陳澤斌 李冰 王定康 徐勝光 劉佳妮 余磊 張永福 任禛 靳松

摘要：【目的】調(diào)查白芨內(nèi)生細(xì)菌種類及多樣性，為更好地保護(hù)和開發(fā)利用白芨資源提供科學(xué)依據(jù)?！痉椒ā繎?yīng)用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)測(cè)定白芨內(nèi)生細(xì)菌的16S rDNA-V4變異區(qū)序列，應(yīng)用Qiime和Mothur等軟件整理和統(tǒng)計(jì)樣品序列數(shù)目和操作分類單元（OTUs）數(shù)量，分析物種豐度及分布的差異。【結(jié)果】獲得用于分析的有效序列和OTU數(shù)為49550/48；稀釋曲線表明測(cè)序深度充分，OTU的數(shù)量接近于飽和。白芨內(nèi)生細(xì)菌主要分布于鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas，32.26%）、地桿菌屬（Pedobacter，16.13%）、鹽單胞菌屬（Halomonas，16.13%）、土壤桿菌屬（Agrobacterium，12.90%）、Kaistobacter屬（6.45%）、希瓦氏菌屬（Shewanella， 6.45%）、假單胞菌屬（Pseudomonas，6.45%）和短波單胞菌屬（Brevundimonas，3.23%）8個(gè)屬?！窘Y(jié)論】鞘脂單胞菌屬、地桿菌屬、鹽單胞菌屬和土壤桿菌屬是白芨內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)種群。Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)能準(zhǔn)確反映植物內(nèi)生微生物的種類組成和真實(shí)比例，在植物內(nèi)生微生物研究中具有明顯的優(yōu)勢(shì)和可行性。

關(guān)鍵詞： 高通量測(cè)序；白芨；內(nèi)生細(xì)菌；多樣性

中圖分類號(hào)： Q939.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2016）02-0227-07

