鄭巖 李江 楊鵬 陳惠萍

摘 要 糊粉層細(xì)胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）是水稻（Oryza Sativa L.）種子萌發(fā)過(guò)程中的關(guān)鍵事件。為探明水稻糊粉層細(xì)胞程序性死亡過(guò)程中細(xì)胞形態(tài)的變化，利用熒光顯微技術(shù)結(jié)合染色方法對(duì)不同萌發(fā)時(shí)間的水稻種子糊粉層細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行了觀察。結(jié)果顯示：糊粉層細(xì)胞死亡過(guò)程中液泡呈現(xiàn)2種變化類(lèi)型，液泡化的最終形態(tài)也有所差異；糊粉層細(xì)胞死亡的發(fā)生與液泡化程度緊密聯(lián)系，并且與胚的生長(zhǎng)及距離有明顯的時(shí)間效應(yīng)和位置效應(yīng)。

關(guān)鍵詞 水稻；糊粉層；細(xì)胞程序性死亡；液泡化

中圖分類(lèi)號(hào) S511 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

The Cell Morphology of Rice Aleurone

Layers During Programmed Cell Death

ZHENG Yan，LI Jiang，YANG Peng，CHEN Huiping*

College of Horticulture and Landscape Architecture，Hainan University，Haikou，Hainan 570228，China

Abstract The programmed cell death（PCD）of aleurone layers is a key event in the germination of Oryza sativa L seeds. In this study，in order to investigate the changes of cell morphology of rice aleurone layers in PCD，cell morphology were examined at different germinating time and in different parts by combining staining methods and observation of fluorescent microscope. The results showed that aleurone cells displayed two types of vacuolar change and the final forms of the two vacuolation were different during the PCD course of aluerone layers. In addition，the PCD progress of aleurone layers was closely correlated with the degree of vacuolization， and which has obvious time- and position effect with the growth of embryo and the distance from embryo. then resulting in the cell death of aleurone layers.

Key words Rice；Aleurone layer；Programmed cell death；Vacuolation

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.02.014

禾谷類(lèi)作物的胚乳分為淀粉性胚乳和糊粉層。當(dāng)籽實(shí)成熟時(shí)，淀粉性胚乳細(xì)胞死亡，只有糊粉層細(xì)胞有活性。在禾谷類(lèi)作物種子萌發(fā)和幼苗形成時(shí)，糊粉層細(xì)胞合成并分泌多種水解酶到胚乳中，提供營(yíng)養(yǎng)給胚，供其生長(zhǎng)發(fā)育需要。當(dāng)糊粉層細(xì)胞完成分泌作用時(shí)，細(xì)胞發(fā)生死亡，這種死亡稱(chēng)為細(xì)胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）[1-2]，是由特定基因調(diào)控的死亡過(guò)程。研究表明，糊粉層細(xì)胞程序性死亡是禾谷類(lèi)種子萌發(fā)過(guò)程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[2-6]。

液泡在植物PCD中起著重要的作用[7-9]，它是PCD啟動(dòng)階段各種水解酶和其它死亡執(zhí)行者的集散地。液泡的崩解是植物PCD中關(guān)鍵的步驟。液泡介導(dǎo)的細(xì)胞死亡的最后一步就是液泡膜的破裂和液泡水解酶的大量釋放，其中被釋放和激活的蛋白酶促進(jìn)了細(xì)胞質(zhì)的降解[10]。因此，液泡膜破裂是植物細(xì)胞程序性死亡的重要過(guò)程[11]。大麥糊粉層細(xì)胞在死亡之前開(kāi)始高度的液泡化，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的相關(guān)細(xì)胞器內(nèi)含物迅速降解[5]。在糊粉層細(xì)胞高度液泡化及液泡膜破裂前，其細(xì)胞仍然是活細(xì)胞。因此，糊粉層細(xì)胞液泡化的程度可以作為描述糊粉層PCD進(jìn)程的形態(tài)學(xué)依據(jù)。

