王勇濤，王洪江，王興名，馮雪

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Wnt2與Dvl蛋白在食管鱗癌組織中的表達(dá)及臨床意義

王勇濤，王洪江△，王興名，馮雪

摘要:目的檢測(cè)Wnt2與散亂（Dvl）蛋白在食管鱗癌組織中的表達(dá)情況，探討其與食管鱗癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。方法采用Western blot法分別檢測(cè)Wnt2、Dvl蛋白在60例食管鱗癌組織及其對(duì)應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)，并分析其與臨床病理特征之間的關(guān)系。結(jié)果Wnt2和Dvl蛋白在食管鱗癌組織中的相對(duì)表達(dá)量（0.512±0.406和1.218±1.082）高于癌旁食管組織（0.153±0.189和0.505±0.358），且Wnt2及Dvl蛋白表達(dá)在不同浸潤(rùn)深度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況中存在差異（P＜0.01）；Wnt2與Dvl蛋白在食管鱗癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.718，P＜0.01）。結(jié)論Wnt2、Dvl蛋白的高表達(dá)通過(guò)Wnt2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路協(xié)同促進(jìn)食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。

關(guān)鍵詞：食管腫瘤；癌,鱗狀細(xì)胞；Wnt2蛋白質(zhì)；Dvl蛋白質(zhì)；印跡法,蛋白質(zhì)

△通訊作者E-mail：whj71210@sina.com

食管癌是我國(guó)最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，且以鱗癌為主。Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的失調(diào)與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[1]。Wnt2是Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的啟動(dòng)因子，它可通過(guò)激活Wnt經(jīng)典信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲能力，并且參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移[2]。散亂（Dishevelled，Dvl）蛋白是Wnt2信號(hào)通路中的正向調(diào)節(jié)因子，位于β-catenin上游，在許多腫瘤中均高表達(dá)[3]。以Wnt2為代表的Wnt經(jīng)典信號(hào)通路是食管鱗癌中研究較多的信號(hào)通路，但Dvl蛋白表達(dá)與食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性國(guó)內(nèi)外少見(jiàn)報(bào)道。本研究利用West?ern blot法檢測(cè)60例食管鱗癌組織及其對(duì)應(yīng)癌旁組織中Wnt2、Dvl蛋白的表達(dá)，探究其在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1　資料與方法

1.1一般資料收集新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胸外科2011年11月—2014年6月手術(shù)切除標(biāo)本60例，每份標(biāo)本均包括癌組織和對(duì)應(yīng)癌旁組織（遠(yuǎn)隔癌組織5 cm以上）。患者年齡42～74歲，平均年齡（62.47±7.14）歲，男42例，女18例；根據(jù)食管癌分期2009年（AJCC第7版）分期標(biāo)準(zhǔn)，術(shù)后分期Ⅰ期4例，ⅡA期10例，ⅡB期16例，ⅢA期12例，ⅢB期6例，ⅢC期12例。其中有、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移各30例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）每份病例均取得對(duì)應(yīng)癌旁組織作為對(duì)照，所選病例術(shù)后病理證實(shí)均為鱗癌。（2）所有患者術(shù)前均未行放化療及生物免疫治療。本研究經(jīng)過(guò)新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象知情同意。

1.2實(shí)驗(yàn)主要試劑兔抗人總Dvl單克隆抗體（H-260）、兔抗人Wnt2單克隆抗體（H-40）均購(gòu)自美國(guó)SANTA CRUZ公司，通用二抗（羊抗兔）購(gòu)自北京中杉金橋生物科技有限公司。