0 引言

【研究意義】白芨（Bletilla striata）又名連及草、甘根、白給、箬蘭、朱蘭、紫蘭、紫蕙、百笠，為多年生草本球根植物（塊根），株高18～60 cm，主要分布于我國(guó)、日本及緬甸北部（趙杰和毛曉健，2008）。白芨具有廣泛的藥用價(jià)值和園林價(jià)值，藥用主要用于收斂止血、消腫生?。ê椭緥傻?，2008）。白芨的種子自然萌發(fā)率極低，繁殖困難，野生資源稀少，由于需求量大，野生資源已瀕臨枯竭，現(xiàn)已列入《瀕危動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約》予以保護(hù)（林福林等，2013）。內(nèi)生菌是指其生活史中的某一段時(shí)期生活在健康植物組織內(nèi)部，不引起植物組織明顯侵染及癥狀改變的一類菌（Schulz et al.，2006）。關(guān)于植物內(nèi)生細(xì)菌，現(xiàn)已從多種健康植物的根、莖、葉、果實(shí)和種子中分離出包括革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌共計(jì)達(dá)219種（隸屬于71個(gè)屬）植物內(nèi)生細(xì)菌（Schulz et al.，2006）。目前比較系統(tǒng)研究的植物有棉花、小麥、水稻和花生（胡桂萍等，2010），發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)種類主要分布于假單胞屬（Pseudommonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、腸桿菌屬（Enterobacter）和土壤桿菌屬（Agrobacterium）4個(gè)屬，且尚未發(fā)現(xiàn)不存在內(nèi)生細(xì)菌的植物種類或器官（徐亞軍，2011）。已有研究表明，內(nèi)生細(xì)菌在植物種子萌發(fā)（候曉強(qiáng)和郭順星，2014）、抵御病原菌侵染（何勁等，2014）、促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)中起著重要作用（徐文婷等，2014），同時(shí)內(nèi)生細(xì)菌也是生物活性物質(zhì)篩選的重要來源（童文君等，2014）。研究植物內(nèi)生細(xì)菌多樣性，對(duì)揭示植物內(nèi)生細(xì)菌的相互作用機(jī)制，有效利用內(nèi)生細(xì)菌資源具有重要意義。白芨是溫帶地生蘭科植物中最具經(jīng)濟(jì)價(jià)值的類群之一，因此有必要對(duì)白芨內(nèi)生細(xì)菌的種類組成進(jìn)行研究?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來，植物內(nèi)生菌作為生物活性物質(zhì)篩選的重要來源已引起人們的廣泛關(guān)注（郭良棟，2001；任愛梅等，2010；Sun and Guo，2012）。在藥用植物內(nèi)生真菌研究方面，自Stierle等（1993）從短葉紅豆杉的樹皮中分離得到一株能產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌以來，藥用植物內(nèi)生真菌成為研究熱點(diǎn)（楊顯志等，2003；樊有賦等，2008；杜少康等，2009），研究發(fā)現(xiàn)藥用植物內(nèi)生真菌多以雙核菌門子囊菌亞門中的核菌綱、盤菌綱和腔菌綱及其無性態(tài)型組成，也包括一些擔(dān)子菌和接合菌（Petrini et al.，1991；Sinclair and Cerkauskas，1996）。在藥用植物內(nèi)生細(xì)菌研究方面，發(fā)現(xiàn)藥用植物內(nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢(shì)類群多為芽孢桿菌屬細(xì)菌。魏娟等（2015）對(duì)云南重樓的內(nèi)生細(xì)菌分別進(jìn)行分離鑒定，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬、腸桿菌屬和克雷伯氏菌屬是其優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌群；童文君等（2014）對(duì)美花石斛內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離鑒定，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬、微桿菌屬和腸桿菌屬為優(yōu)勢(shì)屬；楊夢(mèng)莉等（2014）對(duì)巖白菜中內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離鑒定，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬和假單孢屬為其優(yōu)勢(shì)屬；李淑彬等（2015）對(duì)高良姜內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離鑒定，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌、甲基桿菌分別為其最、次優(yōu)勢(shì)種群；杜曉寧等（2015）對(duì)寧夏枸杞中內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離鑒定，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬為枸杞優(yōu)勢(shì)內(nèi)生菌群。但是現(xiàn)有研究表明，分離培養(yǎng)方法分析的細(xì)菌僅限于那些能夠在人工培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的細(xì)菌，這些可培養(yǎng)細(xì)菌僅占環(huán)境生物總數(shù)的0.1%～10.0%（Ammann et al.，1995；Tholozan et al.，1999），因此有必要采用非培養(yǎng)方法對(duì)植物內(nèi)生細(xì)菌種類組成進(jìn)行研究?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前關(guān)于白芨的研究主要集中在人工繁殖、化學(xué)成分分析和藥理作用等方面（劉瑩等，2008；袁寧等，2009；孫達(dá)鋒等，2009），有關(guān)白芨內(nèi)生細(xì)菌多樣性的研究未見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用近年來新興起的個(gè)人型高通量DNA測(cè)序系統(tǒng)（Illumina MiSeq）對(duì)白芨內(nèi)生細(xì)菌種類組成進(jìn)行研究，以檢測(cè)采用傳統(tǒng)純培養(yǎng)和非培養(yǎng)技術(shù)未能發(fā)現(xiàn)的低豐度植物內(nèi)生細(xì)菌種類，探究白芨內(nèi)生細(xì)菌種類多樣性，為更好地保護(hù)和開發(fā)利用白芨資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

2014年8月于云南盛南白芨種植基地采集20株無明顯病害的白芨，取白芨假鱗莖塊根部分為分析樣品，均勻混合后放入無菌樣品袋中，低溫保鮮，于24 h內(nèi)進(jìn)行表面消毒處理，樣品名為BJ。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 表面消毒 將新鮮白芨假鱗莖塊根部分用自來水沖洗干凈，再用75%乙醇浸泡1 min，無菌水沖洗3次，用無菌濾紙吸干表面水分。表面消毒效果檢驗(yàn)參照陳澤斌等（2014）的方法。

1. 2. 2 總DNA提取 按陳澤斌等（2012）的方法提取白芨假鱗莖塊根總DNA，并用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢查DNA的純度和濃度。取適量樣品于離心管中，用無菌水稀釋樣品至1 ng/μL。

