王志遠，李 可，龐楠楠，張 瑞

1.新疆醫(yī)科大學第五附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，新疆 烏魯木齊 830000；2.新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院血液病中心

白介素-6、核周型抗中性粒細胞胞漿抗體與抗釀酒酵母抗體在克羅恩病中的臨床價值

王志遠1，李 可1，龐楠楠2，張 瑞2

1.新疆醫(yī)科大學第五附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，新疆 烏魯木齊 830000；2.新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院血液病中心

目的 探討白介素-6(IL-6)、核周型抗中性粒細胞胞漿抗體(pANCA)與抗釀酒酵母抗體(ASCA)在克羅恩病(Crohn’s disease，CD)中的診斷價值。方法 共有CD患者67例，健康對照者30名。分別用間接免疫熒光法(IIF)測定pANCA，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定IL-6和ASCA，計算各項指標在CD及其亞型中的靈敏度、特異度及陽性預測值，并進行統(tǒng)計學分析。結(jié)果 CD活動期患者血清IL-6水平顯著高于緩解期及健康對照組，且與病情嚴重程度呈正相關(guān)。pANCA在CD組與健康對照組中靈敏度差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。ASCA、ASCA IgA和ASCA IgG在兩組中陽性率差異均有統(tǒng)計學意義(χ2=16.58、5.69、14.09，P均<0.05)，單項檢測ASCA IgA、ASCA IgG，兩種方法間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。聯(lián)合檢測IL-6、pANCA和ASCA可以提高CD診斷的靈敏度、特異度和陽性預測值，對陽性率影響不大。CD各亞型中pANCA、ASCA靈敏度組間差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，兩種抗體與病情嚴重程度無明顯相關(guān)。結(jié)論 促炎因子IL-6與CD病情進展相關(guān)，對CD的診斷和臨床評估具有重要意義。ASCA可以作為CD診斷的一個重要血清學指標，而pANCA對CD的診斷價值相對較小。

克羅恩??；白介素-6；抗中性粒細胞胞漿抗體；抗釀酒酵母抗體

克羅恩病(Crohn’s disease，CD)是消化內(nèi)科的常見疾病之一，與潰瘍性結(jié)腸炎、腸結(jié)核、大腸癌等腸道疾病相比，CD發(fā)病率相對較低。雖沒有長期的流行病學調(diào)查資料，但近年來CD發(fā)病率有明顯上升趨勢[1]。目前的研究[2]認為CD的發(fā)生可能與遺傳因素、炎癥反應(yīng)及腸黏膜對各種抗原刺激產(chǎn)生的免疫反應(yīng)有關(guān)。副結(jié)核分支桿菌、侵襲性大腸桿菌已被證實參與CD腸道炎性反應(yīng)和繼發(fā)感染，臨床上患者常出現(xiàn)間歇性低熱或中等度熱。白介素-6(interleukin-6，IL-6)作為一種重要的炎癥因子，在機體的炎性介質(zhì)反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。已有學者[3]發(fā)現(xiàn)IL-6在炎癥性疾病診斷方面具有一定價值，有較高的特異度和靈敏度。核周型抗中性粒細胞胞漿抗體(perinuclear antineutrophil cytoplasmic antibodies，pANCA)和抗釀酒酵母抗體(anti-saccharomyces cerevisiae antibodies，ASCA)參與炎癥性腸病體液免疫，但兩種抗體作用機制仍不明確。關(guān)于pANCA與ASCA在CD中的研究，國內(nèi)外已有相關(guān)報道，然而由于樣本容量有限、地域差異較大，研究結(jié)論尚未統(tǒng)一，也不乏矛盾之處。目前也尚未見炎癥因子、血清學抗體聯(lián)合檢測的相關(guān)報道。因此本研究擬通過聯(lián)合檢測CD患者中IL-6、pANCA、ASCA水平，探討其在CD中的臨床作用，為疾病的診療提供更多的思路和方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2010年1月-2015年1月在新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院、第五附屬醫(yī)院、自治區(qū)人民醫(yī)院確診的門診及住院部CD患者67例。診斷標準：參照《2010年世界胃腸病學組織關(guān)于炎癥性腸病診斷和治療的實踐指南》[4]，即通過臨床表現(xiàn)、影像學檢查、腸鏡檢查、黏膜組織學檢查、切除標本和排除其他腸道疾病等要點進行綜合診斷。排除標準：排除潰瘍性結(jié)腸炎、腸結(jié)核、白塞病、缺血性腸病、顯微鏡下結(jié)腸炎、阿米巴痢疾、藥物性腸病、嗜酸性細胞腸炎、憩室炎、惡性淋巴瘤和癌等疾病。CD患者中，男42例，女25例，年齡22～65歲，平均年齡(35.1±10.8)歲。根據(jù)2005年Montreal分型標準[5]可對CD患者進行亞型分組，按診斷年齡分為：A1組(≤16歲)、A2組(17～40歲)、A3組(≥40歲)；按病變部位分為：L1組(回腸末端)、L2組(結(jié)腸)、L3組(回結(jié)腸)、L4組(上消化道)；按疾病行為分為：B1組(炎癥性)、B2組(狹窄)、B3組(穿透)。CD病情嚴重程度可根據(jù)Best CDAI評分標準分為緩解期(CDAI<150分)、活動期(≥150分)，其中輕度活動期(150～220分)、中度活動期(221～450分)、重度活動期(>450分)。選取同期在新疆醫(yī)科大學第五附屬醫(yī)院體檢的健康人群30名作為健康對照組，男17名，女13名，年齡15～65歲，平均年齡(32.3±14.4)歲，排除近期感染、結(jié)締組織病、長期使用質(zhì)子泵抑制劑(PPI)、非甾體抗炎藥(NASIDs)者。CD組與對照組均經(jīng)過詳細詢問病史、體格檢查及相關(guān)輔助檢查，所有研究對象均簽署知情同意書。兩組性別、平均年齡相比差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)，具有可比性。

