任 帥，荊 雷，李 丹，王 研，李異玲

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，遼寧 沈陽(yáng) 110001

論著·非酒精性脂肪性肝病

布拉氏酵母菌在非酒精性脂肪性肝病中的作用研究

任 帥，荊 雷，李 丹，王 研，李異玲

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，遼寧 沈陽(yáng) 110001

目的 探討布拉氏酵母菌在高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)模型中的作用。方法 36只雄性SD大鼠隨機(jī)分成4組，每組9只，1組：對(duì)照組；2組：高脂飲食組(82.5%普通飼料+10%豬油+2%膽固醇+0.5%膽酸鈉+5%蛋黃粉)；3組：布拉氏酵母菌組；4組：高脂飲食+布拉氏酵母菌組。每組分別于第4周、8周、12周處死3只大鼠，進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)和肝臟病理分析。結(jié)果 第8周時(shí)高脂飲食組大鼠體質(zhì)量明顯大于對(duì)照組[(413.67±41.02)gvs(297.80±25.31)g，P<0.05]；高脂飲食組大鼠ALT、AST、TC、TG明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；高脂飲食+布拉氏酵母菌組大鼠體質(zhì)量大于對(duì)照組，但小于高脂飲食組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。第12周時(shí)高脂飲食組大鼠肝臟指數(shù)明顯大于對(duì)照組[(3.455±0.263)%vs(2.609±0.377)%，P<0.05]；高脂飲食組大鼠ALT、AST、TC、TG明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；高脂飲食+布拉氏酵母菌組大鼠ALT、AST、TC、TG低于高脂飲食組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 布拉氏酵母菌可改善NAFLD大鼠的血清學(xué)及肝臟脂肪變性。

非酒精性脂肪性肝??；布拉氏酵母菌；高脂飲食

高脂飲食是非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)的危險(xiǎn)因素之一，伴隨高血脂可促進(jìn)NAFLD的發(fā)生，同時(shí)，高脂飲食可造成腸道菌群紊亂，從而加重肝臟炎癥反應(yīng)，加劇NAFLD[1]。

腸-肝軸學(xué)說(shuō)認(rèn)為腸道改變?cè)贜AFLD發(fā)病過(guò)程中起重要作用。這一學(xué)說(shuō)是由研究人員[2]在建立小鼠小腸細(xì)菌過(guò)量生長(zhǎng)(small intestinal bacterial overgrowth，SIBO)模型時(shí)發(fā)現(xiàn)SIBO小鼠的NAFLD發(fā)病率明顯高于正常小鼠，對(duì)這一現(xiàn)象進(jìn)行深入研究后發(fā)現(xiàn)的。肝和腸有共同胚胎學(xué)起源，流經(jīng)腸道的血液通過(guò)血管進(jìn)入門(mén)靜脈，并流經(jīng)肝臟，所以當(dāng)腸道中菌群發(fā)生改變，腸黏膜被破壞，腸道中細(xì)菌毒素、抗原等物質(zhì)可經(jīng)腸道與肝臟之間的血管系統(tǒng)進(jìn)入肝臟，從而激活肝臟中的Kuffer細(xì)胞等免疫細(xì)胞，促進(jìn)免疫因子的產(chǎn)生及免疫系統(tǒng)的激活，推動(dòng)二次打擊對(duì)肝細(xì)胞的損傷[3]。