1.3標(biāo)本處理所有組織標(biāo)本術(shù)中離體30 min內(nèi)立即取材，置于液氮中速凍后移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4Western blot測(cè)定Wnt2、Dvl蛋白水平按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取組織總蛋白，BCA法測(cè)定總蛋白濃度，均衡蛋白濃度后配置上樣緩沖液，并于90℃變性5 min。在10%（分離膠）和5%（濃縮膠）SDS-PAGE凝膠中進(jìn)行電泳分離，Marker進(jìn)行位置標(biāo)記。濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上（90 min）。轉(zhuǎn)膜后5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。4℃孵育Wnt2、Dvl一抗過(guò)夜，洗滌后孵育β-actin二抗，洗膜后使用ECL發(fā)光試劑盒曝光顯影。Wnt2、Dvl抗體濃度均為1∶400，內(nèi)參β-actin濃度1∶500，二抗?jié)舛?∶7 500。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒曝光后所得圖像采用Imaging Lab圖像分析軟件進(jìn)行分析，將目的蛋白Wnt2、Dvl的調(diào)整體積/同一標(biāo)本內(nèi)參蛋白β-actin調(diào)整體積所得的比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)含量。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用±s表示，癌與癌旁差異比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，方差不齊采用t′檢驗(yàn)；不同臨床類(lèi)型差異比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或方差分析，相關(guān)分析采用Pearson法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1Wnt2、Dvl蛋白在癌組織與癌旁組織中的表達(dá)Wnt2、Dvl蛋白條帶分別位于34 ku和85 ku處，在癌組織及癌旁組織中均有表達(dá)，并且Wnt2、Dvl在癌組織中的相對(duì)表達(dá)量（0.512±0.406和1.218±1.082）高于癌旁食管組織（0.153±0.189和0.505±0.358），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別為7.804和6.841，P＜0.01），見(jiàn)圖1。

Fig. 1 The expression of Wnt2 and Dvl protein in cancer tissue and the tissue adjacent to carcinoma detected by Western blot assay圖1　Western blot法測(cè)定Wnt2、Dvl蛋白在癌組織與癌旁組織的表達(dá)

2.2Wnt2、Dvl蛋白表達(dá)與食管鱗癌患者臨床病理特征的關(guān)系不同浸潤(rùn)深度、不同TNM分期、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者Wnt2與Dvl蛋白的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。不同性別、年齡、組織分化程度的患者Wnt2與Dvl蛋白的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

Tab. 1 The relationship between Wnt2, Dvl protein and clinicopathological significance表1　Wnt2、Dvl蛋白相對(duì)表達(dá)量與食管鱗癌患者臨床病理特征的關(guān)系(±s )

Tab. 1 The relationship between Wnt2, Dvl protein and clinicopathological significance表1　Wnt2、Dvl蛋白相對(duì)表達(dá)量與食管鱗癌患者臨床病理特征的關(guān)系(±s )

＊＊P＜0.01

臨床病理特征性別年齡組織分化程度浸潤(rùn)深度淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移TNM分期男女≤62歲>62歲低分化中分化高分化T1+T2 T3+T4有無(wú)Ⅰ～ⅡⅢn 42 18 28 32 8 44 8 14 46 30 30 30 30 Wnt2 0.509±0.428 0.520±0.362 0.439±0.382 0.576±0.422 0.551±0.206 0.563±0.443 0.194±0.921 0.220±0.220 0.601±0.409 0.722±0.422 0.302±0.257 0.259±0.231 0.765±0.387 t或F 0.100 1.309 3.041 4.520＊＊4.668＊＊6.137＊＊Dvl 1.208±1.105 1.244±1.058 1.104±0.963 1.319±1.183 0.976±0.601 1.293±1.187 1.048±0.852 0.297±0.233 1.499±1.084 1.812±1.095 0.625±0.675 0.663±0.656 1.774±1.146 t、t′或F 0.117 0.764 0.397 7.007＊＊5.056＊＊4.611＊＊

2.3Wnt2與Dvl蛋白在食管鱗癌表達(dá)的相關(guān)性分析在食管鱗癌組織中Wnt2蛋白與Dvl蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.718，P＜0.01）。

3　討論

食管癌的發(fā)生發(fā)展涉及多種基因的改變[4-6]。近年來(lái)，Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展調(diào)控研究中越來(lái)越受到重視。目前人類(lèi)基因組共發(fā)現(xiàn)19個(gè)Wnt基因，Wnt2被認(rèn)為是一種癌基因，參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7-8]。當(dāng)Wnt2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被異常激活時(shí)，細(xì)胞分泌的Wnt2蛋白與細(xì)胞跨膜受體結(jié)合后，通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)Dvl，使胞質(zhì)內(nèi)β-catenin避免與腳手架蛋白Axin、蛋白激酶GSK-3β等形成降解復(fù)合物而被降解，當(dāng)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)β-catenin積累到一定濃度后就會(huì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，繼而與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子（TCF/LEF）相結(jié)合，形成βcatenin-TCF/LEF復(fù)合物而啟動(dòng)靶基因細(xì)胞周期蛋白（cyclin）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-7、干細(xì)胞標(biāo)志物CD44等的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)。