1. 2. 3 16S rDNA-V4區(qū)的PCR擴(kuò)增 以稀釋后的基因組DNA為模板，用帶Barcode的16S rDNA-V4區(qū)特異引物515F（5'-GTTTCGGTGCCAGCMGCCGCGGT

AA-3'）和806R（5'-AGTTCCGGACTACHVGGGTWTC

TAAT-3'），使用高效和高保真酶（New England Biolabs公司的Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer）進(jìn)行PCR，確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性。

1. 2. 4 PCR產(chǎn)物的混樣和純化 PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)；根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等濃度混樣，充分混勻后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，使用Thermo Scientific公司的Gene JET膠回收試劑盒切膠回收產(chǎn)物。

1. 2. 5 文庫構(gòu)建和上機(jī)測(cè)序 用TruSeq DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)Qubit和QPCR定量，文庫合格后，使用Miseq進(jìn)行上機(jī)測(cè)序（Youssef et al.，2009；Caporaso et al.，2011；Hess et al.，2011；Luo et al.，2012）。測(cè)序委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成。

1. 3 生物信息學(xué)分析

測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)存在一定比例的干擾數(shù)據(jù)，為了使信息分析的結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠，首先對(duì)原始數(shù)據(jù)經(jīng)過拼接、過濾、去嵌合體后得到有效數(shù)據(jù)（Edgar et al.，2011），剔除宿主葉綠體和線粒體序列，然后對(duì)有效數(shù)據(jù)在97%水平上進(jìn)行OUT聚類，并利用Greengene數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋（Edgar，2013）。通過對(duì)OTUs進(jìn)行豐度、Alpha多樣性及物種在各分類水平上的群落結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析，可以得到微生物群落組成（Wang et al.，2007）；再通過Beta多樣性分析，研究環(huán)境樣本間的微生物群落結(jié)構(gòu)差異（DeSantis et al.，2006）。

1. 4 數(shù)據(jù)分析

利用Uparse（version 7.1 http：//qiime.org/）軟件平臺(tái)進(jìn)行OTU聚類，采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，并在各水平上統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品的群落組成；利用Mothur軟件進(jìn)行稀釋曲線分析；分別利用香農(nóng)指數(shù)（Shannon）、辛普森指數(shù)（Simpson）和物種豐富度指數(shù)（ACE）公式計(jì)算細(xì)菌生態(tài)多樣性指數(shù)；利用Fasttree軟件+R語言制作熱圖；利用諾禾致源自主開發(fā)的SVG軟件制作特定物種分類樹圖。

2 結(jié)果與分析

2. 1 序列長(zhǎng)度分布

白芨樣品所測(cè)得的49580條PE Reads長(zhǎng)度分布在191～351 bp范圍內(nèi)，其中以長(zhǎng)度為251 bp的序列最多，有48987條（圖1）。從序列長(zhǎng)度的分布來看，與16S rDNA-V4區(qū)序列長(zhǎng)度大致吻合。

2. 2 樣品復(fù)雜度分析

從稀釋曲線（圖2）可以看出，隨著測(cè)序數(shù)量的增加，稀釋曲線斜率逐漸降低，趨向平坦但未進(jìn)入平臺(tái)期，說明再增加測(cè)序數(shù)量也只會(huì)產(chǎn)生少量新的OTUs；從Chao1指數(shù)曲線（圖3）可以看出，Chao1指數(shù)在0～5000的測(cè)序數(shù)量范圍內(nèi)增幅最大，在5000以后曲線斜率下降；從Shannon指數(shù)曲線（圖4）可以看出，Shannon指數(shù)在0～5000的測(cè)序數(shù)量范圍內(nèi)增幅最大，在5000以后曲線斜率下降。3條多樣性指數(shù)曲線在測(cè)序數(shù)量超過一定數(shù)量后均趨于平緩，說明測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映樣品中絕大多數(shù)的微生物信息。