腸道在NAFLD中的作用一方面與腸道的通透性相關(guān)，腸黏膜通透性增加導(dǎo)致腸道屏障作用下降，腸道中細(xì)菌毒素經(jīng)門(mén)靜脈系統(tǒng)進(jìn)入肝臟，從而導(dǎo)致肝臟纖維化加劇[4]，另一方面與腸道菌群有關(guān)，當(dāng)使用抑菌藥改善腸道中菌群平衡時(shí)，NAFLD實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝纖維化程度得到明顯改善[5]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)健康雄性SD大鼠36只，初始體質(zhì)量(260±10)g，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物部提供。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境溫度為(20±2)℃，濕度為(50±5)%，實(shí)驗(yàn)前一周將大鼠放置于實(shí)驗(yàn)環(huán)境中，自然晝夜節(jié)律周期，自由進(jìn)食進(jìn)水。實(shí)驗(yàn)主要試劑：億活(布拉氏酵母菌散)(Biocodex，法國(guó))；10%水合氯醛(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)；10%多聚甲醛(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)病理學(xué)研究室)；主要儀器：Leica RM2235石蠟切片(Leica，德國(guó))；光學(xué)顯微鏡(Olympus，日本)；Olympus AU600全自動(dòng)生化分析儀(Olympus，日本)；離心機(jī)(上海醫(yī)用離心機(jī)廠，中國(guó))；精密秤(沈陽(yáng)龍騰電子稱(chēng)量有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠NAFLD模型制備與實(shí)驗(yàn)分組：將36只雄性SD大鼠隨機(jī)分成四組，1組：對(duì)照組(給予普通飼料)；2組：高脂飲食組(82.5%普通飼料+10%豬油+2%膽固醇+0.5%膽酸鈉+5%蛋黃粉)；3組：布拉氏酵母菌組(普通飲食，第4周開(kāi)始使用布拉氏酵母菌灌胃，布拉氏酵母菌散10 mg·kg-1·d-1)；4組：高脂飲食+布拉氏酵母菌組(高脂飲食喂養(yǎng)，第4周開(kāi)始使用布拉氏酵母菌灌胃)，每組9只，第4周、8周、12周各組均處死3只大鼠。

1.2.2 標(biāo)本采集：分別于造模第4周、8周、12周后處死大鼠，采集大鼠血清、肝臟標(biāo)本。大鼠處死前禁食12 h后，10%水合氯醛麻醉(0.3 ml/100 g)，稱(chēng)取大鼠體質(zhì)量。腹主動(dòng)脈取血5～10 ml，使用非抗凝管收集，血液凝固后，4 ℃放置30 min，3 000 r/min離心15 min，取上層血清低溫保存待用。麻醉大鼠，剪開(kāi)腹膜，取肝臟，用冰生理鹽水清洗肝臟，稱(chēng)取肝臟重量，取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm肝臟組織用10%多聚甲醛固定，低溫保存。

1.2.3 觀察指標(biāo)與檢測(cè)方法：觀察大鼠食欲、精神、毛發(fā)情況。測(cè)體質(zhì)量和肝濕重，計(jì)算肝指數(shù)(肝濕重/體質(zhì)量×100%)。使用Olympus AU2700全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)。肝臟病理HE染色，將經(jīng)過(guò)HE染色的肝臟切片置于鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，組間比較采用單因素方差分析，統(tǒng)計(jì)量為F值，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.05。若方差分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義則采用LSD法進(jìn)行兩兩比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況 隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組和布拉氏酵母菌組大鼠食欲佳，皮毛光滑，精神狀態(tài)好。高脂飲食組和高脂飲食+布拉氏酵母菌組大鼠自造模開(kāi)始至第8周食欲亦佳，皮毛光滑，但在造模第8周后食欲尚可，精神逐漸萎靡，皮毛欠光滑。

2.2 各組大鼠體質(zhì)量、肝指數(shù)水平 第4周時(shí)各組大鼠體質(zhì)量、肝指數(shù)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；第8周時(shí)高脂飲食組大鼠體質(zhì)量明顯大于對(duì)照組，高脂飲食+布拉氏酵母菌組大鼠體質(zhì)量大于對(duì)照組，但小于高脂飲食組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。第8周及第12周時(shí)高脂飲食組大鼠肝指數(shù)均明顯大于對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表1)。

2.3 血清學(xué)指標(biāo)測(cè)定 第8周時(shí)高脂飲食組大鼠ALT、AST、TC、TG明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。第12周時(shí)高脂飲食組大鼠AST、ALT、TC、TG明顯高于對(duì)照組，高脂飲食+布拉氏酵母菌組大鼠AST、ALT、TC、TG低于高脂飲食組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);雖高于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見(jiàn)表2)。

