梁鳳萍 鄭其進(jìn) 黎錦亮

自體樹突狀細(xì)胞回輸治療HBeAg陽性慢性乙型病毒性肝炎32例

梁鳳萍 鄭其進(jìn) 黎錦亮

目的 探索自體樹突狀細(xì)胞回輸治療HBeAg陽性慢性乙型病毒性肝炎的療效。方法 32例CHB患者，收集外周血，經(jīng)致敏后制備成熟DC疫苗，分6次回輸(每月1次)，監(jiān)測(cè)并隨訪肝功、病毒標(biāo)志物、HBV DNA及觀察不良反應(yīng)。結(jié)果 27例CHB患者發(fā)生了應(yīng)答，總有效率84.38%，HBsAg轉(zhuǎn)陰率3.13%，HBeAg轉(zhuǎn)陰率68.75%，HBeAb轉(zhuǎn)陽率31.25%，DNA拷貝數(shù)量下降102.87±0.23(P<0.01)，ALT、AST與治療前對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。治療過程中只出現(xiàn)1例不良反應(yīng)。結(jié)論 自體樹突狀細(xì)胞回輸治療HBeAg陽性慢性乙型病毒性肝炎有效且安全。

樹突狀細(xì)胞; HBeAg陽性; 慢性乙型病毒性肝炎

慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)是嚴(yán)重威脅我國(guó)人民健康和生命的傳染病，我國(guó)現(xiàn)有慢性HBV感染者約9300萬例[1]。一般在CHB的標(biāo)本中能檢測(cè)到HBeAg，HBeAg在血行中接觸胸腺，能抑制T細(xì)胞功能，導(dǎo)致HBV復(fù)制活躍，傳染性大。因此，恢復(fù)或增強(qiáng)T細(xì)胞功能成了治療CHB的重點(diǎn)，而具有較強(qiáng)抗原提呈功能的樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DC)可被致敏后誘導(dǎo)成特異性T細(xì)胞，特異性殺傷表達(dá)HBsAg的靶細(xì)胞，特別是HBeAg陽性的表達(dá)HBsAg的靶細(xì)胞，這一功能恰好滿足上述要求。然而，CHB通常表現(xiàn)為DC功能缺陷，發(fā)揮DC強(qiáng)大的主動(dòng)免疫的治療有望成為治療CHB的重要手段之一[2]。本研究收集本院2014年10月～2016年3月32例接受自體DC回輸治療的CHB患者進(jìn)行回顧性分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集本院2014年10月～2016年3月接受自體DC回輸治療的CHB患者32例?；颊吣挲g20～54歲，平均(32±3.3)歲，病程2～10年，平均6.5年，其中男18例，女14例。

1.2 診斷及納入標(biāo)準(zhǔn)

參照《慢性乙型肝炎防治指南》(2015年版)[3]的診斷標(biāo)準(zhǔn)，符合HBsAg(+)，HBeAg(+)，HBV DNA>1.0×105拷貝/ml持續(xù)半年以上，反復(fù)40 U/L

1.3 治療方法

1.3.1 試劑與器材 GT-T551培養(yǎng)基(TAKARA公司)、Ficoll(北京同立海源生物)、PBS(Hyclone)、Human IL-4(peproTech公司)、Human GM-CSF(peproTech公司)、Human TNF-α(peproTech公司)；低溫低速離心機(jī)(Thermo)、倒置顯微鏡(olympus)、二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo)、電動(dòng)移液器(Thermo)。

1.3.2 方法 總方法：采外周血，離心得到單個(gè)核細(xì)胞，即DC前體細(xì)胞，添加重組人粒-巨嗜細(xì)胞集落細(xì)胞刺激因子(rhGM-CSF)、重組人白細(xì)胞介素-4(rhIL-4)行體外擴(kuò)增，鑒別培養(yǎng)7天，經(jīng)HBsAg致敏后獲得成熟的DC。

具體步驟：①采患者抗凝外周血10 ml，離心(2000 rpm×20 min)，收集上層血漿于56 ℃、30 min滅活；②將底層沉淀的血液與PBS按1∶2比例充分混勻后緩慢加入Ficoll分離液離心(2500 rpm×30 min)；③輕輕吸取白霧層細(xì)胞(單個(gè)核細(xì)胞)至另一離心管中，加PBS混勻后離心(1500 rpm×10 min)；④棄上清，加PBS混勻后離心(1200 rpm×10 min)；⑤重復(fù)上一步；⑥棄上清，收集細(xì)胞，加含2%自體血漿GT-T551培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度(2～4)×106個(gè)/ml，接種于培養(yǎng)瓶中，孵育4 h以上；⑦輕輕吸去上層懸浮細(xì)胞，補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基、IL-4(400 U/ml)、GM-CSF(1000 U/ml)。⑧第3天半量換液。⑨第5天去舊培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基、IL-4(400 U/ml)、GM-CSF(1000 U/ml)、TNF-α(800 U/ml)。⑩第7～10天，收獲成熟的DC細(xì)胞(下圖)。

