib、Pid2、Pid3、Pik、Pik-h/Pi54、Pik-m、Pik-p、Pish、Pit、Pita、Piz-t、Pi1、Pi2、Pi5、Pi9、pi21、Pi25、Pi36、Pi37、Pi56、Pi63、PiCO39這24個基因已被成功克隆,Pi1、Pik-h/Pi54、Pik-m和Pik-p同為Pik位點上的復等位基因[4]。分離和克隆優(yōu)異的抗稻瘟病基因,開展分子標記輔助抗病育種,有利于培育具有持久、廣譜抗性的水稻新品種?？臻g誘變育種技術在創(chuàng)造優(yōu)異新種質、誘導新的基因資源突變和培育農(nóng)作物新品種上具有其獨特的優(yōu)勢和作用,是現(xiàn)代農(nóng)作物遺傳改良的新手段,是未來作物新技術育種的重要組成部分[5]。實踐證明,空間誘變手段可有效改良水稻的稻瘟病抗性,并能產(chǎn)生新的抗病基因,具有抗性變異頻率高、變異幅度大、有益變異增多等特點,但空間誘變稻瘟病抗性變異的機制很復雜,需要更為系統(tǒng)地研究[6-9]。

廣東省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所長期與國家植物航天育種工程技術研究中心合作研究空間誘變稻瘟病抗性變異機理,通過實踐衛(wèi)星及神舟飛船搭載水稻干種子,獲得H4、T1、T2等一批稻瘟病抗性變異突變體。其中T2是水稻品系泰航68經(jīng)“實踐8號”農(nóng)業(yè)衛(wèi)星進行空間誘變獲得的稻瘟病抗性增強的突變體,前期研究表明T2的抗性可以穩(wěn)定遺傳給后代[10]。因此,有必要挖掘其抗稻瘟病基因,作為抗病基因資源,用于抗病育種。本研究通過構建群體對突變體T2進行抗性遺傳分析,并應用SSR(Simple sequence repeats)和InDel(Insertion-deletion)對其抗病基因進行了定位。

1材料和方法

1.1試驗材料

高感稻瘟病水稻泰航68原種(TC)、突變體T2、麗江新團黑谷(LTH),以及部分原廣東省主栽品種三黃占2號、粵香占、粳秈89、青六矮、中二軟占、培雜泰豐和粵晶絲苗2號等。

試驗所需材料的干種子通過用自來水浸種2 d,置于28 ℃的環(huán)境中催芽至露白后,單粒穴播于鋁制育秧盤中,秧盤的規(guī)格長寬高分別為30,20,5 cm,每盤播種28穴,每穴播放15粒種子,每一個品系分別播到32～36個育秧盤中,每一個品系在一個育秧盤中只播一穴。

選用稻瘟病菌株GD0193為抗性遺傳分析菌株,其為秈型致病小種,致病型為 I-01-04;此外,GD0193 可侵染Pik、Pikp、Pi7(t)基因等多個單基因鑒別寄主,其致病譜較廣,具有較好的代表性[11]。

1.2稻瘟病抗性鑒定

人工接種鑒定:催芽后將水稻種子播于秧盤中,每盤播28穴,每穴一份材料,均設有抗、感對照,播種2周后接種菌株,2012年早造至2013年晚造分別選用廣東省有代表性的稻瘟病優(yōu)勢菌系36,36,32,32個用于接種,接種7 d后調查抗性表現(xiàn)[12]。

自然病圃鑒定:選擇廣東省粵北稻作區(qū)的從化呂田作為稻瘟病自然誘發(fā)鑒定圃,葉瘟和穗頸瘟的調查按國際水稻研究所的分級標準執(zhí)行[12]。

1.3基因組DNA提取,SSR分析及抗、感基因池構建

使用簡易CTAB法,從水稻苗期葉片中提取各個材料的基因組DNA[13]。

根據(jù)www.gramene.org網(wǎng)站查找到最新的水稻遺傳圖譜,選擇國際水稻微衛(wèi)星組織(International rice microsatellite initiative)已經(jīng)公布的RM系列SSR引物。插入缺失(Insertion/Deletion,InDel)多態(tài)性標記是借助于(美國)國家微生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI,http://www.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫中對粳稻與秈稻序列的比較而設計的。先將粳稻品種Nipponbare和秈稻9311已公布的核酸序列進行序列Blast對比,根據(jù)對比結果,從中找出兩者之間插入缺失在5～20 bp的序列差異,根據(jù)差異位點兩側的序列設計引物,用引物進行定位群體親本間的多態(tài)性分析。試驗用的所有引物均由上海生工合成。

