任鵬程， 劉 暢， 邱先迪， 陳偉杰， 殷躍輝

(重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院心內科， 重慶 400010)

經導管射頻消融去腎交感神經術對犬腎臟水通道蛋白的影響*

任鵬程， 劉 暢， 邱先迪， 陳偉杰， 殷躍輝△

(重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院心內科， 重慶 400010)

目的： 研究經導管射頻消融去腎交感神經術(renal denervation，RDN)對腎臟水通道蛋白(aquapo-rins,AQP)的影響。方法: 選用昆明犬12只，隨機分為對照組和消融組，每組6只。消融組采用射頻導管消融雙側腎動脈，對照組僅將射頻導管送達腎動脈但不消融。術后1月，檢測2組犬腎臟去甲腎上腺素濃度、腎臟皮質和髓質AQP水平,以及血壓的變化。結果: 術后1月，消融組腎臟去甲腎上腺素濃度明顯低于對照組(P<0.01)，消融組腎臟皮質和髓質AQP1～3的表達均低于對照組。相比術前，術后收縮壓和舒張壓也出現(xiàn)明顯下降(P<0.05)。結論: RDN能降低犬腎臟交感神經活性,并抑制腎臟AQP的表達，這或許是RDN降血壓的機制之一。

腎交感神經； 射頻導管消融； 去甲腎上腺素； 水通道蛋白； 犬

目前盡管高血壓的確切發(fā)病機制尚不清楚，但交感神經系統(tǒng)的激活、腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system,RAS)的激活和腎性水鈉潴留等機制參與高血壓的發(fā)病被大家所認可。經導管射頻消融去腎交感神經術(renal denervation，RDN)通過消融腎動脈周圍的腎臟傳入和傳出神經，能有效降低全身交感神經系統(tǒng)活性和RAS活性，在治療難治性高血壓和改善心功能上取得一定效果[1-2]。但關于RDN對機體水鈉潴留影響的實驗研究卻未見報道。作為腎臟重吸收和調節(jié)體內水平衡的通道，水通道蛋白(aquaporins，AQP)表達的改變直接影響腎臟對水的重吸收變化，實驗證明，水通道蛋白表達異常與高血壓、心力衰竭、慢性腎功能不全等多種水平衡紊亂疾病相關[3-5]。本實驗擬初步探討RDN對腎臟水通道蛋白的影響，為探索RDN的降壓機制提供新的實驗依據。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

采用中國成年昆明犬12只，體重30～35 kg，收縮壓140 mmHg以上。隨機抽取6只進入消融組，行腎動脈射頻消融術；另外6只作為對照組，僅將射頻導管送達腎動脈處而不消融。所有實驗均通過重慶醫(yī)科大學動物實驗倫理委員會批準，并嚴格執(zhí)行國家衛(wèi)計委關于實驗動物的飼養(yǎng)原則。

2 實驗方法

2.2 隨訪評價及標本獲取 術后定期觀察犬一般情況。術后1月，通過股動脈入路測量血壓,并行雙側腎動脈造影。隨訪完畢，大劑量麻醉劑處死實驗犬，獲取腎臟并立即處理，一部分腎組織分裝于液氮中，另一部分用4%多聚甲醛固定備用。

2.3 高效液相色譜法檢測去甲腎上腺素 將冰凍的腎臟組織塊用5%的高氯酸和1.5 mol/L的醋酸鈉勻漿，然后在4 ℃、10 000×g的條件下離心10 min。采用高效液相色譜(HTTACHI)法檢測腎臟組織去甲腎上腺素濃度。

2.4 Western blot實驗 從冰凍腎臟上分別取皮質部分和髓質部分，然后按如下方法檢測水通道蛋白。取100 mg相應組織于勻漿器中，加入裂解液和PMSF，在冰上勻漿10 min，然后4 ℃、12 000×g條件下離心10 min，并吸取上清液，以BCA法測定蛋白濃度，然后加入1/4體積的5×SDS緩沖液，以100 ℃加熱10 min備用。檢測蛋白，腎臟皮質蛋白每孔泳道上樣120 μg，腎臟髓質蛋白每孔泳道上樣80 μg，然后用5%濃縮膠和10%分離膠行SDS-PAGE。以250 mA恒流條件將蛋白轉移至二氟化聚乙烯(polyvinylidence difluoride，PVDF)膜上。用5%的脫脂奶粉封閉1 h，然后I抗(兔抗AQP1、AQP2和AQP3多克隆抗體，Santa Cruz)孵育，4 ℃過夜。用PBST洗滌 10 min ×3次。II抗孵育，37 ℃、1 h。再用PBST洗滌10 min×3次。然后加入Western blot實驗熒光顯影劑顯影，并用Quantity One凝膠系統(tǒng)掃描圖像并分析。

