陳志雄,戴雙鳳,夏昌選,謝海媚,李亞娟

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,廣東 廣州　510642;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)公共基礎(chǔ)課實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心,廣東 廣州　510642)

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水稻編碼SAND結(jié)構(gòu)域基因的序列與功能初步分析

陳志雄1,戴雙鳳1,夏昌選1,謝海媚1,李亞娟2

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,廣東 廣州510642;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)公共基礎(chǔ)課實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心,廣東 廣州510642)

摘要：為研究水稻SAND結(jié)構(gòu)域蛋白的序列和功能，利用Blast在水稻基因組中搜索編碼SAND結(jié)構(gòu)域的基因，然后構(gòu)建增強(qiáng)表達(dá)載體并通過遺傳轉(zhuǎn)化研究基因功能。結(jié)果表明，水稻基因LOC_Os01g57240(命名為OsULT1)編碼的氨基酸序列含有SAND結(jié)構(gòu)域和ULT B-box共有序列，與其他植物ULT氨基酸序列相似性為49.3%～92.3%，具有較好的保守性；35S::OsULT1轉(zhuǎn)基因株系部分穎花發(fā)育異常，出現(xiàn)內(nèi)稃發(fā)育滯緩或退化、漿片過度發(fā)育或數(shù)目變多、雄蕊數(shù)目3～7枚、雌蕊2枚的現(xiàn)象；穎花內(nèi)產(chǎn)生多余的小花，表明OsULT1對(duì)水稻花分生組織正常分化具有重要的調(diào)控作用。

關(guān)鍵詞：水稻;花發(fā)育;SAND結(jié)構(gòu)域;基因;序列

植物花的發(fā)育是按一定的步驟進(jìn)行的,首先在光周期促進(jìn)、春化促進(jìn)、自動(dòng)調(diào)控和赤霉素4種途徑共同調(diào)控下[1],完成從營養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)換,這時(shí)一部分或全部的莖頂端分生組織形成花序分生組織原基。隨后花序分生組織的周邊區(qū)域發(fā)育形成花分生組織和花器官分生組織原基,最終形成花萼、花瓣、雄蕊和雌蕊四輪不同類型的花器官。擬南芥花器官分生組織基因主要有A類基因APETALA1(AP1)和AP2、B類基因AP3和PISTILLATA(PI)、C類功能基因AGAMOUS(AG),這3類基因單獨(dú)或共同調(diào)控花器官原基的產(chǎn)生[2]。E類基因SEP1、SEP2和SEP3冗余作用決定花瓣、雄蕊和心皮以及花的有限發(fā)育[3-4]。除了AP2外,ABCE類基因編碼植物特有的MADS-box蛋白,具有保守的MIKC結(jié)構(gòu)域,能形成二聚體或高層次的復(fù)合體[5]。擬南芥MADS-box基因編碼的蛋白所形成的復(fù)合體能夠?qū)⑷~片轉(zhuǎn)變?yōu)榛ㄆ鞴賉6]。因此,花發(fā)育的四復(fù)合體模型認(rèn)為AP1-AP1-X-X、AP1-AP3-PI-SEP、AP3-PI-AG-SEP和AG-AG-SEP-SEP MADS-box蛋白的復(fù)合體分別為目標(biāo)基因特異性結(jié)合基因,決定了相應(yīng)花器官的形成[4]。

水稻花形態(tài)特征特異,花發(fā)育過程中各分生組織的許多特征與雙子葉植物明顯不同,是研究單子葉植物花發(fā)育的模式材料。水稻花發(fā)育的基因調(diào)控研究已取得了一定進(jìn)展,調(diào)控不同階段花發(fā)育相關(guān)基因均有報(bào)道,如TETFL1的同源基因RCN1和RCN2、LFY的同源基因APO2/RFL、調(diào)控水稻枝梗和小穗分生組織發(fā)育相關(guān)的基因有SP1、DEP2、OsAPO1/SCM2、IPA1、TAW1、LAX、LOG1和參與調(diào)控小穗分生組織發(fā)育及小穗向小花分生組織過渡的基因有FZP、SNB和MSF1[7-8]。水稻基因組中存在與擬南芥同源的花器官分生組織特異基因,如A類基因OsMADS14和OMADS15、B類基因SPW1/OsMADS16、OsMADS2和OsMADS4、C類基因OsMADS3、OsMADS58和DL、E類基因LSH1/OsMADS1[9-10]。水稻花發(fā)育調(diào)控基因在功能上與擬南芥具有保守性,但也出現(xiàn)一定的分化。