圖1 第7天,顯微鏡100× 圖2 第7天,顯微鏡200×

于第8～11天開始采2 ml DC懸液(DC數(shù)量為(1.0～3.0)×106個(gè))加入10 ml生理鹽水中，于左右腹股溝交替皮下注射。1個(gè)月1次，3次為1療程，共治療2療程，治療前及每療程結(jié)束后復(fù)查肝功能、乙肝兩對(duì)半、乙肝DNA定量并觀察是否出現(xiàn)不良反應(yīng)。隨訪3個(gè)月。

1.4 觀察指標(biāo)

于治療前、每療程結(jié)束后、回輸后3個(gè)月檢測(cè)ALT、AST、HBsAg、HBeAg、抗-HBe、HBV DNA；并觀察不良反應(yīng)的發(fā)生。

1.5 療效評(píng)價(jià)

參照《慢性乙型肝炎防治指南》(2015年版)[3]：

①完全應(yīng)答(顯效)：ALT、AST恢復(fù)正常，HBsAg、HBeAg及HBV-DNA 轉(zhuǎn)陰。

②部分應(yīng)答(有效)：ALT、AST恢復(fù)正常，HBsAg無變化，出現(xiàn)HBeAg/抗-HBe血清轉(zhuǎn)換及HBV-DNA下降 50%。

③無應(yīng)答(無效)：治療前后無明顯變化。

④病毒反跳(復(fù)發(fā))：HBV DNA轉(zhuǎn)陰后又升高>1.0×105拷貝/ml，伴有或不伴有ALT升高。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各時(shí)間段肝功能指標(biāo)變化

見表1。

表1 各時(shí)間段肝功能指標(biāo)變化 ±s,U/L)

注：與治療前對(duì)比，1)P>0.05，2)P值<0.05，3)P<0.01；1)P>0.05，2)P值<0.05，3)P<0.01

由表1得知，ALT與AST于第2療程始與治療前對(duì)比P值<0.05，特別是回輸后第3月與治療前對(duì)比P<0.01，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明自體DC回輸對(duì)CHB患者肝功有改善作用。

2.2 各時(shí)間段病毒血清標(biāo)志物的變化

見表2。

表2 各時(shí)間段病毒血清標(biāo)志物的變化 n(%)

表2顯示回輸后各監(jiān)測(cè)時(shí)間CHB患者的病毒血清標(biāo)志物逐漸出現(xiàn)應(yīng)答，其中回輸后第3個(gè)月，HBsAg轉(zhuǎn)陰1例，HBeAg轉(zhuǎn)陰22例，HBeAb轉(zhuǎn)陽10例。

2.3 各時(shí)間段HBV DNA的變化

見表3。

nDNA定量治療前326.12±1.03第1療程325.36±1.101)第2療程323.38±0.372)回輸后第3月322.87±0.233)

注：與治療前對(duì)比，1)P>0.05，2)P<0.05，3)P<0.01

表3可見接受自體DC回輸后各時(shí)間段的HBV DNA水平逐漸下降，與治療前對(duì)比P<0.05，其中回輸后第3月與治療前對(duì)比P<0.01，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，可知自體DC回輸能逐漸降低CHB患者的HBV DNA量。

2.4 回輸后療效評(píng)價(jià)

見表4。表5顯示回輸DC隨訪3個(gè)月后進(jìn)行療效跟蹤及評(píng)價(jià)，可知隨訪結(jié)束后有應(yīng)答(完全應(yīng)答+部分應(yīng)答)27例，總有效率達(dá)84.38%。其中所有病例中并未出現(xiàn)復(fù)發(fā)現(xiàn)象。

表4 回輸后療效評(píng)價(jià) n(%)

2.5 不良反應(yīng)記錄

于第一療程的第二次回輸后出現(xiàn)1例發(fā)熱病例，當(dāng)時(shí)最高體溫37.8℃，無其余不適，查血尿常規(guī)、腎功能等正常，未予處理，觀察12小時(shí)后體溫逐漸降至正常。下次回輸未見明顯不適直至完成2療程。