2.5 免疫組化實驗 按照免疫組化檢測試劑盒和濃縮型DAB 顯色試劑盒(北京中杉金橋)說明書方法，腎臟組織石蠟切片脫蠟，洗滌，以3% H2O2室溫下孵育10 min，然后加入枸櫞酸鈉溶液，采用微波修復10 min，用血清室溫孵育30 min，加I 抗(兔抗AQP1和AQP2多克隆抗體，Santa Cruz)4 ℃孵育過夜，然后加入II 抗37 ℃孵育45 min，以親和素-生物素復合物室溫孵育60 min，以DAB 顯色，蘇木素復染，遂脫水，透明，封片，光學顯微鏡下觀察。

3 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析處理。所有數(shù)據以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。若數(shù)據滿足方差齊性，組間數(shù)據采用獨立樣本t檢驗，組內實驗前后數(shù)據采用配對樣本t檢驗。若數(shù)據不滿足方差齊性，采用Satterthwaite近似t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 腎臟組織內去甲腎上腺素水平的變化

看著老婆那亂改古訓蠻不講理的樣子，我只得說，我不是當官了嗎？堂堂的縣農業(yè)局副局長，副科級，月薪2358塊。

RDN術后1月，消融組犬腎臟組織去甲腎上腺素水平明顯低于對照組(P<0.01)。

2 腎臟組織內AQP1、AQP2和AQP3 表達的變化

2.1 Western blot實驗結果 RDN術后1月，消融組腎皮質和髓質AQP1的表達均明顯低于對照組(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.The effect of RDN on the expression of AQP1 in the kidney of dogs detected by Western blot. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

圖1 Western blot 實驗檢測AQP1的表達

RDN術后1月，消融組腎髓質AQP2表達低于對照組(P<0.01)，而腎皮質AQP2的表達兩組間差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖2。

Figure 2.The effect of RDN on the expression of AQP2 in the kidney of dogs detected by Western blot. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol.

圖2 Western blot 實驗檢測AQP2的表達

消融組腎髓質AQP3的表達低于對照組(P<0.05)，而腎皮質AQP3兩組間差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖3。

Figure 3.The effect of RDN on the expression of AQP3 in the kidney of dogs detected by Western blot. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol.

圖3 Western blot 實驗檢測AQP3的表達

2.2 免疫組化結果 AQP1主要分布在腎皮質的近端小管和髓質的細段，在皮質近端小管，消融組AQP1的表達低于對照組(P<0.05)；在髓質細段，消融組AQP1的表達也低于對照組(P<0.01)，見圖4。

Figure 4.AQP1 immunoreactivity in the renal proximal tubule (A) and the thin limb of Henle’s loop (B) in control group and RDN group (×1 000).

圖4 免疫組化檢測對照組和實驗組腎臟皮質和髓質AQP1的表達

AQP2主要分布于腎皮質和髓質的集合管管腔側細胞膜，在髓質集合管，消融組AQP2的表達明顯低于對照組(P<0.01)；而在皮質集合管，消融組AQP2的表達與對照組相比無統(tǒng)計學差異，見圖5。

Figure 5.AQP2 immunoreactivity in the cortical collecting duct (A) and the medullary collecting duct (B) in control group and RDN group (×1 000).

圖5 免疫組化檢測對照組和實驗腎臟皮質和髓質AQP2的表達

3 血壓的變化及術后血管評價

射頻消融后1月，相比基線血壓值，消融犬收縮壓和舒張壓均出現(xiàn)明顯下降(P<0.05)。在RDN術前、術后即刻和術后4周，行腎動脈造影未見動脈瘤或血管狹窄等手術并發(fā)癥，見圖6。

Figure 6.The results of angiography before (A), immediately after (B), and one month after (C) RDN.

圖6 實驗組射頻消融術前、術后即刻和術后1月腎動脈造影觀察

討 論

在本實驗中，是否有效損毀腎臟交感神經是RDN發(fā)揮作用的基礎，而且腎臟組織內去甲腎上腺素濃度是評價腎臟交感神經活性變化的經典指標[6]。Krum等[7]對小豬行RDN，術后腎臟組織去甲腎上腺素下降幅度超過85%，其對腎臟交感神經抑制程度與切斷腎動脈再縫合手術對腎臟交感活性的作用相當。本研究通過高效液相色譜法對腎組織內去甲腎上腺素濃度進行了檢測，結果表明，消融組犬腎組織去甲腎上腺素水平明顯低于對照組。