PCR反應主要在PE公司9700型PCR儀上進行;反應總體積為20 μL,反應混合液包括:1.0 μL的DNA溶液,2.0 μL的10×PCR MIX Buffer,10 μmol/L 的正負引物各0.8 μL,其余由雙蒸滅菌水(ddH2O)補足。反應程序:94 ℃預變性3 min,(94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s)32個循環(huán),72 ℃再延伸10 min。擴增產(chǎn)物在8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳,快速銀染法染色觀察結果。

T2與LTH雜交的F2群體經(jīng)稻瘟病菌株GD0193 接種鑒定抗病性后,分別選取15個高度抗病和15個高度感病個體等量混合其基因組DNA組成抗病池(顯性池)和感病池(隱性池)。

1.4抗病基因遺傳分析

T2與LTH雜交的F2群體經(jīng)稻瘟病菌株GD0193 接種鑒定抗病性后,收集感病的F2個體,構建隱性遺傳作圖群體,采用隱性群體分離法進行遺傳連鎖分析,重組率按Kosambi作圖函數(shù)轉換成遺傳距離(Centimorgan,cM)。

2結果與分析

2.1T2抗譜分析

2012年早造至2013年晚造,分4次對T2和原種TC及部分原廣東省主栽品種(三黃占2號、粵香占、粳秈89、青六矮、中二軟占、培雜泰豐和粵晶絲苗2號等)進行苗期葉瘟抗病性鑒定,結果見表1。4次抗譜鑒定中,T2的抗譜接近于三黃占2號和粵晶絲苗2號,明顯優(yōu)于原種TC,表明T2對廣東省代表性的稻瘟病優(yōu)勢菌系具有穩(wěn)定抗性表現(xiàn)及廣譜抗性。

2012年早造至2013年晚造,分別將T2和原種TC種植于從化呂田稻瘟病鑒定圃進行穗瘟調查,結果見表2。T2 4次穗瘟分別鑒定為3級、5級、5級、0級,表現(xiàn)出抗至高抗水平,而原種TC 4次穗瘟都被鑒定為9級,且發(fā)病率達到90%,表現(xiàn)為嚴重的感病水平。

2.2抗性遺傳分析

利用菌株GD0193對T2和原種TC,以及它們雜交衍生的F1和F2群體接種,進行抗稻瘟病遺傳分析。GD0193對T2表現(xiàn)為抗病反應,對TC表現(xiàn)為感病反應,對F1表現(xiàn)為抗病反應,表明T2對菌株GD0193的抗性是由顯性基因控制的(表3)。2個F2群體對菌株GD0193的抗感分離比均符合3∶1,表明T2對菌株GD0193的抗性是由1個顯性基因控制的,暫命名為PiTH。用于構建抗病池的15株單株對菌株GD0193均表現(xiàn)高抗,用于構建感病池的15株單株對菌株GD0193均表現(xiàn)高感。

表1　T2和TC及部分廣東省主栽品種苗期稻瘟病抗譜鑒定結果

表2　T2和TC苗期抗譜及田間穗頸瘟抗性鑒定結果

表3　T2對菌株GD0193的抗性遺傳分析

2.3抗稻瘟病基因定位

選用均勻分布在水稻12條染色體上的SSR引物630對分別對定位群體F2的親本LTH和T2進行多態(tài)性分析,檢測到247對SSR引物在LTH和T2之間具有明顯的多態(tài)性,多態(tài)性頻率為39.2%,說明2個親本間的親緣關系比較遠,遺傳背景相差較遠,利于抗性基因的定位。進一步利用這247對SSR引物擴增構建好的抗病池和感病池,結果表明只有11號染色體短臂上的RM224和RM27360在兩池間表現(xiàn)出明顯的多態(tài)性。

為了確定PiTH基因位點所在的位置,我們在GRAMENE數(shù)據(jù)庫(http://www.Gramene.org/)中SSR標記RM224和RM27360之間的區(qū)域搜索并挑選到公共SSR標記24對,并設計了8對Intel引物;然后用這32個標記對兩親本進行分析,結果表明，只有6對引物RM27342、RM27334、MM0138、T5、K7、K10在抗感親本間檢測到有多態(tài)性。

利用上述5對SSR和3對Intel多態(tài)性標記對F2群體中獲得的總共521個極端感病個體進行連鎖分析,結果表明,RM224、RM27360、RM27342、T5、K7和K10 這6對引物與目的基因連鎖,其中RM224和T5位于目的基因的左側區(qū)域,分別檢測出18,14個重組體,換算成遺傳距離分別為1.73,1.34 cM;而K10、RM27342和RM27360位于目的基因的右側區(qū)域,分別檢測出3，6，14個重組體,換算成遺傳距離分別為0.29,0.58,1.34 cM;此外,標記K7沒有檢測出重組體,可初步確定其與抗病基因共分離。依據(jù)這6個標記與目的基因的連鎖關系及遺傳距離,構建了覆蓋目的基因PiTH的遺傳連鎖圖(圖1)。由圖可知目的基因被定位在標記T5與K10之間約1.63 cM 的遺傳區(qū)域,并與標記K7共分離。

