吳媛，谷繼偉，荊紅英，國(guó)玉芝，王晶，顏承云,△

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紫杉醇/NLS-KALA-SA核定位納米粒對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞株的抑制作用

吳媛1，谷繼偉2，荊紅英2，國(guó)玉芝2，王晶2，顏承云1,2△

摘要:目的觀察多肽自組裝載體載紫杉醇納米粒（NKSP）及紫杉醇單藥對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞株的體外抑制作用及可能機(jī)制。方法用噻唑藍(lán)（MTT）法分別檢測(cè)不同濃度組NKSP（20、40、80、100 μg/L）、紫杉醇單藥(20、40、80、100 μg/L)作用24、48及72 h對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響。流式細(xì)胞儀檢測(cè)不加任何藥物處理（A）組、加入80 μg/L的多肽自組裝納米粒(NKS)培養(yǎng)液（B）組、加入80 μg/L紫杉醇單藥（C）組、加入含80 μg/L NKSP（D）組作用A549細(xì)胞48 h及72 h時(shí)的細(xì)胞凋亡率。Western blot檢測(cè)A、B、C、D組作用48 h及72 h細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白bax、caspase-3的表達(dá)。結(jié)果紫杉醇單藥、NKSP均能抑制A549的增殖，紫杉醇單藥各組48和72 h時(shí)、NKSP單藥各組在72 h時(shí)隨濃度遞增抑制率也呈遞增趨勢(shì)（均P < 0.05）。48 h時(shí)D組促A549凋亡作用低于C組(P < 0.05)，72 h強(qiáng)于C組(P < 0.05)，且藥物作用48 h時(shí)D組的bax、caspase-3的表達(dá)低于C組，而72 h時(shí)高于C組(P < 0.05)。結(jié)論NKS包裹紫杉醇后可促使載體內(nèi)的紫杉醇緩慢釋放，與紫杉醇單藥相比，可降低細(xì)胞毒性，延長(zhǎng)抗腫瘤作用時(shí)間。

關(guān)鍵詞:肺腫瘤；腺瘤病,肺；納米球；抗腫瘤藥；體外研究；紫杉醇；A549細(xì)胞

△通訊作者E-mail: 382841156@qq.com

肺癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,占我國(guó)城市人口死亡原因第1位[1]。對(duì)于不能手術(shù)的患者，化療為其治療的主要手段[2]。紫杉醇是常見(jiàn)的細(xì)胞毒性化療藥物，其對(duì)非小細(xì)胞肺癌等多種腫瘤具有良好的治療效果[3]。本課題組前期采用Fmoc多肽固相合成法依次將基因融合肽（KALA）、硬脂酸(SA)連接到核定位信號(hào)(NLS)多肽上，建立的多肽自組裝納米粒載體(NKS)能主動(dòng)包裹紫杉醇等藥物[4-5]。該NLS介導(dǎo)的KALA多肽納米載體同時(shí)具有主動(dòng)穿過(guò)細(xì)胞膜和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)入核的能力，SA烷基鏈可誘導(dǎo)多肽形成更加穩(wěn)定的自組裝體。KALA穿膜作用可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)吞，通過(guò)α-螺旋構(gòu)象轉(zhuǎn)變擾亂溶酶體的膜層，逃離內(nèi)涵體進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，快速定位細(xì)胞核[6]。本研究旨在以NKS為載體制備紫杉醇納米粒（NKSP）緩釋制劑，探討其用于肺癌靶向治療的效果，以期提高藥物的緩釋特性及生物利用度。

1　資料與方法

1.1一般資料人肺腺癌A549細(xì)胞株（桂林醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心保存）；紫杉醇注射液（桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科提供)；NLS-KALA-SA(自制)；1640培養(yǎng)液購(gòu)自gibco公司；胎牛血清購(gòu)自依科賽公司；胰蛋白酶-EDTA消化液、10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠配置體系購(gòu)自Solarbio公司；噻唑藍(lán)(MTT）購(gòu)自華美公司；兔抗β-actin、bax、caspase-3購(gòu)自萬(wàn)類(lèi)生物公司；羊抗兔二抗購(gòu)自北京中杉金橋有限公司；酶標(biāo)儀、凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自Bio- Rad公司；BD FACSAriaⅢ流式細(xì)胞儀、AN?NEXIN V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司；掃描電鏡S4800購(gòu)自日本高新技術(shù)公司。