本實驗首次觀察到射頻消融腎交感神經后腎臟AQP表達下調，表明腎交感神經的激活對腎臟AQP的表達有促進作用。關于腎交感神經促進腎臟AQP表達的具體機制目前尚不清楚，但本實驗檢測到RDN術后腎組織內去甲腎上腺素水平明顯下降，且Sonalker等[8]證實去甲腎上腺素能直接促進腎小管AQP的表達，故可以推測腎交感神經激活后，通過調節(jié)去甲腎上腺素的釋放，發(fā)揮其促進腎臟AQP表達的作用。由于腎交感神經還可促進RAS的激活，使血管緊張素II(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)表達上調，而實驗證明Ang II也具有增強腎臟AQP表達的作用[9-10]。我們前期的實驗也證實了RDN術后血漿Ang II活性明顯下降[11]，所以腎交感神經激活后，通過RAS間接促進Ang II的合成，或許也是腎臟AQP表達增加的機制之一。

腎交感神經促進腎臟AQP表達增加，可解釋高血壓、心衰等高交感活性疾病中所觀察到的體液儲留和AQP表達增加[3-4]。腎交感神經激活，通過增強腎小管和集合管AQP對水的重吸收，參與高血壓和心衰等疾病的發(fā)生發(fā)展，此研究結果為RDN在高血壓、心力衰竭、慢性腎功能不全等更多水儲留疾病的應用提供了依據。RDN降低腎臟交感活性，不但使腎臟AQP表達下調，同時也伴隨血壓的下降，表明AQP表達下調也許與RDN的降壓機制有關。

本實驗尚發(fā)現(xiàn)，RDN使腎髓質AQP1、AQP2和AQP3表達下降，而腎皮質僅AQP1表達下降，表明腎髓質水通道蛋白對腎交感神經的調節(jié)更為敏感。這一結果與Lee等[12]采用苯酚損毀大鼠腎交感神經時發(fā)現(xiàn)的結果基本一致，這或許與各水通道蛋白亞型在腎臟皮質、髓質不同結構的差異性表達及腎臟皮、髓質不同結構間的功能差異有關[13]，但其具體機制有待進一步研究。

由于本實驗選擇的動物為大型昆明犬，其實驗結果并不能完全代表人體情況。同時本實驗只在RDN術后4周取標本檢測指標，未能觀察更長期的實驗結果。在今后的實驗中將延長實驗觀察期，為RDN對水通道蛋白的長期調節(jié)及降壓機制提供實驗依據。

綜上所述，腎交感神經激活通過調節(jié)去甲腎上腺素和AngII的釋放，對腎臟水通道蛋白的表達起促進作用。RDN能降低犬腎臟交感神經活性,并抑制腎臟水通道蛋白的表達，這或許是RDN降血壓的機制之一。

[1] Paulis L, Unger T. Novel therapeutic targets for hypertension[J]. Nat Rev Cardiol, 2010, 7(8):431-441.

[2] Esler MD, Krum H, Sobotka PA, et al. Renal sympathetic denervation in patients with treatment-resistant hypertension (The Symplicity HTN-2 Trial): a randomised controlled trial[J]. Lancet, 2010, 376(9756):1903-1909.

[3] Lee J, Kim S, Kim J, et al. Increased expression of renal aquaporin water channels in spontaneously hypertensive rats[J]. Kidney Blood Press Res, 2006, 29(1):18-23.

[4] Xu DL, Martin PY, Ohara M, et al. Upregulation of aquaporin-2 water channel expression in chronic heart fai-lure rat[J]. J Clin Invest, 1997, 99(7):1500-1505.

[5] Kim SW, Yeum CH, Kim S, et al. Amphotericin B decreases adenylyl cyclase activity and aquaporin-2 expression in rat kidney[J]. J Lab Clin Med, 2001, 138(4):243-249.

[6] Sakakura K, Ladich E, Edelman ER, et al. Methodological standardization for the pre-clinical evaluation of renal sympathetic denervation[J]. JACC Cardiovasc Interv, 2014, 7(10):1184-1193.

[7] Krum H, Schlaich M, Sobotka P, et al. Catheter-based renal sympathetic denervation for resistant hypertension: a multicentre safety and proof-of-principle cohort study[J]. Lancet, 2009, 373(9671):1275-1281.

[8] Sonalker PA, Tofovic SP, Bastacky SI, et al. Chronic noradrenaline increases renal expression of NHE-3, NBC-1, BSC-1 and aquaporin-2[J]. Clin Exp Pharmacol Physiol, 2008, 35(5-6):594-600.

[9] Bouley R, Palomino Z, Tang SS, et al. Angiotensin II and hypertonicity modulate proximal tubular aquaporin 1 expression[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2009, 297(6):F1575-F1586.