植物花發(fā)育是一個(gè)涉及眾多基因相互協(xié)調(diào)、共同調(diào)控的復(fù)雜過程?；òl(fā)育過程的花分生組織形態(tài)特征異常往往導(dǎo)致花器官數(shù)目變異,如擬南芥wuschel(wus)突變體花分生組織變成有限性分化[11]、perianthia突變體花分生組織大小未變但花器官空間分布的變化[12]、花分生組織大小,如clavata1、2、3和wiggum突變體[13-14]?；ǚ稚M織大小對(duì)花器官數(shù)目的調(diào)控機(jī)理研究最清楚的是擬南芥的CLV信號(hào)途徑[13]。水稻中存在著類似擬南芥的CLV信號(hào)途徑,水稻FON1是CLV1的同源基因,控制了花分生組織的大小。FON4對(duì)分生組織的正常終止是必需的,FON4屬于CLV3/ESR相關(guān)的基因家族[7-8]。擬南芥ultrapetala1(ult1)突變體花序分生組織變大,產(chǎn)生多余的花和花器官,花分生組織有限性缺失,AtULT1編碼SADN結(jié)構(gòu)域蛋白,通過WUS-AG空間反饋環(huán),負(fù)調(diào)控WUS基因活性進(jìn)而影響花分生組分化有限性,是莖端分生組織和花分生組織細(xì)胞積累的負(fù)調(diào)控因子[15-16]。本研究利用AtULT1序列搜索水稻基因組序列發(fā)現(xiàn)了一個(gè)同源基因ULTRAPETALA1(OsULT1),首先分析了OsULT1的氨基酸序列,并且構(gòu)建OsULT1增強(qiáng)表達(dá)載體,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化栽培稻,觀察轉(zhuǎn)基因株系的花器官變異情況,旨在初步明確OsULT1對(duì)花器官發(fā)育的影響,充實(shí)水稻生殖發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制。

1材料和方法

1.1序列分析

利用擬南芥ULTRAPETALA1(AtULT1)基因序列在水稻基因組注釋項(xiàng)目(http://rice.plantbiology.msu.edu/)進(jìn)行Blast,選E-value 小于e-10的記錄進(jìn)行分析。并選用AtULT1氨基酸序列在 phytozome(http://www.phytozome.net)進(jìn)行BlastP,獲取同源基因。利用PROSITE(http://prosite.expasy.org/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在水稻全長(zhǎng)cDNA數(shù)據(jù)庫KOME(http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)搜索到全長(zhǎng)cDNA。序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建分別采用ClustalX 1.83和MEGA 5.2軟件。

1.2總RNA提取與RT-PCR

取水稻日本晴孕穗期幼穗,利用TRIzol法(Invitrogen公司)提取總RNA。采用SuperScript RTⅡ逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen公司)將RNA逆轉(zhuǎn)錄成第一鏈,離心管中加入5 μg總RNA和1 μL Oligo(dT)15(Promega公司),補(bǔ)充一定體積DEPC水到8 μL。在70 ℃水浴中加熱5 min,后在冰上冷卻,稍離心。然后依次加入4 μL 5× First Strand Buffer(Invitrogen公司)、2 μL 0.1 mol/L DTT(Invitrogen公司)、1.6 μL 2.5 mmol/L DNTP(TaKaRa公司)和1 μL Rasin(40 U/μL)(Promega公司),混勻后42 ℃反應(yīng)2 min;加1 μL逆轉(zhuǎn)錄酶SuperScript RTⅡ,42 ℃反應(yīng)1 h,70 ℃反應(yīng)15 min,終止反應(yīng)。

RT-PCR以逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板,擴(kuò)增體系為20 μL,內(nèi)含2.0 μL cDNA、2.0 μL 10× PCR Buffer、0.8 μL 2.5 mmol/L dNTP、4.0 μL 引物(1.0 μmol/L)、0.2 μLTaq酶(5 U/μL)和11 μL ddH2O。PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s,循環(huán)28次;72 ℃ 10 min(延伸)。OsULT1基因特異性引物為OsULT1-F(5′-TTATTTTGA GTTGTTGCGGTGTG-3′)和OsULT1-R(5′-CGGGGA ATCATTGGACCTG-3′)。潮霉素基因引物Hpt-F(5′-TCCGGAGCCTCCGCTCGAAGTAG-3′)和Hpt-R(5′-CTGAACTCACCGCGACGTCGTC-3′)。