1.2 實驗方法 采集CD組與對照組清晨空腹血4 ml，3 000 r/min離心10 min(離心半徑10 mm)，收集血清凍存于-80 ℃冰箱待檢。

IL-6測定：IL-6試劑盒購自美國R&D公司，試驗方法應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)。分別設(shè)立標準孔、待測孔、空白孔，將血清樣本稀釋5倍后，加于待測孔。室溫孵育30 min，反復洗滌，每孔加入顯色劑混勻，最后加入終止液50 μl。在450 nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。制作OD值標準曲線，計算相應(yīng)濃度。IL-6正常值范圍0～7 pg/ml。

pANCA血清學測定：pANCA試劑盒購自美國ATCC公司，試驗方法采用間接免疫熒光法(IIF)。將血清按1∶10稀釋，取20 μl滴加于乙醇固定的中性粒細胞生物薄片，另取陽控、陰控各20 μl作為對照，孵育30 min，用PBS緩沖液沖洗5～10 min。在薄片潔凈反應(yīng)區(qū)滴加20 μl熒光標記的羊抗人IgG結(jié)合物，孵育30 min后用PBS緩沖液洗滌10～15 min。封片后，應(yīng)用倒置熒光顯微鏡觀察結(jié)果，陰性參考值為pANCA<20 RU/ml。

ASCA IgA/IgG血清學測定：ASCA IgA/IgG試劑盒購自美國INOVA公司，試驗采用ELISA法。梯度稀釋標準品，制備標準曲線，酶標板中加入患者血清，每個樣本3個復孔，實驗中設(shè)置陽性對照孔和陰性對照孔，室溫下孵育。加入與辣根過氧化物酶共軛的羊抗人IgA/IgG結(jié)合物，洗滌后加入100 μl底物，避光室溫15 min。加入終止液后在450 nm光度計上測定吸光度，根據(jù)公式計算出抗體量。樣本抗體量=樣本OD值/低陽性率OD×25。陰性參考值為ASCA IgA<20.0 EU/ml，ASCA IgG<40.0 EU/ml。