[10]Wintour EM, Earnest L, Alcorn D, et al. Ovine AQP1: cDNA cloning, ontogeny, and control of renal gene expression[J]. Pediatr Nephrol, 1998, 12(7):545-553.

[11]Lu J, Ling Z, Chen W,et al. Effects of renal sympathetic denervation using saline-irrigated radiofrequency ablation catheter on the activity of the renin-angiotensin system and endothelin-1[J]. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst, 2014, 15(4):532-539.

[12]Lee J, Yoo K, Kim SW, et al. Decreased expression of aquaporin water channels in denervated rat kidney[J]. Nephron Physiol, 2006, 103(4):170-178.

[13]Nielsen S, Kwon TH, Fr?kir J, et al. Regulation and dysregulation of aquaporins in water balance disorders[J]. J Intern Med, 2007, 261(1):53-64.

(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

清除老年癡呆癥小鼠小膠質細胞可以防止神經元丟失但并不調節(jié)β-淀粉樣蛋白的病理改變

除了β-淀粉樣蛋白斑和tau蛋白過度磷酸化引起的神經元纖維纏結外，神經炎癥被認為是阿爾茨海默病(Alzheimer disease, AD)的另一個重要病理特征。炎癥在阿爾茨海默氏病的特征性表現(xiàn)為反應性星形膠質細胞和活化的小膠質細胞在淀粉樣蛋白斑周圍聚集，提示活化的小膠質細胞在疾病的發(fā)病機制中發(fā)揮了作用。在健康成年小鼠，小膠質細胞的生存依賴于集落刺激因子1受體(colony-stimulating factor 1 receptor, CSF1R)的信號，這種受體的調節(jié)使得中樞神經系統(tǒng)的通過藥理學抑制作用可以快速清除幾乎所有的小膠質細胞。為了確定是否阿爾茨海默病大腦中慢性小膠質細胞激活也依賴于CSF1R信號，如果是，那么這些細胞是如何在疾病的發(fā)病機制中發(fā)揮作用的，Spangenberg等選擇了10月齡的5xfAD小鼠，給予選擇性CSF1R抑制劑處理1個月，結果顯示80%的小膠質細胞得以清除。慢性小膠質細胞清除并不改變β-淀粉樣蛋白的水平或斑塊沉積，但它確實降低了5xfAD小鼠樹突的損失和防止了神經元的丟失，同時在整體上減輕了神經炎癥。重要的是，行為學測試表明小鼠的記憶功能得到改善?？偟膩碚f，這些研究結果表明，清除小膠質細胞在防止神經元的丟失以及改善5xfAD小鼠記憶障礙方面發(fā)揮了作用，但它并不調節(jié)或改變β-淀粉樣蛋白的病變。

Brain, 2016, 139(Pt 4):1265-1281(范沖竹)

Effect of renal denervation by radiofrequency catheter ablation on expression of aquaporins in dog kidneys

REN Peng-cheng, LIU Chang, QIU Xian-di, CHEN Wei-jie, YIN Yue-hui

(DepartmentofCardiology,TheSecondAffiliatedHospital,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400010,China.E-mail:yinyh63@163.com)

AIM: To investigate the effect of renal denervation (RDN) by radiofrequency catheter ablation on the expression of aquaporins (AQP) in dog kidneys.METHODS: Adult Chinese Kunming dogs (n=12) were randomly divided into RDN group and control group (6 for each group). The dogs in RDN group underwent bilateral RDN using radiofrequency catheter ablation, and radiofrequency catheter was positioned in bilateral renal artery without ablation in control group. The levels of norepinephrine (NE) and AQP1～3 in the renal tissues were detected 1 month after RDN, and blood pressure (BP) measurements were performed at baseline and 1 month after RDN.RESULTS: The level of NE in RDN group was significantly lower than that in control group (P<0.01). The expression of AQP1～3 in the renal cortex and medulla was lower in RDN group than that in control group. RDN also caused a substantial BP reduction (P<0.05). CONCLUSION: RDN substantially decreases the tissue levels of NE and AQP in dog kidneys, and also decreases BP significantly, which might be involved in the mechanism of BP reduction by RDN. Renal sympathetic nerve plays an excitatory role in the regulation of AQP in the kidney.

Renal sympathetic nerve; Radiofrequency catheter ablation; Norepinephrine; Aquaporins; Dogs

1000- 4718(2016)08- 1430- 05

2016- 03- 07

2016- 05- 11

重慶市科委自然科學基金資助項目(No. cstc2013jcyjA10066)

R454.1； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.08.015

雜志網址： http://www.cjpp.net

△通訊作者 Tel: 023-63693065； E-mail: yinyh63@163.com