唐 輝， 肖仔君， 蔣鑫煒， 郭紅輝△

(1韶關學院英東食品科學與工程學院，廣東 韶關 512005；2中山大學公共衛(wèi)生學院，廣東 廣州 510080)

高糖應激促脂肪變性肝細胞凋亡的線粒體機制*

唐 輝1， 肖仔君1， 蔣鑫煒2， 郭紅輝1△

(1韶關學院英東食品科學與工程學院，廣東 韶關 512005；2中山大學公共衛(wèi)生學院，廣東 廣州 510080)

目的： 探討高糖應激對脂肪變性肝細胞凋亡的作用及其可能機制。方法: C57BL/6J小鼠飼喂高脂飼料6周后，采用肝臟原位灌注技術分離得到脂肪變性原代肝細胞，在含有35 mmol/L葡萄糖的高糖DMEM培養(yǎng)基中孵育12 h，以正常DMEM培養(yǎng)基(添加30 mmol/L甘露醇)孵育的細胞作為對照，觀察高糖處理對脂肪變性肝細胞活力、線粒體膜電位、凋亡蛋白酶caspase活性及凋亡相關信號通路的影響。結果: 高糖應激使脂肪變性肝細胞活力下降，凋亡顯著增加，而等滲甘露醇處理的對照細胞沒有明顯變化。高糖組細胞出現(xiàn)較為嚴重的線粒體去極化，導致線粒體膜電位降低，細胞色素C釋放增多。線粒體介導凋亡關鍵酶caspase-9和caspase-3活性在高糖組有顯著升高，抑制凋亡因子Bcl-2和Bcl-xL表達量明顯降低，促凋亡蛋白Bax水平顯著升高，而感受外源性凋亡信號的caspase-8的活性沒有明顯變化。結論: 高糖應激會導致脂肪變性肝細胞線粒體膜電位下降，啟動線粒體介導的內源性凋亡途徑，引起肝細胞凋亡。這可能是高血糖加速非酒精性脂肪性肝病病程進展的一個重要原因。

肝細胞； 線粒體； 高糖應激； 細胞凋亡； 非酒精性脂肪性肝病

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是目前最為常見的慢性肝病，包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)、NASH相關肝纖維化和肝硬化等4個病程階段。單純性脂肪肝患者往往無機體不適癥狀，預后良好，而一旦進展為NASH，就會出現(xiàn)不可逆的肝損傷，如肝細胞氣球樣變性、炎癥甚至凋亡，加速病程進展[1]。最近的研究表明，糖耐量異常所致的空腹血糖水平升高是單純性脂肪肝向NASH轉變的一個危險因素[2]，然而其中的病理生理機制尚未明確。高血糖會促進肝細胞內的脂質合成，干擾脂肪酸進行β氧化，可能引起線粒體功能障礙和細胞凋亡[3]。本研究首先利用高脂飲食喂養(yǎng)建立NAFLD小鼠模型，分離原代脂肪變性肝細胞，觀察體外高糖孵育對其活力、線粒體功能和凋亡相關信號通路的影響，以期明確高糖應激引起脂肪變性肝細胞凋亡，促進單純性脂肪肝向NASH進展的作用機制，為NAFLD的早期干預提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 動物和細胞

SPF級C57BL/ 6J小鼠，雄性，6～8周齡，18～20 g，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，飼養(yǎng)在中山大學公共衛(wèi)生學院SPF動物房[12 h晝夜交替，溫度(22 ± 2)℃]。喂飼小鼠脂肪供能比為45%的高脂飼料(江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司)，6周后，采用改良兩步原位灌流法分離原代肝細胞[4]，油紅O染色觀察細胞內脂肪積聚情況，臺盼藍染色確認細胞存活率≥95%，按2.5×105密度接種于6孔培養(yǎng)板，低糖DMEM(葡萄糖濃度5 mmol/L)培養(yǎng)基、37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后進入實驗，細胞分為3組：對照(control)組，低糖DMEM繼續(xù)培養(yǎng)；甘露醇(mannitol)組，DMEM培養(yǎng)基加入30 mmol/L甘露醇，與高糖組的培養(yǎng)基滲透勢相當；高糖(high-glucose, HG)組，培養(yǎng)基葡萄糖濃度調高至35 mmol/L。各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)12 h。