1.2方法

1.2.1NKSP的制備將粉末狀的NKS均勻涂抹于導(dǎo)電膠上，鍍金，在掃描電鏡S4800下觀察。將粉末狀NKS配成1 g/L的載體溶液，按照載體和紫杉醇的質(zhì)量比為1∶1配成NKSP。NKS的制作結(jié)構(gòu)式C18H36O2（SA）-WEAKLAKALAKA?LAKHLAKALAKALKACEA(KALA)-VKRKKKP（NLS），其中KALA加NLS合稱(chēng)為細(xì)胞穿膜肽（CPPs）。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)用含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)A549細(xì)胞，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱。

1.2.3MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)紫杉醇單藥及NKSP對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，胰蛋白酶消化，用1640完全培養(yǎng)液重懸成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔5 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，每孔體積100 μL，培養(yǎng)24 h后，分設(shè)對(duì)照組（不加任何藥物處理）和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組分為不同濃度藥物組（NKSP濃度分別為20、40、80及100 μg/L），紫杉醇（濃度分別為20、40、80及100 μg/L），每個(gè)濃度組分設(shè)6個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24、48及72 h；每孔加入5 g/L MTT 20 μL, 37℃、5%CO2條件下繼續(xù)孵育4 h,加入150 μL的二甲基亞砜（DMSO）終止反應(yīng),在37℃恒溫振蕩10 min, 450型ELISAReader酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司）490 nm單波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度，計(jì)算各藥物濃度對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制率。細(xì)胞抑制率(%) =(1-藥物組吸光度/對(duì)照組吸光度)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)算紫杉醇單藥及NKSP作用48 h時(shí)及72 h的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，設(shè)A、B、C、D 4個(gè)組。A為空白對(duì)照組，不加任何藥物處理的組；B組加入80 μg/L NKS的培養(yǎng)液；C組加80 μg/L紫杉醇單藥；D組加入含80 μg/L NKSP，每組分別處理細(xì)胞48 h及72 h。待達(dá)到培養(yǎng)時(shí)間后，用胰蛋白酶消化，離心，收集細(xì)胞。用冷PBS洗滌、離心細(xì)胞2次（1 000 r/min，5 min），用1×Bind Buffer重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL ,取100 μL上述細(xì)胞懸液，避光條件下每組加入5 μL FITC和5 μL PI染料，15 min后每組加入400 μL 1×Bind Buffer，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，F(xiàn)ACSDiva Version 6.1.3軟件分析結(jié)果。每組重復(fù)測(cè)3次。

1.2.5Western blot法觀察凋亡相關(guān)蛋白bax、caspase-3的表達(dá)細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，分組及干預(yù)措施同1.2.4。各組分別作用48 h及72 h后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，PBS洗2遍，收集細(xì)胞,加入細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min，4℃、12 000 r/min離心20 min，取上清，以BCA法獲得蛋白質(zhì)定量值后沸水煮10 min備用。配制10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠,恒壓80 V電泳,恒流240 mA轉(zhuǎn)膜1 h，常溫下5%牛奶封閉2 h,一抗β-actin、bax、caspase-3（1∶500），4℃孵育過(guò)夜,二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h，凝膠成像系統(tǒng)發(fā)光。用Uvp grabit Image軟件測(cè)定各條帶的吸光度,以各組目的條帶的吸光度值與內(nèi)參β-actin吸光度值的比值作為細(xì)胞間蛋白表達(dá)量的比較。每組重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，同種藥物2個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。多組間均數(shù)比較用單因素方差分析，兩兩比較用bonferroni法，P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1NKS的形貌圓形顆粒為NKS納米粒，放大倍數(shù)為30 000倍，放射電流9 800 nA，見(jiàn)圖1。

Fig. 1 The morphology of blank carrier（NKS）in SEM（×30 000）圖1　掃描電鏡下空白載體(NKS)的形貌（×30 000）

2.2紫杉醇單藥及NKSP對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響組間比較：紫杉醇和NKSP單藥各濃度組間作用24 h時(shí)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其對(duì)A549細(xì)胞無(wú)生長(zhǎng)抑制作用，后續(xù)實(shí)驗(yàn)及組內(nèi)比較排除24 h數(shù)據(jù)；48、72 h時(shí)各組抑制率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05），NKSP 20 μg/L與40 μg/L組間在48 h抑制率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。組內(nèi)比較：紫杉醇和NKSP單藥各濃度組72 h抑制率均高于48 h（均P < 0.05），見(jiàn)表1。紫杉醇單藥作用48 h和72 h時(shí)的IC50分別為64.8和63.2 μg/L。NKSP作用48 h時(shí)和72 h 的IC50分別為123.3和59.4 μg/L。后續(xù)實(shí)驗(yàn)為了取一個(gè)中間濃度，故選藥物濃度為80 μg/L。