圖1　PiTH基因的遺傳連鎖圖

3討論

抗病基因常常在特定染色體區(qū)域以基因簇的形式成簇存在[4]。在已報道的84個稻瘟病抗性基因中,半數(shù)以上的基因以基因簇的形式分布于水稻的不同染色體區(qū)域;其中,6,11,12號染色體上分別存在著Pi2、Pik和Pita3個較大的抗病基因簇。迄今,在第11號染色體上,目前已定位22個抗性基因,多個基因成簇分布于Pik位點附近。Pik位點共鑒定了7個等位基因,Pi1[14]、Pik[15]、Pikh、Pikm[16]、Pikp[17]、Piks和Pi7,它們均由2個緊密連鎖且具有完全獨立功能的NBS-LRR類基因組成,它們的基因序列高度保守,特別是Pik2位點,SNP則多存在于Pik1位點。在該抗病基因簇區(qū)域同樣也定位了Pi34[18]、Pi38[19]、Pi44[20]、Pikur2[21]、Pilm2[22]、Pi18[23]及Pi54等抗病基因。本研究中鑒定到的PiTH基因也被定位在這個大基因簇中,推測PiTH可能是Pik位點的一個新的等位基因。

此外,國家植物航天育種工程技術研究中心前期的研究工作中曾多次對Pik位點的等位基因進行系統(tǒng)的分析,發(fā)現(xiàn)本研究中所選用的稻瘟病優(yōu)勢菌株GD0193可侵染Pi1、Pik、Pi7、Pikm和Pikp等Pik位點的等位基因的近等基因系[24]。而本研究中連續(xù)2年的多次接種鑒定試驗表明,突變體T2對菌株GD0193具有穩(wěn)定的抗性表現(xiàn),這表明PiTH基因與Pi1、Pik、Pi7、Pikm和Pikp等抗病基因對菌株GD0193的抗性反應是不一樣的,而這說明了PiTH基因不是Pi1、Pik、Pi7、Pikm和Pikp等抗病基因中的一個。近期也有研究表明,由于自然界中稻瘟病菌無毒Avr-Pik存在著變異位點,致使與之相互作用的抗病基因Pik位點等位基因存在著抗譜差異和小種特異性[25]。因此,為了進一步明確PiTH基因與Pik位點等位基因之間的關系,需要開展更為深入的研究,包括對PiTH基因的克隆及功能分析,或者開展對菌株GD0193中無毒基因的克隆等。與此同時,具有穩(wěn)定及廣譜抗性的T2可作為一個特異的稻瘟病抗性資源,結合分子標記輔助選擇等育種新技術手段,可發(fā)揮其獨特的育種價值[7,26]。

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Analysis of Resistance to Blast Isolates and Mapping of Rice Blast Resistance Gene in T2

SUN Dayuan1,CHEN Guanzhou1,ZHANG Jingxin1,ZHOU Danhua2,WANG Hui2,ZHU Xiaoyuan1,YANG Qiyun1,CHEN Zhiqiang2

(1.Plant Protection Research Institute,Guangdong Academy of Agricultural Sciences,Guangdong Provincial Key Laboratory of High Technology for Plant Protection,Guangzhou510640,China;2.South China Agricultural University,National Engineering Research Center of Plant Space Breeding,Guangzhou510642,China)

Abstract：To understand the genetic mechanisms of space-induced rice mutants′ resistance to blast,T2,an indica rice mutant from Taihang 68,was researched in this study.Resistant spectrum,genetic analysis and gene mapping were applied in this study.It was found that T2 conferred broader resistance spectrum than most of main cultivars from Guangdong Province.By genetic analysis,the R gene was controlled by a single dominant gene,temporarily designed as PiTH gene,which was further mapped between T5 and K10 on chromosome 11 using SSR and InDel markers.PiTH might be a novel resistance gene in the Pik cluster,which conditioned differential reactions against many isolates and contained higher resistance.

Key words:Rice;Rice blast;Resistant gene;Mapping of rice blast resistance gene

doi:10.7668/hbnxb.2016.02.002

中圖分類號：S435.11

文獻標識碼：A

文章編號：1000-7091(2016)02-0007-05

作者簡介：孫大元(1984-),男,河南信陽人,助理研究員,博士,主要從事水稻抗病育種研究。孫大元、陳冠州為同等貢獻作者。通訊作者：楊祁云(1966-),女,廣東揭陽人,研究員,主要從事水稻抗病育種研究。陳志強(1956-),男,廣東揭陽人,教授,碩士,主要從事水稻遺傳育種相關研究。

基金項目：“十二五”國家“863”計劃項目(2012AA101201)

收稿日期：2016-01-20