研究顯示，Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的失調(diào)與許多疾病的病理改變及腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[9- 10]。Wang-Saegusa等[11]發(fā)現(xiàn)在胃癌組織和細(xì)胞中均存在Wnt2高表達(dá)，且與浸潤(rùn)深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。同時(shí)李韶等[12]研究證實(shí)Wnt2經(jīng)典信號(hào)通路及其下游靶基因β-catenin的表達(dá)在食管癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，且隨病理分期的升高表達(dá)逐漸增強(qiáng)。本研究結(jié)果顯示，Wnt2蛋白在癌組織中的相對(duì)表達(dá)量明顯高于癌旁組織，不同食管鱗癌患者的浸潤(rùn)深度、不同TNM分期、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移其表達(dá)也不同。

李健等[3]研究發(fā)現(xiàn)腦膠質(zhì)瘤中Dvl蛋白表達(dá)水平較健康腦組織明顯升高，且與腦膠質(zhì)瘤病理分級(jí)密切相關(guān)。另外，Dvl蛋白在乳腺癌、肺癌、宮頸鱗癌等腫瘤中的表達(dá)也增高[13-14]。本研究結(jié)果顯示，Dvl蛋白在癌組織中的相對(duì)表達(dá)量明顯高于癌旁組織，且與Wnt2一樣，和食管鱗癌臨床病理特征有著共同的關(guān)系。

You等[15]報(bào)道，抗Wnt2單克隆抗體可使Dvl蛋白失活，下調(diào)惡性黑色素瘤細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制黑色素瘤體外移植瘤的生長(zhǎng)。本研究證實(shí)Wnt2和Dvl表達(dá)呈正相關(guān)，提示兩者有協(xié)同作用，可促進(jìn)食管癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，Wnt2、Dvl蛋白的高表達(dá)與食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移有關(guān)；且其高表達(dá)提示TNM分期較晚，浸潤(rùn)深度較深，易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；有效抑制Dvl蛋白的表達(dá)，將有可能抑制Wnt2經(jīng)典信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，或許在食管癌的臨床治療中能夠發(fā)現(xiàn)新的靶向藥物。

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（2015-07-03收稿2015-10-26修回）

（本文編輯魏杰）

作者單位：新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胸外科（郵編830011）

Expression and clinical significance of Wnt2 and Dvl protein in esophageal aquamous carcinoma

WANG Yongtao，WANG Hongjiang△，WANG Xingming，F(xiàn)ENG Xue
Thoracic Surgery, Affiliated Tumor Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China
△Corresponding Author E-mail: whj71210@sina.com

Abstract:Objective To detect the expressions of Wnt2 and dishevelled (Dvl) protein in esophageal squamous carci?noma, and analyze their relationship with the occurrence and development of esophageal squamous cell carcinoma. Meth?ods The expression levels of Wnt2 and Dvl protein were detected by Western blot assay in 60 samples of esophageal carci?noma and adjacent non-carcinomatous esophageal tissues, and their relationship with clinical pathological features were ana?lyzed. Results The relative expression levels of Wnt2 and Dvl protein were higher in esophageal squamous carcinoma tis?sue (0.512±0.406, 1.218±1.082) than those of esophageal tissue adjacent to carcinoma (0.153±0.189, 0.505±0.358). There were significant differences in the expression levels of Wnt2 and Dvl protein between different infiltration depth, different TNM stages, and lymph node metastasis (P＜0.01). There was a positive correlation between Wnt2 and Dvl protein in esopha?geal squamous carcinoma (r = 0.718, P＜0.01). ConclusionThe high expression levels of Wnt2 and Dvl protein promote the development and metastasis of esophageal squamous cell carcinomas collaboratively via Wnt2 signal transduction path?ways.

Key words:esophageal neoplasms; carcinoma, squamous cell; Wnt2 protein; Dvl protein; blotting, Western

中圖分類(lèi)號(hào)：R735.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.11958/20150007

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81160271）

作者簡(jiǎn)介：王勇濤（1986），男，碩士在讀，主要從事食管癌的外科治療和基礎(chǔ)研究