2 主要試劑

低糖DMEM細胞培養(yǎng)基、小牛血清和抗生素混合物購自廣州英韋創(chuàng)津生物科技有限公司；I 抗購自Santa Cruz和CST；II抗由武漢博士德生物工程有限公司提供；熒光探針JC-1和Hoechst 33258購自Molecular Probes；胰酶、膠原蛋白酶Ⅰ、臺盼藍購自Sigma；MTT細胞活力檢測試劑盒、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)細胞毒性檢測試劑盒和BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；其它試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。

3 主要方法

3.1 細胞活力和毒性測定 將細胞移入96孔板，每孔加入MTT(5.0 g/L)50 μL、置入培養(yǎng)箱孵育4 h，離心棄上清，加入二甲基亞砜200 μL，酶標儀測定570 nm處各孔吸光度值，評價細胞存活率。細胞處理期間釋放的乳酸脫氫酶作為細胞毒性的標志，將細胞培養(yǎng)板500×g離心5 min，取10 μL到96孔酶標板，加入反應液25 ℃避光反應30 min，終止反應，在酶標儀490 nm處讀數(shù)。以低糖組細胞作為參照，計算其它2組的細胞相對存活率和毒性。

3.2 細胞凋亡檢測 利用能夠直接和凋亡細胞DNA結合的熒光染料Hoechst 33258染色區(qū)分正常細胞和凋亡細胞。將培養(yǎng)板中的細胞用甲醇/丙酮溶液固定5 min，PBS緩沖液清洗3遍，加入10 μmol/L Hoechst 33258染色30 min，在TE2000熒光顯微鏡(Nikon)下(激發(fā)光350 nm，吸收光460 nm)觀察細胞核染色質形態(tài)。凋亡細胞染色質高度濃縮，發(fā)出較強的藍色熒光。隨機統(tǒng)計5個視野內凋亡細胞占總細胞的比例。

3.3 線粒體膜電位檢測 采用JC-1熒光探針在細胞內的紅/綠熒光強度比例來衡量線粒體去極化程度[5]。細胞培養(yǎng)基內加入2.0 mg/L JC-1在37 ℃孵育30 min，熒光顯微鏡下觀察拍照，并在熒光酶標儀分別測定紅色熒光(激發(fā)光580 nm，吸收光590 nm)和綠色熒光(激發(fā)光510 nm，吸收光527 nm)強度，計算二者的比值表示線粒體膜電位的變化情況。

3.4 細胞凋亡蛋白酶活性測定 采用Abcam提供的酶法試劑盒分別測定細胞內3種含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase-3、-8和-9)的活性。取50 μL細胞裂解液，加入5 μL相應四肽標記底物和50 μL反應液于96孔酶標板，37 ℃避光孵育30 min，405 nm處測定對硝基苯胺的生成量來表示酶活性大小，同時測定細胞裂解液蛋白質濃度校準酶活性。

3.5 Western blotting實驗 利用Enzo Life Sciences的試劑盒分別提取細胞質和線粒體蛋白質，調整蛋白質濃度后進行電泳、轉膜、封閉、孵育I抗和II抗，使用Santa Cruz光化學發(fā)光試劑顯影，β-actin和細胞色素C氧化酶Ⅳ(cytochrome C oxidase Ⅳ,CoxⅣ)分別作為內參照，Quantity One軟件分析蛋白條帶灰度值表示蛋白質表達量。

4 統(tǒng)計學處理

用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 高糖對脂肪變性肝細胞活力的影響

油紅O染色結果顯示，與普通飼料喂養(yǎng)小鼠肝細胞相比，高脂喂養(yǎng)小鼠肝細胞體積增大，胞內有較多脂滴積聚，符合NAFLD單純性脂肪肝階段的病理特征。高脂喂養(yǎng)小鼠分離的肝細胞在經(jīng)過高糖培養(yǎng)基孵育12 h后，其細胞活力較生理濃度葡萄糖培養(yǎng)基孵育的對照組細胞有明顯下降，且細胞釋放的LDH增多了1.6倍。甘露醇組細胞的活力與對照組沒有顯著差異，LDH的釋放也沒有增多，說明高糖帶給細胞的毒性不是由于培養(yǎng)基高滲透勢造成的，見圖1。

Figure 1.High glucose-induced cytotoxicity in primary hepatocytes isolated from high-fat diet fed mice. Oil red O staining for hepatocytes isolated from chow (A) or high-fat (B) diet fed mice (×200). The cell viability (C) and LDH release (D) were assessed. Mean±SEM.n=4.*P<0.05vscontrol group.