目前，除大麥[1，3，5，12]外，關(guān)于其它禾谷類(lèi)種子糊粉層細(xì)胞程序性死亡過(guò)程的細(xì)胞形態(tài)變化的研究較少，因此，還難于從分子水平探討糊粉層細(xì)胞程序性死亡的機(jī)制。在本研究中，筆者利用熒光染色法結(jié)合熒光顯微鏡對(duì)萌發(fā)水稻種子的糊粉層細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行了觀察，以期為進(jìn)一步開(kāi)展糊粉層細(xì)胞死亡的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為水稻（Oryza Sativa L.）品種優(yōu)Ⅱ128， 用0.1%高錳酸鉀溶液消毒其種子5 min，經(jīng)蒸餾水沖洗干凈后，放入含10 mL蒸餾水的墊有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，置于光照培養(yǎng)箱中，每日光照12 h，強(qiáng)度為400 μmol/（m2·s），晝夜溫度為25 ℃/20 ℃。分別在種子萌發(fā)后的1、3、5、8、14 d ，從萌發(fā)種子的近胚端和遠(yuǎn)胚端剝?nèi)『蹖樱糜诩?xì)胞形態(tài)觀察。

1.2 方法

1.2.1 AO染色法 剝離出單獨(dú)的糊粉層，用8.5 μg/mL吖啶橙（Acridine orange，AO）工作液染色15 min，洗去背景熒光后，用熒光顯微鏡（Nikon Eclipse 80i，Japan）觀察細(xì)胞DNA熒光，所用的激發(fā)濾光片波長(zhǎng)為488 nm，阻斷濾光片波長(zhǎng)為515 nm，觀察的同時(shí)進(jìn)行拍照。

1.2.2 水稻糊粉層的分離和原生質(zhì)體的制備 將水稻種子置于20%漂白劑中消毒20 min，并用無(wú)菌水清洗數(shù)次；浸種4 h后，置于消毒的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)4 d，除去胚根和胚芽，殘留的部分用無(wú)菌水沖洗；在無(wú)菌條件下，將種子和胚根、胚芽分離，并用手術(shù)刀片分離糊粉層；將分離的糊粉層收集于調(diào)整過(guò)的Gamborgs B-5培養(yǎng)基（內(nèi)含20 mmol/L CaCl2， 0.1 mol/L葡萄糖和0.6 mol/L甘露醇），轉(zhuǎn)移到含5% 纖維素酶和1 mmol/L DTT調(diào)整過(guò)的Gamborgs B-5培養(yǎng)基，在室溫下震蕩1 h，然后轉(zhuǎn)入不含纖維素酶和DTT調(diào)整過(guò)的Gamborgs B-5培養(yǎng)基，震蕩至少30 min；取12粒種子的糊粉層轉(zhuǎn)入3 mL含5%纖維素酶和1 mmol/L DTT（內(nèi)含150 units/mL nystatin，0.1mg/mL cefotaxime）的新鮮培養(yǎng)基，放置24 h；用手術(shù)刀片刮下糊粉層上的原生質(zhì)體，以500 r/min離心3 min收集原生質(zhì)體；將原生質(zhì)體重新懸浮在調(diào)整過(guò)的Gamborgs B-5培養(yǎng)基中，首先用105 μm孔徑的篩子過(guò)濾，除去碎片；然后用10 μm孔徑的篩子，濾過(guò)殘留的淀粉粒；用MaMgEMS溶液[內(nèi)含15 mmol/L MgCl2·6 H2O，0.1% MES（pH 5.6），0.6 mol/L甘露醇]收集篩子上的原生質(zhì)體。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻種子糊粉層PCD過(guò)程液泡變化類(lèi)型