表1 各組大鼠體質(zhì)量、肝指數(shù)水平Tab 1 The weight and liver index of rats in each group ±s)

注：與1組相比，*P<0.05；與2組相比，△P<0.05。

2.4 病理組織學(xué)檢測(cè) 肉眼觀察：對(duì)照組與布拉氏酵母菌組大鼠肝臟鮮紅、邊緣銳利、質(zhì)韌；高脂飲食組第8周、12周肝臟體積明顯增大，包膜緊張、邊緣較頓、色偏黃、質(zhì)地略軟、切面油膩；與高脂飲食組相比，高脂飲食+布拉氏酵母菌組大鼠肝質(zhì)變性程度均有不同程度的改善。取肝右葉組織1塊，用于HE染色。對(duì)照組：第4周、8周及12周時(shí)肝細(xì)胞索均以肝小葉中央靜脈為中心呈放射狀排列，匯管區(qū)無(wú)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；高脂飲食組：第4周時(shí)脂肪變肝細(xì)胞占30%，8周時(shí)占60%，第12周時(shí)占80%；布拉氏酵母菌組：第4周、8周及12周時(shí)肝細(xì)胞索均以肝小葉中央靜脈為中心呈放射狀排列，匯管區(qū)無(wú)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；高脂飲食+布拉氏酵母菌組：第4周時(shí)脂肪變肝細(xì)胞占30%，第8周時(shí)占30%，第12周時(shí)占40%～50%(見(jiàn)圖1～4)。

表2 各組大鼠血清學(xué)指標(biāo)±s)Tab 2 Serologocal indicators of rats in each group ±s)

注：與1組相比，*P<0.05；與2組相比，△P<0.05。

圖1 對(duì)照組大鼠肝臟染色(200×) A：4周；B：8周；C：12周Fig 1 Liver staining in the control group (200×) A: 4 weeks; B: 8 weeks; C: 12 weeks

圖2 高脂飲食組大鼠肝臟染色(200×) A：4周；B：8周；C：12周Fig 2 Liver staining in the high fat diet group (200×) A: 4 weeks; B: 8 weeks; C: 12 weeks

圖3 布拉氏酵母菌組大鼠肝臟染色(200×) A：4周；B：8周；C：12周Fig 3 Liver staining in the Saccharomyces boulardii group (200×) A: 4 weeks; B: 8 weeks; C: 12 weeks

圖4 高脂飲食+布拉氏酵母菌組大鼠肝臟染色(200×) A：4周；B：8周；C：12周Fig 4 Liver staining in the high fat diet+Saccharomyces boulardii group (200×) A: 4 weeks; B: 8 weeks; C: 12 weeks

3 討論

NAFLD的發(fā)病機(jī)制主要包括目前被廣泛認(rèn)可的“二次打擊”假說(shuō)[6]及脂質(zhì)代謝紊亂。除上述原因外，腸道菌群異常所致腸道毒素吸收增加也在NAFLD的發(fā)病中占重要地位。B?ckhed等[7]研究發(fā)現(xiàn)，向無(wú)菌小鼠腸道內(nèi)定植正常小鼠的腸道菌群，無(wú)菌小鼠在攝食減少的情況下體質(zhì)量顯著增長(zhǎng)。Torres等[8]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)NAFLD模型小鼠給予雙歧桿菌干預(yù)，小鼠肝損傷程度下降，對(duì)相關(guān)機(jī)制進(jìn)一步研究顯示，雙歧桿菌改善腸道菌群從而降低血中脂多糖水平，并改善胰島素抵抗，從而改善肝纖維化。