圖1 高糖對脂肪變性肝細胞的影響

2 高糖促進細胞凋亡

為明確高糖能否引起脂肪變性肝細胞凋亡，我們利用Hoechst 33258對細胞核進行了染色。高糖組出現(xiàn)了較多的染色質著色亮斑。統(tǒng)計結果顯示，高糖組細胞的凋亡率顯著高于對照組和甘露醇組(P<0.05)，見圖2。

3 高糖對細胞線粒體膜電位的影響

正常細胞線粒體膜電位較高，結合的JC-1探針發(fā)出紅色熒光，當線粒體膜去極化以后，電位降低，綠色熒光增強[5]。合并的熒光圖顯示，高糖組細胞的紅色熒光要弱于對照組和甘露醇組。進一步用熒光酶標儀測定結果確認，高糖處理使細胞線粒體紅色熒光與綠色熒光的比值顯著降低(P<0.05)，說明線粒體膜電位降低，膜的完整性受到破壞，見圖3。

4 高糖對細胞凋亡蛋白酶活性的影響

各組細胞感受外源性凋亡信號的caspase-8活性相當，而內源性凋亡途徑，即線粒體介導凋亡關鍵酶caspase-9和caspase-3活性在高糖組有顯著升高，見圖4。

5 高糖對線粒體介導細胞凋亡相關信號通路的影響

利用Western blotting 技術檢測細胞胞漿和線粒體內的細胞色素C相對濃度，可見高糖組細胞線粒體內細胞色素C的濃度僅相當于對照組的39%，而在細胞質中則有顯著升高(P<0.01)，提示由于線粒體膜完整性受到破壞，線粒體大量的細胞色素C釋放到細胞質。與對照細胞相比，高糖組細胞胞漿內促凋亡蛋白Bax的表達量顯著升高(P<0.01)，相應的2個抑制凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL的表達量明顯降低,見圖5。

Figure 2.High glucose-induced apoptosis in primary hepatocytes. A: the cells were stained with Hoechst 33258 and visualized on a fluorescent microscope to observe chromatin condensation(×200); B: the apoptotic cells were counted based on morphology, and the number of apoptotic cells was expressed as percentage of total cells. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖2 高糖誘導脂肪變性肝細胞凋亡

Figure 3.High glucose-induced mitochondrial membrane depolarization in primary hepatocytes. A: the cells were stained with JC-1 and visualized on an inverted fluorescence microscope (×200). Red fluorescence of JC-1 dimers was present in the cell areas with high mitochondrial membrane potential, while green fluorescence of JC-1 monomers was prevalent in the cell areas with low mitochondrial membrane potential. B: the ratio of red/green fluorescence intensity. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖3 高糖使脂肪變性肝細胞線粒體膜電位降低

Figure 4.The effect of high-glucose treatment on enzymatic activities of caspases in primary hepatocytes. Aliquots of cell lysate (50 μg protein) were assayed forinvitrocaspase-3, -8, and -9 activity using DEVD-pNA, IETD-pNA, and LEHD-pNA as substrates respectively. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖4 高糖對細胞凋亡蛋白酶活性的影響

討 論

高血糖是糖尿病的典型病征，會引起腎病、視網(wǎng)膜病變和神經(jīng)損傷等多種并發(fā)癥。實際上，肝臟是糖代謝的主要器官，高糖引起的肝損傷也應當受到高度重視。Wanless等[6]對351名NAFLD患者的肝臟標本進行病理分析后發(fā)現(xiàn)，血糖正常組NASH比例為4.7%，而2型糖尿病組NASH比例升高至12.2%。對NASH患者的追蹤研究進一步證實，長期高血糖會加速肝纖維化進程[7]。Yin等[8]給高脂喂養(yǎng)小鼠每天腹腔注射葡萄糖誘發(fā)血糖波動，發(fā)現(xiàn)會加劇小鼠肝臟炎癥反應和肝細胞凋亡。之前也有關于高糖促使肝細胞凋亡的體外實驗研究報道，但多是選用永生化的細胞系或普通飼料喂養(yǎng)小鼠的原代肝細胞，并且采用了更高的葡萄糖濃度(≥40 μmol/L)[9-10]。本研究利用高脂喂養(yǎng)小鼠的原代肝細胞作為實驗模型，采用較為接近糖尿病患者血糖水平的葡萄糖濃度，能夠更好地模仿體內環(huán)境。對細胞進行12 h高糖孵育處理，發(fā)現(xiàn)會引起線粒體功能障礙，天冬氨酸蛋白水解酶caspase-9和caspase-3活性顯著升高，導致細胞凋亡，提示脂肪變性細胞可能對高糖應激更為敏感。為排除滲透勢對細胞的不利影響，我們設置了甘露醇處理對照，明確了高糖可以直接促進脂肪變性肝細胞的凋亡。