1.3PCR產(chǎn)物回收和克隆及測(cè)序

利用0.8%瓊脂糖電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物,并割膠回收目的DNA片段,用于連接反應(yīng)。連接反應(yīng)體系為PCR產(chǎn)物5 μL,pUCm-T載體0.5 μL(25 ng),T4連接酶1 μL(4 U),10×T4連接酶緩沖液2 μL,ddH2O 11.5 μL,反應(yīng)總體積20 μL,14 ℃過夜。取5～10 μL連接產(chǎn)物,加入到100 μL感受態(tài)DH-5α菌株的細(xì)胞懸浮液中,混勻,置冰上30 min,42 ℃熱擊90 s,冰上3～5 min。加入0.5 mL的LB培養(yǎng)液,37 ℃振蕩培養(yǎng)1 h。取100 μL培養(yǎng)液涂布于LB培養(yǎng)平板上,37 ℃培養(yǎng)到藍(lán)白斑區(qū)分明顯。挑選白色菌落,37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h。用堿裂解法抽提質(zhì)粒,送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序

1.4轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)與表型分析

構(gòu)建了35S::OsULT1增強(qiáng)表達(dá)轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒,設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增OsULT1 cDNA編碼區(qū)序列,克隆到pUCm-T載體上,雙酶切后,連接到pCAMBIA1301的多克隆位點(diǎn)。水稻遺傳轉(zhuǎn)化采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法[17]。水稻稻穗破口時(shí),選取幼穗,觀察內(nèi)外稃片數(shù)、漿片、花藥、柱頭和子房的數(shù)目,并選擇含有不同數(shù)目花器官典型的小花進(jìn)行拍照。

2結(jié)果與分析

2.1水稻ULTRAPETALA1的序列獲取

以擬南芥ULTRAPETALA1(AtULT1)基因編碼區(qū)序列Blast水稻基因組注釋項(xiàng)目(TIGR),獲得2個(gè)E-value 小于e-10的記錄號(hào),分別為L(zhǎng)OC_Os01g57240和LOC_Os05g42290。PROSITE預(yù)測(cè)結(jié)果表明,LOC_Os01g57240編碼的氨基酸序列含有SAND結(jié)構(gòu)域;在水稻全長(zhǎng)cDNA數(shù)據(jù)庫搜索到與LOC_Os01g57240編碼區(qū)相匹配的全長(zhǎng)cDNA AK064375,編碼區(qū)序列相似性達(dá)99%,僅有2個(gè)堿基的差異,表明LOC_Os01g57240基因能轉(zhuǎn)錄形成mRNA,將它命名為OsULT1。LOC_Os05g42290編碼的氨基酸序列不具有SAND結(jié)構(gòu)域,在水稻全長(zhǎng)cDNA數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)了與它編碼區(qū)相匹配的全長(zhǎng)cDNA AK108614,但兩者相似性較差,LOC_Os05g42290不作后續(xù)分析。

2.2水稻ULTRAPETALA1的序列比對(duì)與進(jìn)化分析

利用OsULT1氨基酸序列在 Phytozome(http://www.phytozome.net)進(jìn)行BlastP,結(jié)果發(fā)現(xiàn)雙子葉植物擬南芥、苜蓿、大豆和單子葉植物玉米、二穗短柄草、谷子基因組有水稻OsULT1同源基因,具有較好的保守性,編碼的氨基酸序列中含有SAND結(jié)構(gòu)域和ULT B-box共有序列(圖1);這8種植物ULT氨基酸序列相似性較高,為49.3%～92.3%。水稻OsULT1與GmULT序列相似性最低為54.6%,而與SiULT的相似性最高達(dá)87.6%。

OsULT1.LOC_Os01g57240，水稻;ZmULT.GRMZM2G082745,玉米;SiULT.Si002762m,谷子;BdULT.Bradi2g51790,

擬南芥AtULT1和AtULT2 SADN結(jié)構(gòu)域堿基序列發(fā)生錯(cuò)義突變,導(dǎo)致花序和花分生組織變大而產(chǎn)生多余的花或花器官。將植物ULT蛋白SAND結(jié)構(gòu)域序列與人類、繡麗隱桿線蟲的ULT蛋白SAND結(jié)構(gòu)域序列進(jìn)行多序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)它們之間的保守性較差,相似性為9.9%～20.2%,而植物SAND結(jié)構(gòu)域序列之間相似性則較高,相似性為47.2%～84.6%,但是2個(gè)重要的基序TPxxFE和KDWK均存在,二級(jí)結(jié)構(gòu)也存在較大的差異(圖2)。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明,植物ULT蛋白與人類、繡麗隱桿線蟲的ULT蛋白明顯分成兩大類,進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn),而植物間則相對(duì)較近(圖3)。

OsULT1.LOC_Os01g57240,水稻;SiULT.Si002762m,谷子;BdULT.Bradi2g51790,二穗短柄草;MtULT.AC229695_4,苜蓿;PtULT.