通過(guò)對(duì)正常條件下水稻糊粉層PCD形態(tài)變化的觀察，發(fā)現(xiàn)水稻糊粉層細(xì)胞發(fā)生死亡時(shí)，其形態(tài)變化隨糊粉層細(xì)胞位置和萌發(fā)時(shí)間的不同而異。同一時(shí)期的水稻種子，靠近胚端的糊粉層細(xì)胞從遠(yuǎn)胚處到近胚處（圖1-a～e），細(xì)胞的變化是蛋白貯藏小泡之間逐漸融合變大，但最終蛋白貯藏小泡很可能破裂，不形成中央大液泡（圖1-e）。而在靠近種子遠(yuǎn)胚端的糊粉層細(xì)胞，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白貯藏小泡之間逐漸融合，最終形成一個(gè)中央大液泡，并把細(xì)胞核擠到細(xì)胞邊緣（圖1-E）。為了便于對(duì)糊粉層細(xì)胞的形態(tài)進(jìn)行分類(lèi)，把這2種不同位置（靠近胚端、糊粉層中部）的細(xì)胞死亡形態(tài)變化人為分為2種類(lèi)型（Ⅰ和Ⅱ），每個(gè)類(lèi)型都各經(jīng)歷5個(gè)變化階段。類(lèi)型Ⅰ包括a、b、c、d、e階段；類(lèi)型Ⅱ包括A、B、C、D、E階段。這2種類(lèi)型的主要差別在于糊粉層細(xì)胞最終是否形成中央大液泡（圖1-e和圖1-E）。

2.2 萌發(fā)的水稻種子糊粉層發(fā)生PCD的細(xì)胞特征

通過(guò)對(duì)正常條件下培養(yǎng)4 d的水稻糊粉層細(xì)胞進(jìn)行吖啶橙（Acridine orange，AO）染色，并用熒光顯微鏡觀察（圖2），發(fā)現(xiàn)AO的熒光強(qiáng)度與胚的位置之間存在對(duì)應(yīng)關(guān)系，即離胚越遠(yuǎn)，熒光強(qiáng)度越強(qiáng)（圖2-A）。進(jìn)一步觀察還發(fā)現(xiàn)，在最靠近胚的地方部分（圖2-B、圖2-D）細(xì)胞的液泡化已經(jīng)結(jié)束，細(xì)胞中央只有一個(gè)細(xì)胞核，在形態(tài)上表現(xiàn)出了類(lèi)型I-e的特點(diǎn)（圖2-d）；較近胚的糊粉層細(xì)胞逐步表現(xiàn)出胞內(nèi)有少數(shù)貯藏蛋白小泡，類(lèi)似類(lèi)型Ⅰ-d的特點(diǎn)（圖2-e）。而離胚稍遠(yuǎn)的細(xì)胞則體現(xiàn)出Ⅱ-B的特點(diǎn)（圖2-f）。通過(guò)AO染色，發(fā)現(xiàn)在正常培養(yǎng)條件下，糊粉層細(xì)胞熒光強(qiáng)度與液泡化之間存在負(fù)相關(guān)，即液泡化程度越高，熒光強(qiáng)度越低。

2.3 近胚端糊粉層發(fā)生PCD的細(xì)胞特征

通過(guò)對(duì)正常條件下培養(yǎng)6 d的糊粉層細(xì)胞進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，近胚端糊粉層細(xì)胞的液泡化、與胚的距離及AO染色熒光強(qiáng)度這三者之間的關(guān)系更加明顯（圖3）?？傮w上仍為：距離胚越近的糊粉層細(xì)胞，AO染色熒光強(qiáng)度越低，甚至有的細(xì)胞表現(xiàn)出陰性；距離胚越遠(yuǎn)的糊粉層細(xì)胞AO染色熒光強(qiáng)度越高（圖3-A）。通過(guò)對(duì)不同部位糊粉層細(xì)胞的進(jìn)一步觀察，發(fā)現(xiàn)這5個(gè)區(qū)域（圖3-b～f）的細(xì)胞依次表現(xiàn)出類(lèi)型Ⅰ的a、b、c、e階段的細(xì)胞特點(diǎn)和液泡化特征。隨著液泡化的進(jìn)行，AO染色熒光逐漸降低，最終消失（圖3-B～F）。說(shuō)明在正常情況下，糊粉層細(xì)胞在液泡化的同時(shí)伴隨著PCD的發(fā)生。