Figure 5.The effects of high-glucose treatment on mitochondria-mediated apoptotic pathways in primary hepatocytes. A: cytosolic and mitochondrial proteins were probed with anti-cytochrome C antibody. β-actin and cytochrome C oxidase (Cox) IV were used as loading controls for the cytosolic and mitochondrial fractions, respectively. B: the cells were lysed and Bcl-2, Bcl-xL, and Bax expression were detected by Western blotting. Representative images and band intensity quantifications were shown. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖5 高糖對線粒體介導細胞凋亡相關信號通路的影響

細胞凋亡的途徑主要包括外源性死亡受體途徑和內源性線粒體細胞色素C釋放途徑，前者是通過胞外信號激活細胞內的凋亡酶caspase-8，后者是指細胞應激反應或凋亡信號引起線粒體細胞色素C釋放，作為凋亡誘導因子，細胞色素C能與Apaf-1、caspase-9前體、ATP/dATP形成凋亡體，然后募集并激活caspase-3，進而引發(fā)細胞凋亡[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖條件下細胞的去極化比例顯著升高，標志著線粒體膜電位的下降，這與之前的研究報道相一致[5, 12]。此外，細胞線粒體向胞漿釋放的細胞色素C增多，caspase-3活性升高，下游的促凋亡蛋白Bax表達水平升高，而抑制凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL的表達量明顯降低，caspase-8活性沒有明顯變化，說明高糖應激是通過線粒體介導的內源性凋亡途徑誘發(fā)脂肪變性肝細胞凋亡的。

綜上所述，高糖應激會導致脂肪變性肝細胞線粒體膜電位下降，啟動線粒體介導的內源性凋亡途徑，引起肝細胞凋亡，線粒體功能障礙可能是高血糖加速NAFLD病程進展的一個重要原因。

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(責任編輯： 陳妙玲， 余小慧)

Mitochondrial mechanism of hyperglycemia-induced apoptosis in primary mouse hepatocytes with steatosis

TANG Hui1, XIAO Zi-jun1, JIANG Xin-wei2, GUO Hong-hui1

(1HenryFokSchoolofFoodScienceandEngineering,ShaoguanUniversity,Shaoguan512005,China;2SchoolofPublicHealth,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:guohh1999@163.com)

AIM: To investigate the role of high glucose in primary hepatocytes of mice fed with a high fat diet.METHODS: Male C57BL/6J mice were fed a high fat (45% of calories) dietadlibitumfor 6 weeks to induce hepatic steatosis. Primary hepatocytes were isolated from the mouse liver by the 2 step collagenase perfusion method. The cells were incubated in low glucose (5 mmol/L), low glucose plus mannitol (30 mmol/L), or high glucose (35 mmol/L) DMEM medium for 12 h. The cell viability, apoptosis, mitochondrial membrane potential, and caspase enzymatic activities were measured. Furthermore, proteins related to the stress-sensitive signaling pathway of regulating high glucose-induced apoptosis in primary hepatocytes were determined by Western blotting.RESULTS: Incubation with 35 mmol/L glucose resulted in a significant decrease in cell viability and an increase in apoptosis, whereas mannitol had no significant effect on the cell viability or apoptosis. A progressive depolarization of the mitochondria, an increase in cytosol cytochrome C and a dramatic decrease in mitochondrial cytochrome C in high-glucose stressed hepatocytes were observed. The enzymatic activities of caspase-9 and caspase-3, but not caspase-8, were significantly increased in high glucose-stressed hepatocytes (P<0.05). High glucose treatment suppressed the expression of Bcl-2 and Bcl-xL, while it increased the expression of the pro-apoptotic factor Bax.CONCLUSION: High glucose stress reduces mitochondrial membrane potential, initiates mitochondria-mediated apoptotic pathways and promotes apoptosis of hepatocytes with steatosis. This may be an important pathological mechanism of hyperglycemia-induced progression of nonalcoholic fatty liver disease.

Hepatocyte; Mitochondria; High glucose stress; Apoptosis; Nonalcoholic fatty liver disease

1000- 4718(2016)08- 1419- 06

2016- 01- 26

2016- 05- 23

國家自然科學基金資助項目(No. 81372994)；廣東省揚帆計劃高層次人才項目(No. 201434015)

R363.2; R575

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.08.013

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