2 結(jié)果

2.1 CD組與健康對照組IL-6水平比較 CD緩解期IL-6水平高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.695，P<0.05)；CD活動期IL-6水平高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義(t=16.523，P<0.05)；輕度活動期、中重度活動期IL-6水平均高于緩解期，差異有統(tǒng)計學意義(t=12.622、25.373，P均<0.05)；輕度活動期IL-6水平低于中、重度活動期，差異有統(tǒng)計學意義(t=7.376，P<0.05，見表1)。

2.2 CD組與健康對照組pANCA與ASCA水平比較 健康對照組中pANCA陽性率為16.7%，ASCA陽性率為13.3%，ASCA IgA陽性率為13.3%，ASCA IgG陽性率為0。單項檢測pANCA在CD組與健康對照組中陽性率差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.103，P>0.05)。單項檢測ASCA在CD組與健康對照組中陽性率差異有統(tǒng)計學意義(χ2=16.58，P<0.005)。單項檢測ASCA IgA或ASCA IgG，其在CD組及健康對照組中陽性率差異有統(tǒng)計學意義(ASCA IgA：χ2=5.69，P<0.05；ASCA IgG：χ2=14.09，P<0.005)，而兩種方法之間差異無統(tǒng)計學意義(χ2=3.39，P>0.05)。

單項檢測pANCA、ASCA的比較：CD組中ASCA陽性率顯著高于pANCA，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=14.70，P<0.005)。聯(lián)合檢測pANCA、ASCA：CD組中ASCA+/pANCA-陽性率為57.3%(小于單獨檢測ASCA陽性率58.2%)，靈敏度為66.7%，特異度為89.3%，陽性預測值為92.3%(見表2)。

2.3 聯(lián)合檢測IL-6、pANCA、ASCA 相比單獨檢測，三者聯(lián)合測定可以提高結(jié)果的靈敏度、特異度和陽性預測值(見表2)。

2.4 pANCA、ASCA在CD亞型中的檢測 pANCA在CD各亞型中陽性率、靈敏度、特異度、陽性預測值均偏低；ASCA在大多數(shù)CD亞型中具有較高的特異度和陽性預測值，靈敏度顯著高于pANCA；ASCA IgA靈敏度較低，但具有較高的特異度和陽性預測值；ASCA IgG靈敏度明顯高于ASCA IgA，且特異度、陽性預測值均為100%，高于上述抗體。CD各亞型中，單項檢測pANCA、ASCA、ASCA IgA、ASCA IgG的靈敏度和陽性預測值組間差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。CD病變主要累及回腸末端與右側(cè)鄰近結(jié)腸(L1+L3)，與病變位于結(jié)腸者(L2)相比，各抗體陽性率差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)，且非并發(fā)癥組(B1)與并發(fā)癥組(B2+B3)陽性率差異亦無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)，各抗體與疾病活動性無明顯相關(guān)(P均>0.05，見表3～4)。

表1 CD組與健康對照組中IL-6水平比較Tab 1 Comparison of IL-6 levels between CD group and healthy control group ±s,pg/ml)

表2 IL-6、pANCA、ASCA及其組合對CD的評價指標比較(%)Tab 2 Comparison of evaluation indexes of IL-6,pANCA,ASCA and their combination in CD group (%)

表3 CD各亞型中pANCA、ASCA陽性率/靈敏度比較[n(%)]Tab 3 Comparison of positive rates or sensitivity of pANCA and ASCA in CD subtypes[n(%)]

表4 CD各亞型中pANCA、ASCA特異度、陽性預測值比較(%)Tab 4 Comparison of specificity and positive predictive value of pANCA and ASCA in CD subtypes (%)

3 討論

CD作為一種病因復雜的炎癥性腸病，缺乏診斷金標準，臨床上有較高的漏診率和誤診率。對CD的診斷及鑒別診斷依然是現(xiàn)階段研究的重點與難點，隨著病情不斷發(fā)展，CD患者易出現(xiàn)管腔狹窄、穿孔等并發(fā)癥，預后較差，因此早期診斷與治療尤為關(guān)鍵。