2.4 遠(yuǎn)胚端糊粉層發(fā)生PCD的細(xì)胞特征

通過(guò)對(duì)正常條件下萌發(fā)水稻種子的遠(yuǎn)胚端糊粉層細(xì)胞的觀察（圖4-Ⅰ、圖4-Ⅱ），發(fā)現(xiàn)在正常處理9 d后的遠(yuǎn)胚端糊粉層，細(xì)胞液泡化類(lèi)型比較多樣，在同一區(qū)域出現(xiàn)了類(lèi)型Ⅱ-B（圖4-d）、類(lèi)型Ⅱ-D（圖4-c）類(lèi)型Ⅱ-E（圖4-a、圖4-b）。通過(guò)AO熒光染色觀察，發(fā)現(xiàn)這幾類(lèi)不同液泡化水平的細(xì)胞AO染色均呈陽(yáng)性，同時(shí)類(lèi)型Ⅱ-E（圖4-a、圖4-b）的細(xì)胞核被中央大液泡擠到細(xì)胞一側(cè)邊緣，AO染色呈現(xiàn)明顯的綠色熒光，說(shuō)明DNA沒(méi)有被降解。

2.5 水稻糊粉層細(xì)胞原生質(zhì)體的形態(tài)觀察

通過(guò)用FDA染色可檢測(cè)糊粉層原生質(zhì)體的活性。從圖5可以明顯地看出，隨著液泡化的發(fā)生，貯藏蛋白小泡逐漸變大并幾乎占據(jù)細(xì)胞質(zhì)整個(gè)空間。一開(kāi)始，蛋白貯藏小泡較小，均勻分散在細(xì)胞質(zhì)中，因此，整個(gè)細(xì)胞質(zhì)都呈現(xiàn)均勻的FDA熒光（圖5-A）；當(dāng)糊粉層細(xì)胞發(fā)生液泡化，細(xì)胞質(zhì)逐漸被擠到蛋白貯藏小泡外圍，分布在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)（圖5-B）；隨著液泡化程度的加深，細(xì)胞質(zhì)被2個(gè)大液泡壓縮成一小部分，處于2個(gè)大液泡間，大液泡另一側(cè)則與細(xì)胞膜重合（圖5-C）；最后中央大液泡占據(jù)整個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞膜的完整性被破壞，細(xì)胞死亡，F(xiàn)DA染色呈陰性（圖5-D）。

3 討論與結(jié)論

正常條件下種子萌發(fā)過(guò)程中，在胚釋放出的赤霉素（GA）誘導(dǎo)下，糊粉層細(xì)胞產(chǎn)生一系列水解酶（水解酶、蛋白酶等）以分解胚乳中貯藏的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[13]，使胚乳組織從盾片向頂端逐漸解體，胚乳逐漸形成膠狀體；隨后糊粉層細(xì)胞內(nèi)的糊粉粒與原球體開(kāi)始解體，為胚的前期生長(zhǎng)提供養(yǎng)分。當(dāng)糊粉層細(xì)胞完成分泌功能后，發(fā)生細(xì)胞程序性死亡，剩余部分相互融合并液泡化，最終成為無(wú)結(jié)構(gòu)的液滴[14]。Fath等[1-2]研究發(fā)現(xiàn)，大麥糊粉層細(xì)胞死亡過(guò)程伴隨著液泡化、質(zhì)膜完整性喪失、蛋白酶和核酸酶活力增加、細(xì)胞消失，同時(shí)DNA降解后不形成典型的180～200 bp的DNA條帶，類(lèi)似細(xì)胞自溶， 具有非典型凋亡PCD的特點(diǎn)， 本研究也證實(shí)了糊粉層細(xì)胞PCD的過(guò)程中并不形成180～200 bp的DNA條帶（數(shù)據(jù)未列）。 Bethke等[5]提出大麥糊粉層細(xì)胞的液泡化可以作為形態(tài)學(xué)特征之一，用以反映細(xì)胞PCD的進(jìn)程。