3 討論

乙型肝炎病毒(HBV)屬少見的嗜肝DNA病毒科，主要經(jīng)血液(如不安全注射等)、母嬰及性接觸傳播，其中母嬰傳播是造成HBV慢性化的最主要原因，因此，嬰幼兒接種乙肝疫苗能有效控制CHB的傳播[4]。HBV感染呈世界性流行，與肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌的發(fā)生密切相關(guān)[5]。分免疫耐受期、免疫清除期、非活動(dòng)或低(非)復(fù)制期和再活動(dòng)期。其中，免疫耐受期-免疫清除期通常表現(xiàn)為ALT、AST的升高、HBsAg和HBeAg陽性、HBV DNA拷貝數(shù)量大于105～107，為進(jìn)行有針對(duì)性的免疫治療的重要的過渡期，有效的治療可很好的抑制病毒復(fù)制、延緩疾病進(jìn)程。目前治療方法要包括抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗炎和抗氧化、抗纖維化等治療，其中保肝、抗病毒治療是關(guān)鍵，但保肝藥在臨床選擇上越來越具趨向性，療效顯著的為首選，但價(jià)格昂貴[6]；但抗病毒藥物不良反應(yīng)較大且療程長(zhǎng)，在臨床工作弊端逐漸暴露。目前，免疫療法逐漸得到青睞，有望成為治療CHB的重要新手段。

樹突狀細(xì)胞(DC)起源于CD34+造血祖細(xì)胞，是具有最強(qiáng)大的專職抗原提呈細(xì)胞(anti-gen-pressenting cell，APC)。DC在體內(nèi)數(shù)量較少，外周血中DC更不足PBMc的1%，但它有著較強(qiáng)的遷移能力及攝取、加工抗原能力，再者，成熟的DC能有效激活初始型T淋巴細(xì)胞，并能啟動(dòng)、調(diào)控并維持免疫應(yīng)答。肝臟中的DC主要位于中央靜脈和門脈區(qū)，含量極少，約占人體內(nèi)總DC的10%[7]。DC在CHB發(fā)病過程中起著重要作用，在早期免疫中，成熟的DC啟動(dòng)體液免疫和特異性抗原細(xì)胞免疫；在適應(yīng)性免疫中，DC細(xì)胞首先識(shí)別抗HBV免疫，將處理后的多肽呈遞給CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞，從而抑制或清除肝細(xì)胞內(nèi)HBV或通過特異性細(xì)胞毒作用直接殺傷靶細(xì)胞。據(jù)研究表明，CHB 患者體內(nèi)DC數(shù)量和功能的缺陷可能是長(zhǎng)期處于帶毒狀態(tài)的機(jī)制之一[8]。因此，恢復(fù)DC細(xì)胞的功能或刺激DC細(xì)胞發(fā)揮強(qiáng)大的抗原呈遞功能，直接或間接地抑制HBV復(fù)制是至今免疫療法的思路之一。

鑒于DC的強(qiáng)大功能，較多學(xué)者進(jìn)行了DC疫苗制備的研究，目前多采用外周血離心分離，并經(jīng)致敏后誘導(dǎo)，控制DC成熟狀態(tài)，從而得到合適的DC疫苗。此技術(shù)逐漸成熟、簡(jiǎn)單易行，使得DC疫苗成為新一代治療性疫苗的代表，在腫瘤免疫、乙肝免疫、移植免疫等領(lǐng)域中發(fā)揮著重要作用[9-10]。本研究通過CHB患者外周血提取DC細(xì)胞并回輸，即用自體DC疫苗治療CHB，結(jié)果顯示在肝功能變化方面，ALT、AST逐漸改善或無進(jìn)行性升高，甚至恢復(fù)正常；在病毒標(biāo)志物變化方面，HBsAg轉(zhuǎn)陰出現(xiàn)1例，HBeAg轉(zhuǎn)陰22例，HBeAb轉(zhuǎn)陽10例；在HBV DNA變化方面亦顯示出較高的陰轉(zhuǎn)率；整過研究過程中，不良反應(yīng)少見，只于第1療程發(fā)生1例發(fā)熱，體溫37.8℃，未經(jīng)處理12小時(shí)內(nèi)降至正常，未對(duì)其后回輸造成中斷或影響，安全性較高。綜上，32例CHB患者研究中，完全應(yīng)答率為3.13%，部分應(yīng)答率為81.25%，無應(yīng)答為15.63%，病毒反跳為0，表明自體DC回輸治療CHB有良好效果。

對(duì)于本研究，存在以下不足：隨訪時(shí)間不足，后續(xù)病情及不良反應(yīng)不明確；尚未制定進(jìn)一步治療方案；未明確HBeAg陰性CHB患者適用價(jià)值；回顧性分析，難以設(shè)定對(duì)照組。等等。隨著DC的研究逐漸深入、透徹，DC的利用方式越充分及價(jià)值越高，DC疫苗的制備技術(shù)逐漸成熟，利用DC疫苗防治CHB以后必然有著不可或缺的地位。

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R512.6+2

A

10.3969/j.issn.1671-332X.2016.10.012

梁鳳萍 鄭其進(jìn) 黎錦亮 ： 廣州中醫(yī)藥大學(xué)祈福醫(yī)院 廣東廣州 510000