Tab.1 The inhibitory rates of A549 cells treated by various concentrations of paclitaxel monotherapy and NKSP monotherapy表1　各濃度組紫杉醇單藥和NKSP單藥作用A549細(xì)胞的抑制率　（n=3,%，±s）

2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果48 h時(shí)，C組與D組的細(xì)胞凋亡率均高于A組和B組，D組低于C組；72 h時(shí)，C組、D組高于A組B組，而D組高于C組（P < 0.05）。48 h及72時(shí)A組和B組凋亡率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2、圖1。

Tab. 2 The apoptotic rates after 48 h and 72 h treatment in four groups表2　各組分別作用48 h及72 h后的凋亡率（n=3,%,±s）

Tab. 2 The apoptotic rates after 48 h and 72 h treatment in four groups表2　各組分別作用48 h及72 h后的凋亡率（n=3,%,±s）

＊＊P＜0.01；a與A組比較，b與B組比較，c與C組比較，P＜0.05

組別A組B組C組D組F 48 h凋亡率1.467±0.404 1.733±0.472 53.333±8.514ab32.133±7.800abc57.329＊＊72 h凋亡率3.300±0.700 3.467±0.750 59.900±3.651ab72.300±6.755abc267.292＊＊

2.4Western blot檢測(cè)結(jié)果除72 h時(shí)A、B組bax差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其他各組間bax和caspase-3比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中48 h時(shí)C組bax、caspase-3蛋白的表達(dá)量高于D組；72 h時(shí)低于D組（均P < 0.05），見(jiàn)圖2、表3。

Fig. 1 The apoptotic results of flow cytometry in four groups of A549 cells圖1　流式檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組對(duì)A549凋亡的影響

Fig. 2 Results of Western blot assay for apoptotic proteins bax and caspase-3 in four groups圖2　Western blot檢測(cè)各組對(duì)凋亡蛋白bax、caspase-3的影響

Tab. 3 Comparison of the expression amount of bax and caspase-3 after 48 h or 72 h treatment between four groups表3　各組48 h及72 h時(shí)bax、caspase-3表達(dá)量的比較（n=3，±s）

Tab. 3 Comparison of the expression amount of bax and caspase-3 after 48 h or 72 h treatment between four groups表3　各組48 h及72 h時(shí)bax、caspase-3表達(dá)量的比較（n=3，±s）

＊＊P < 0.01；a與A組比較，b與B組比較，c與C組比較，P＜0.05

組別A組B組C組D組F bax 48 h 0.032±0.019 0.091±0.029a1.522±0.797ab1.109±0.549abc625.818＊＊72 h 0.797±0.248 0.785±0.150 4.660±0.448ab5.964±0.572abc121.368＊＊caspase-3 48 h 0.300±0.017 0.411±0.022a1.156±0.057ab0.522±0.026abc366.394＊＊72 h 0.669±0.038 0.100±0.050a1.466±0.048ab1.689±0.084abc190.238＊＊

3　討論

與其他生物大分子轉(zhuǎn)運(yùn)方式相比，細(xì)胞穿膜肽(CPPs)作為分子載體應(yīng)用于體內(nèi)外的入胞轉(zhuǎn)運(yùn)具有很多優(yōu)勢(shì)。首先，細(xì)胞穿膜肽能夠有效轉(zhuǎn)導(dǎo)具有不同分子質(zhì)量和天然性質(zhì)的大分子進(jìn)入細(xì)胞；其次，細(xì)胞穿膜肽毒性相對(duì)較小[7]。該多肽分子中引入SA烷基鏈可以穩(wěn)定α-螺旋肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)，并誘導(dǎo)多肽形成更加穩(wěn)定的自組裝載體。

紫杉醇是從紅豆杉樹(shù)皮中提取的具有抗癌作用的天然的廣譜抗腫瘤藥物。它通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞微管蛋白聚合，維系已聚合微管蛋白穩(wěn)定，抑制細(xì)胞有絲分裂來(lái)實(shí)現(xiàn)抗腫瘤作用[8]。紫杉醇是常見(jiàn)的細(xì)胞毒性化療藥物，常用于肺癌的治療，不良反應(yīng)有骨髓抑制、超敏反應(yīng)、心臟毒性等[9]。