通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)，在正常條件下糊粉層細(xì)胞的液泡化在形態(tài)上可以反映糊粉層細(xì)胞PCD的進(jìn)程。同時(shí)發(fā)現(xiàn)糊粉層細(xì)胞液泡化不但具有時(shí)間效應(yīng)， 還同時(shí)具有位置效應(yīng)（圖1～4）。 為了便于對(duì)糊粉層液泡化的細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行分析研究，把2種最終液泡化形態(tài)不同的細(xì)胞人為分為2種類(lèi)型（Ⅰ和Ⅱ）， 每個(gè)類(lèi)型都各經(jīng)歷5個(gè)變化階段， 即類(lèi)型Ⅰ包括a、 b、c、 d、 e階段；類(lèi)型Ⅱ包括A、 B、 C、 D、 E階段（圖1）。 類(lèi)型Ⅰ主要分布在近胚端糊粉層，類(lèi)型Ⅱ主要分布在遠(yuǎn)胚端糊粉層。

類(lèi)型Ⅰ細(xì)胞靠近胚的地方， 受胚的影響較大，胚分泌的一些激素（如GA）對(duì)其產(chǎn)生顯著影響， 同時(shí)其自身分泌的酶類(lèi)和生物活性物質(zhì)也較多，對(duì)細(xì)胞形態(tài)和功能均會(huì)造成一定的影響，最終導(dǎo)致類(lèi)型Ⅰ在經(jīng)歷階段d、 e后糊粉層細(xì)胞不形成完整的中央大液泡，類(lèi)型Ⅰ糊粉層細(xì)胞相同時(shí)間內(nèi)發(fā)生液泡化的程度與胚的位置有關(guān)。 經(jīng)AO熒光染色后， 發(fā)現(xiàn)DNA的降解在空間上表現(xiàn)出明顯的梯度： 距離胚越近， DNA降解越快， 液泡化程度越大（圖2、3）。 Bethke等[5，12] 的研究也證明了大麥活體糊粉層細(xì)胞PCD受到胚的位置調(diào)控， 靠近胚的糊粉層細(xì)胞最先發(fā)生PCD，這可能與胚產(chǎn)生的植物激素GA和ABA的互相拮抗有關(guān)。

類(lèi)型Ⅱ細(xì)胞由于離胚較遠(yuǎn)， 受胚的影響較小，細(xì)胞形態(tài)的變化在位置上表現(xiàn)不明顯，有時(shí)在同一位置出現(xiàn)多種類(lèi)型液泡化的細(xì)胞（圖4）。 糊粉層細(xì)胞形態(tài)的變化， 也主要反映在不同時(shí)間上（圖1-A～E）， 在經(jīng)歷階段D、E后，形成中央大液泡。 Bethke等[5]在利用GA誘導(dǎo)大麥糊粉層細(xì)胞PCD的研究中，發(fā)現(xiàn)液泡化的類(lèi)型和進(jìn)程與本研究描述的類(lèi)型Ⅱ相似（圖1-A～E）。

原生質(zhì)體是研究糊粉層細(xì)胞PCD的良好材料。在本研究中， 通過(guò)FDA染色，檢測(cè)原生質(zhì)體存活率。 從圖5-A、 B、 C 中可見(jiàn)，這3種類(lèi)型細(xì)胞的原生質(zhì)體都具有良好活性， 其中A型的活性最高，B型次之， C型最低， D型則為死細(xì)胞的原生質(zhì)體， 而液泡化程度則剛好相反。研究結(jié)果再次證明了在正常條件下，糊粉層細(xì)胞液泡化程度反映了PCD的進(jìn)程。 同時(shí)， 在制備的原生質(zhì)體中， 主要都是液泡化不明顯的A型細(xì)胞的原生質(zhì)體（圖5），其活性最強(qiáng)， 可以用于進(jìn)一步的試驗(yàn)研究。

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