布拉氏酵母菌散在上世紀(jì)20年代被開(kāi)發(fā)，1961年正式上市，主要用于抗腸道中毒素，如大腸桿菌脂多糖、霍亂毒素，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡[9]。調(diào)節(jié)腸道菌群是治療NAFLD的治療手段之一，目前主要使用抗生素或益生菌等調(diào)節(jié)腸道菌群[10]。但對(duì)于布拉氏酵母菌治療NAFLD研究較少。

本研究通過(guò)復(fù)制NAFLD大鼠模型，同時(shí)給予布拉氏酵母菌進(jìn)行治療干擾。各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)體質(zhì)量、肝指數(shù)水平、血清學(xué)水平及肝臟病理結(jié)果提示：高脂飲食可導(dǎo)致體質(zhì)量和肝指數(shù)明顯升高，引起肝臟損傷、血脂升高，同時(shí)可導(dǎo)致肝臟脂肪變性。布拉氏酵母菌可改善肝臟損傷、降低血脂水平、肝臟脂肪變性。對(duì)照組和布拉氏酵母菌組實(shí)驗(yàn)結(jié)果與高脂飲食組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)高脂飲食+布拉氏酵母菌組大鼠應(yīng)用布拉氏酵母菌后狀態(tài)良好，無(wú)不良反應(yīng)出現(xiàn)，說(shuō)明億活(布拉氏酵母菌散)對(duì)正常大鼠不存在副作用，具有用藥安全的特點(diǎn)。總之，本實(shí)驗(yàn)成功證實(shí)高脂飲食可以誘導(dǎo)大鼠NAFLD模型，布拉氏酵母菌能夠減輕肝損傷，改善肝臟脂肪變性。

綜上，高脂飲食誘導(dǎo)大鼠NAFLD模型成功；布拉氏酵母菌可改善大鼠NAFLD的血清學(xué)及肝臟脂肪變性。

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(責(zé)任編輯：王全楚)

Effect of Saccharomyces boulardii in non-alcoholic fatty liver disease

REN Shuai,JING Lei,LI Dan,WANG Yan,LI Yiling

Department of Gastroenterology,the First Affiliated Hospital of China Medical University,Shenyang 110001,China

Objective To explore the role of Saccharomyces boulardii in the non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) rats induced by high fat diet. Methods A totol of 36 male SD rats were randomly divided into 4 groups (control group,high fat diet group,Saccharomyces boulardii group,high fat diet+Saccharomyces boulardii group). Three rats were killed in each group at the 4th,8th,12th weeks,serological detection and liver pathological results were analyzed.Results At the 8th week: weight of rats in high fat diet group was obviously higher than that in the control group [(413.67±41.02)gvs(297.80±25.31)g,P<0.05]; ALT,AST,TC,TG in high fat diet group were obviously higher than those in the control group,there was statistically significant (P<0.05); weight of rats in high fat diet+Saccharomyces boulardii group was higher than that in the control group,but lower than that in the high fat diet group (P<0.05). At the 12th week: liver index in the high fat diet group was obviously higher than that in the control group [(3.455±0.263)%vs(2.609±0.377)%,P<0.05];ALT,AST,TC,TG in high fat diet group were significantly higher than those in the control group (P<0.05); ALT,AST,TC,TG in high fat diet+Saccharomyces boulardii group were higher than those in the control group,but lower than those in the high fat diet group (P<0.05). Conclusion Saccharomyces boulardii can improve the serology and hepatic steatosis in rats with NAFLD.

Non-alcoholic fatty liver disease; Saccharomyces boulardii; High fat diet

遼寧省科技廳基金資助項(xiàng)目(2011225015)；沈陽(yáng)市科技廳基金資助項(xiàng)目(F13-220-9-61)；留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)資金資助項(xiàng)目，教外司留([2014]1685號(hào))

任帥，碩士，研究方向：非酒精性脂肪性肝病的基礎(chǔ)與臨床。E-mail：934663287@qq.com

李異玲,博士，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：非酒精性脂肪性肝病的基礎(chǔ)與臨床。E-mail：lyl-72@163.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.04.006

R575.5

A

1006-5709(2016)04-0382-04

2015-09-25