本研究MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，紫杉醇和NKSP單藥各濃度組間作用24 h時(shí)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明各組A549細(xì)胞無(wú)生長(zhǎng)抑制作用，考慮原因可能為藥物作用時(shí)間較短，藥效發(fā)揮；NKSP各濃度組72 h抑制率均高于48 h，且在72 h時(shí)隨著濃度的增大對(duì)A549的抑制作用也增強(qiáng)，表明NKSP可在體外抑制肺腺癌A549細(xì)胞的增殖，抑制作用具有濃度依賴性。流式細(xì)胞儀可以在大量凋亡細(xì)胞和壞死混合的條件下，快速、定量和準(zhǔn)確地檢測(cè)細(xì)胞活力[10]。本研究結(jié)果顯示，48 h時(shí)紫杉醇單藥導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡率高于NKSP,而72 h時(shí)低于NKSP；48 h及72時(shí)B組凋亡率和A組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明NKS本身并沒(méi)有導(dǎo)致A549凋亡的作用；而D組高于C組，提示NKSP藥物具有緩釋作用，同時(shí)又具有高效性，在同樣濃度下能達(dá)到更好抑制腫瘤細(xì)胞的作用。Western blot實(shí)驗(yàn)顯示，48 h紫杉醇單藥組bax、cas?pase-3的表達(dá)量高于NKSP組，而72 h低于NKSP組，表明NKSP可能通過(guò)上調(diào)bax、caspase-3表達(dá)水平，來(lái)誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生凋亡，提示NKSP對(duì)基因的調(diào)控速度相對(duì)單藥紫杉醇起始較慢，但是隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其作用明顯增強(qiáng)并且作用時(shí)間更加持久。

綜上所述，筆者認(rèn)為，NKS包裹紫杉醇后，可促使載體內(nèi)的紫杉醇緩慢釋放，從而降低了細(xì)胞毒性，延長(zhǎng)了抗腫瘤作用時(shí)間。故NKSP有望成為抗腫瘤治療的一種新藥。

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（2015-07-02收稿2015-07-22修回）

（本文編輯陸榮展）

作者單位：1廣西桂林，桂林醫(yī)學(xué)院研究生院（郵編541004）；2黑龍江佳木斯，佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院

Inhibition effects of paclitaxel/NLS-KALA-SA nanoparticles on A549 cell line in vitro

WU Yuan1, GU Jiwei2, JING Hongying2, GUO Yuzhi2, WANG Jing2, YAN Chengyun1,2△
1 Guilin Medical University, Guilin 541004, China; 2 First Affiliated Hospital of Jiamusi University
△Corresponding Author E-mail：382841156@qq.com

Abstract:Objective To observe NLS-KALA-SA-PTX (NKSP) for lung adenocarcinoma cell line A549 in vitro with paclitaxel monotherapy, and the mechanism thereof. Methods MTT assay was used to detect A549 cell proliferation influ?enced by different concentrations of NKSP (20, 40, 80, 100 μg/L) and paclitaxel monotherapy (20, 40, 80, 100 μg/L) for 24 h, 48 h and 72 h.. Subsequent experiments were divided into four groups, namely, group A (without any drug treatment), group B (added polypeptide 80 μg/L of self-assembled nanoparticles, NKS), group C (80 μg/L paclitaxel monotherapy) and group D (80 μg/L NKSP). Flow cytometry was used to detect the cell apoptotic rates after 48 h and 72 h treatment in four groups. Western blot assay was used to analyse the protein expressions of bax and caspase-3 after 48 h and 72 h treatment in four groups. Results Both paclitaxel monotherapy and NKSP can inhibit the proliferation of A549 cells. The inhibitory rates of paclitaxel monotherapy group at 48 h and 72 h and NKSP group at 72 h showed an increasing trend in a dose-depen?dent manner (P < 0.05). After treatment for 48 hours, the apoptotic rate was significantly higher in D group than that of C group (P < 0.05). But the apoptotic rate at 72 h was lower in D group than that of C group (P < 0.05). The protein expressions of bax and caspase-3 at 48 h were significantl lower in D group than those of C group, which were higher at 72 h in D group than those of C group (P < 0.05). Conclusion Compared to paclitaxel monotherapy group, NKS promotes slow release of pa?clitaxol, which reduces the cytotoxicity and extends the antitumor effects.

Key words:lung neoplasms；adenomatosis, pulmonary；nanospheres；antineoplastic agents；in vitro; paclitaxel; A549 cells

中圖分類(lèi)號(hào):R734.2，R979.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

DOI:10.11958/59151

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81260484)；廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2013GXNSFAA019226)

作者簡(jiǎn)介：吳媛（1990），女，碩士研究生在讀，主要從事腫瘤靶向研究