圖3　水稻OsULT1與其他物種

2.3水稻ULTRAPETALA1基因的功能研究

據(jù)OsULT1基因全長(zhǎng)cDNA AK064375克隆序列設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增CDS序列并測(cè)序,結(jié)果表明,擴(kuò)增條帶的序列與預(yù)測(cè)的一樣。將OsULT1 CDS插入pCAMBIA1301多克隆位點(diǎn),構(gòu)建了OsULT1超表達(dá)載體35S::OsULT1,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化粳稻品種日本晴,并獲得轉(zhuǎn)基因株系,利用pCAMBIA1301載體攜帶的潮霉素基因設(shè)計(jì)特異性引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè),表明35S::OsULT1整合到日本晴基因組(圖4-A)。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因株系OsULT1基因的表達(dá)量大于對(duì)照日本晴(圖4-B)。

轉(zhuǎn)基因株系株?duì)I養(yǎng)生長(zhǎng)期植株形態(tài)與野生型水稻類似,莖稈、葉片、葉鞘形態(tài)未表現(xiàn)出變異。抽穗期,幼穗頂端部分小穗表現(xiàn)出變異(圖5)。正常水稻穎花由4輪花器官組成,從外到內(nèi)依次為外稃、內(nèi)稃各1片、1對(duì)漿片、6枚雄蕊和1枚雌蕊,穎花的基部有1對(duì)退化的護(hù)穎。轉(zhuǎn)基因株系35S::OsULT1小穗表現(xiàn)花器官結(jié)構(gòu),如小穗軸上長(zhǎng)一穎花和一稃片狀結(jié)構(gòu)(圖5-A)、內(nèi)稃退化成尖狀結(jié)構(gòu)(圖5-B)、外稃包住內(nèi)稃(圖5-C)、外稃與內(nèi)稃之間有漿片狀結(jié)構(gòu)(圖5-C1)、內(nèi)稃里長(zhǎng)有雄蕊和雌蕊(圖5-C2)、外稃包住另一完整的小花(圖5-D、D1、D2)、穎花的內(nèi)、外稃內(nèi)長(zhǎng)有類稃片結(jié)構(gòu)1或2片(圖5-E～F)等,有的花絲頂端發(fā)育出柱頭(圖5-G),有的內(nèi)稃發(fā)育帶緩或退化(圖5-H～J)。轉(zhuǎn)基因株系35S::OsULT1產(chǎn)生2對(duì)漿片的穎花(圖5-K)，漿片過度發(fā)育與花絲相粘連(圖5-L)。轉(zhuǎn)基因株系35S::OsULT1雌蕊異常表現(xiàn)為2枚雌蕊(圖5-K)。轉(zhuǎn)基因株系35S::OsULT1穎花內(nèi)花藥數(shù)變化較大，有3枚(圖5-K)、4枚(圖5-M)、5枚(圖5-N)、6枚(圖5-O)、7枚(圖5-P)；穎花內(nèi)花絲花藥粘連在一起(圖5-Q)。這些變異性狀在轉(zhuǎn)基因株系后代均可觀察到,表明OsULT1表達(dá)水平變異會(huì)影響水稻花分生組織正常分化。

A：1.DL2000 標(biāo)準(zhǔn)分子;2,3.日本晴;4～10.T0轉(zhuǎn)基因株系;