CD屬于慢性非特異性炎性肉芽腫性疾病，炎性細胞因子在其發(fā)生、發(fā)展過程中具有相當重要的作用。IL-6由激活的巨噬細胞產(chǎn)生，兼?zhèn)浯傺着c抗炎兩種生物學功能。一方面，IL-6對機體多種細胞都具有較為普遍的促炎作用，在急性炎癥反應(yīng)期能夠直接參與到炎癥損傷過程中[6]。IL-6誘導中性粒細胞分泌和增殖，促進腸上皮細胞分泌電解質(zhì)，使內(nèi)皮細胞通透性增加，炎性細胞透過血管浸潤至腸道黏膜，加重CD病情。另一方面，IL-6參與機體免疫反應(yīng)，誘導特異性抗體的產(chǎn)生，如IL-6可以刺激漿細胞產(chǎn)生抗體，參與免疫應(yīng)答，抑制炎癥反應(yīng)，這些機制與炎癥性腸病的發(fā)生息息相關(guān)[7]。有研究[8]證實，IL-6可漸進性加重結(jié)腸炎癥，容易使CD患者并發(fā)瘺管、狹窄、穿孔等嚴重并發(fā)癥，且CD活動期IL-6水平明顯高于健康人群。國外學者[9]報道，CD患者病理活檢標本中IL-6水平高于疾病對照組及正常對照組，與內(nèi)鏡下炎癥分級呈正相關(guān)，本研究與該文獻報道一致，隨著疾病活動性增加，IL-6表達水平也逐漸上調(diào)，說明高水平的IL-6與病情重、預后差有關(guān)，IL-6可能是一種重要的評估CD病情嚴重程度的細胞因子。

pANCA與ASCA作為炎癥性腸病血清學抗體的經(jīng)典組合，已被廣泛運用到臨床協(xié)助CD診斷與病情評估，然而不同報道間卻存在較大差異。在潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)患者中pANCA靈敏度為50%～67%，特異度為75%～94%。而ASCA在CD患者中陽性率可達39%～72%，特異度為82%～89%，顯著高于UC患者[10]。然而ASCA檢測缺乏一定的敏感度與特異度，限制其對CD的診斷作用[11]。本研究中，CD患者ASCA陽性率、特異度、陽性預測值均顯著高于pANCA，與文獻[12]報道一致，說明ASCA在CD診斷方面較pANCA更為敏感，可以作為CD診斷的一個重要血清學指標，而pANCA對CD的診斷價值相對較小。值得一提的是，聯(lián)合檢測ASCA IgA與ASCA IgG可以提高ASCA的診斷，聯(lián)合測定pANCA與ASCA可以提高CD診斷的靈敏度、特異度和陽性預測值，對陽性率影響不大。因此相對于單項檢測，聯(lián)合抗體測定對CD的診斷更有幫助。

Coukos等[13]發(fā)現(xiàn)pANCA參與炎癥性腸病并發(fā)的憩室炎，而ASCA與CD病情發(fā)展密切相關(guān)。pANCA陽性CD患者經(jīng)激素等治療后，pANCA滴度較治療前無明顯變化，其與并發(fā)癥、病情程度無相關(guān)性，提示pANCA可能反映機體免疫調(diào)節(jié)紊亂狀態(tài)，而對疾病本身無直接作用。而ASCA陽性者手術(shù)治療后發(fā)生瘺和結(jié)腸袋的風險顯著高于陰性者，以ASCA IgA最為顯著。本試驗中pANCA陽性者13例，8例接受正規(guī)治療，其中病變位于結(jié)腸者5例，口服布地奈德、氨基水楊酸制劑，病變位于回結(jié)腸者5例，口服布地奈德、柳氮磺吡啶，1例后因不能耐受，改用甲氨蝶呤肌注，另有1例行手術(shù)治療，所有8例患者治療2周后復查pANCA仍為陽性，未見ASCA陽性患者術(shù)后出現(xiàn)瘺管。Rieder等[14]發(fā)現(xiàn)隨著CD病情不斷發(fā)展，ASCA水平會發(fā)生顯著波動，但ASCA并不會由陽轉(zhuǎn)陰。Solberg等[15]也指出CD患者ASCA水平在診斷及治療2年后較穩(wěn)定，滴度無明顯變化。本研究尚未對隨訪人群進行ASCA檢測，有待延長隨訪時間進一步復查。