圖5　35S::OsULT1轉(zhuǎn)基因株系花器官變異

3討論與結(jié)論

水稻作為重要糧食作物之一,其生殖發(fā)育(花序)影響與稻谷產(chǎn)量緊密相關(guān),研究水稻生殖發(fā)育機(jī)制具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。與雙子葉模式植物相比,水稻等單子葉植物花序發(fā)育的機(jī)制研究明顯落后于雙子葉植物,相關(guān)突變體較少是原因之一。反向遺傳學(xué)方法是研究水稻花發(fā)育的基因調(diào)控機(jī)制的有效方法[10]。擬南芥AtULT1在花序、花分生組織大小以及維系花分生組織有限性的負(fù)調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用[15-16],擬南芥AtULT1和AtULT2表達(dá)水平下調(diào)導(dǎo)致側(cè)生器官發(fā)育畸形和早期莖端分生組織分化停止[18],可見擬南芥ULT基因在花發(fā)育中的重要性。本研究結(jié)果表明,水稻基因組存在一個(gè)ULT基因OsULT1,其編碼的蛋白質(zhì)含有SAND結(jié)構(gòu)和TPxxFE基序。DmDEAF-1、HsNUDR和HsGMEB1/2等SAND 結(jié)構(gòu)蛋白與DNA特異性結(jié)合,SAND結(jié)構(gòu)域通過KDWK基序調(diào)控這種相互作用,SAND結(jié)構(gòu)域是AIRE反式激活、同質(zhì)多聚化和核定位所必需的。三維結(jié)構(gòu)模型分析SAND結(jié)構(gòu)域是一新的DNA結(jié)合分子,參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控[19]。擬南芥AtULT1與 ATX1 trxG因子相互作用,影響AGAMOUS組蛋白甲基化調(diào)控AGAMOUS的轉(zhuǎn)錄水平[20]。水稻OsULT1與擬南芥AtULT1的SAND結(jié)構(gòu)序列相似為67.3%,預(yù)示著水稻OsULT1具有與AtULT1類似的功能,在花發(fā)育過程中發(fā)揮調(diào)控作用。

轉(zhuǎn)基因株系35S::OsULT1少數(shù)穎花四輪花器官數(shù)目均表現(xiàn)變異,轉(zhuǎn)基因株系后代表現(xiàn)類似的變異性狀,表明OsULT1表達(dá)水平變異會(huì)影響水稻花分生組織正常分化。35S::OsULT1轉(zhuǎn)基因株系大部分穎花的花器官未出現(xiàn)變異,這可能與轉(zhuǎn)基因株系中OsULT1表達(dá)水平增加較小有關(guān)。單子葉水稻花發(fā)育模型與雙子葉植物相似,水稻C類功能基因有OsMADS3和OsMADS58,SEP類功能基因LSH1/OsMADS1等,這些基因發(fā)生變異會(huì)導(dǎo)致花器官數(shù)目、同源異型轉(zhuǎn)化和花分生組織分化有限性發(fā)生變化。水稻中也存在著類似擬南芥的CLV信號(hào)途徑。水稻FON1和FON4分別是擬南芥CLV1和CLV3/ESRLRR同源基因,FON1 控制了花分生組織的大小,FON4對(duì)分生組織的正常終止是必需的,表型上的相似性暗示FON1與FON4 在控制分生組織發(fā)育的通路中共同起作用,因此,有必要進(jìn)一步探討ULT1與它們之間的調(diào)控關(guān)系。

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Preliminary Analysis on Sequence and Function of Rice Gene Encoding SAND-domain Protein

CHEN Zhixiong1,DAI Shuangfeng1,XIA Changxuan1,XIE Haimei1,LI Yajuan2

(1.College of Agronomy,South China Agricultural University,Guangzhou510642,China;2.Center of Experimental Teaching for Common Basic Courses,South China Agricultural University,Guangzhou510642,China)

Abstract：To study the sequence and function of rice SAND domain protein,the gene encoding SAND was identified by Blast against the rice genome,and then over-expression vector was constructed to study its gene function by genetic transformation.The results found that the rice genome contains a gene LOC_Os01g57240(named as OsULT1),which encoded amino acid sequence containing SAND domain and ULT B-box consensus sequence.The amino acid sequence similarity between OsULT1 and ULTs of other plants varied from 49.3% to 92.3%, they were highly conservative.The 35S::OsULT1 transgenic lines generated some mutant spikilets,which included under-developed or degenerated paleas,over-developed locidules,the increased number of locidules,the variant number of stamen,two pistils,or extra floret.The results indicates OsULT1 should play important roles in regulation of floral meristem identity in rice.

Key words:Rice(Oryza sativa L.);Floral development;SAND-domain;Gene;Sequence

doi:10.7668/hbnxb.2016.02.001

中圖分類號(hào)：S511.03;Q78

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-7091(2016)02-0001-06

作者簡(jiǎn)介：陳志雄(1975-),男,福建莆田人,副研究員,博士,主要從事水稻分子遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新研究。通訊作者：李亞娟(1979-),女,山東菏澤人,高級(jí)實(shí)驗(yàn)師,博士,主要從事水稻生殖遺傳學(xué)研究。

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31271688);廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(S2011010005114)

收稿日期：2016-02-01