Eser等[16]指出ASCA IgA或IgG在CD患者中的檢出率為60%～70%，可以預測CD表型及病情嚴重程度，特別是病變位于回腸者具有較高的陽性率。Ryan等[17]也提出同樣觀點，認為ASCA陽性率高與回腸CD密切相關(guān)。本研究中，回結(jié)腸與回腸末端ASCA陽性率均略高于結(jié)腸和上消化道，但組間差異無統(tǒng)計學意義。因此，要證明ASCA與CD回腸間的相關(guān)性，需要擴大樣本量隨訪觀察。本研究顯示血清學抗體檢測不能有效預測CD亞型，這與Lichtenstein等[18]的研究結(jié)論一致。

綜上所述，pANCA與ASCA檢測最大的缺陷在于其較低的靈敏度，無法預測CD病情的活動度，尚有待新的方法進一步提高其診斷效力。而IL-6不僅參與CD的發(fā)生，其在CD病變腸黏膜組織中表達水平的高低還與疾病的嚴重程度相關(guān)。因此，聯(lián)合檢測IL-6、pANCA、ASCA對CD的診斷及病情評估具有重要意義。目前國內(nèi)外關(guān)于細胞因子與血清學抗體在CD治療、預后等方面的研究相對較少，也缺乏大樣本量的前瞻性研究。IL-6、pANCA與ASCA在CD中的作用機制及診斷價值有待進一步研究，以期指導臨床。

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(責任編輯：陳香宇)

Clinical significance of interleukin-6,perinuclear antineutrophil cytoplasmic antibodies and anti-saccharomyces cerevisiae antibodies in Crohn’s disease

WANG Zhiyuan1,LI Ke1,PANG Nannan2,ZHANG Rui2

1.Department of Gastroenterology,the Fifth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University,Urumchi 830000; 2.Centre of Hematopathy,the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University,China

Objective To evaluate the clinical significance of interleukin-6 (IL-6),perinuclear antineutrophil cytoplasmic antibodies (pANCA) and anti-saccharomyces cerevisiae antibodies (ASCA) in Crohn’s disease (CD).Methods A total of 67 patients with CD and 30 healthy volunteers as healthy control group were recruited in this study. pANCA was detected by indirect immunofluorescence assay (IIF),ASCA and IL-6 were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA),the sensitivity,specificity and positive predictive value of all CD subtypes were calculated.Results The serum IL-6 in active CD patients was higher than that in remission CD patients and healthy controls (P<0.05),the serum IL-6 was positively related with CD severity. The sensitivities of pANCA had no significant difference between CD group and healthy control group (P>0.05). There were significant differences in the sensitivities of ASCA,ASCA IgA and ASCA IgG between two groups (χ2=16.58,5.69,14.09,P<0.05). ASCA IgA or ASCA IgG detection alone had no significant difference between two methods (P>0.05). Combined detection of IL-6,pANCA with ASCA could improve the sensitivity,specificity and positive predictive value of diagnosis,and cause little impact to positive rate. There was no significant difference in sensitivities of pANCA and ASCA among the subtype groups of CD (P>0.05). Both two antibodies had no clear relativity in the severity of CD.Conclusion The pro-inflammatory cytokines like IL-6 is correlated with CD severity,which is very imperative for diagnosis and clinical appraisal of CD. ASCA is a significant serous antibody for CD and it has certain value for diagnosis,while the diagnostic value of pANCA is finite.

Crohn’s disease; Interleukin-6; Perinuclear antineutrophil cytoplasmic antibodies; Anti-saccharomyces cerevisiae antibodies

王志遠，碩士研究生，研究方向：胃腸疾病。E-mail：wzy03181@163.com

李可，主任醫(yī)師，副教授，研究方向：胃腸及肝膽疾病。E-mail：774525211@qq.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.04.026

R574.62

A

1006-5709(2016)04-0452-05

2015-05-23