2. 3 OTUs數(shù)目統(tǒng)計(jì)及物種注釋分析

白芨樣品共獲得49550條Tags（過濾后得到的拼接序列數(shù)），可分為48個(gè)OTUs（97%的序列相似性，下同），包括941條低頻Tags和48609條可以獲得注釋的Tags（圖5）。圖6為白芨樣品中相對(duì)豐度排名前8個(gè)屬細(xì)菌所對(duì)應(yīng)的OTUs的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系數(shù)據(jù)，表明白芨內(nèi)生細(xì)菌主要分布于8個(gè)屬：地桿菌屬（Pedobacter）、短波單胞菌屬（Brevundimonas）、土壤桿菌屬（Agrobacterium）、Kaistobacter屬、鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）、希瓦氏菌屬（Shewanella）、鹽單胞菌屬（Halomonas）和假單胞菌屬（Pseudomonas）。從OTUs豐度聚類圖（圖7）可以看出，在屬的分類水平上相對(duì)豐度由大到小依次為：鞘脂單胞菌屬>地桿菌屬=鹽單胞菌屬>土壤桿菌屬>Kaistobacter屬=希瓦氏菌屬=假單胞菌屬>短波單胞菌屬。

2. 4 多樣品中特定物種分類樹

從門的分類水平來看，白芨內(nèi)生細(xì)菌分布在擬桿菌門（Bacteroidetes，16.13%）和變形菌門（Proteobacteria，83.87%）；從綱的分類水平來看，白芨內(nèi)生細(xì)菌在Sphingobacteriia綱（16.13%）、α-變形菌綱（Alphaproteobacteria，54.84%）和γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria，29.03%）中均有分布；從目的分類水平來看，白芨內(nèi)生細(xì)菌在鞘脂桿菌目（Sphingobacteriales，16.13%）、柄桿菌目（Caulobacterales，3.23%）、根瘤菌目（Rhizobiales，12.90%）、根瘤菌目（Sphingomonadales，38.71%）、交替單胞菌目（Alteromonadales，6.45%）、海洋螺菌目（Oceanospirillales，16.13%）和假單胞菌目（Pseudomonadales，6.45%）中均有分布；從科的分類水平來看，白芨內(nèi)生細(xì)菌在鞘脂桿菌科（Sphingobacteriaceae，16.13%）、柄桿菌科（Caulobacteraceae，12.90%）、鞘脂單胞菌科（Sphingomonadaceae，38.71%）、希萬氏菌科（Shewanellaceae，6.45%）、鹽單胞菌科（Halomonadaceae，16.13%）和假單胞菌科（Pseudomonadaceae，6.45%）中均有分布；從屬的分類水平來看，白芨內(nèi)生細(xì)菌在地桿菌屬（Pedobacter，16.13%）、短波單胞菌屬（Brevundimonas，3.23%）、土壤桿菌屬（Agrobacterium，12.90%）、Kaistobacter屬（6.45%）、鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas，32.26%）、希瓦氏菌屬（Shewanella， 6.45%）、鹽單胞菌屬（Halomonas，16.13%）和假單胞菌屬（Pseudomonas，6.45%）中均有分布（圖8）。由此可見，鞘脂單胞菌屬、地桿菌屬、鹽單胞菌屬和土壤桿菌屬為白芨內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)種群。

3 討論

16S rRNA基因很早就應(yīng)用于微生物種類鑒定，但利用高通量測(cè)序進(jìn)行16S rRNA分析最早出現(xiàn)在2006年，如Sogin等（2006）應(yīng)用該技術(shù)對(duì)深海微生物群落進(jìn)行了分析，隨后該技術(shù)在腸道微生物領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用（南春燕等，2013），但將該技術(shù)應(yīng)用于植物內(nèi)生微生物的研究未見報(bào)道。本研究首次將近幾年迅速發(fā)展并成為主流的Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于植物內(nèi)生細(xì)菌研究，克服了傳統(tǒng)分子生物學(xué)方法通量低的缺陷，從基因組的水平上解析微生物群落結(jié)構(gòu)，突破了很多厭氧內(nèi)生微生物不能被分離培養(yǎng)的技術(shù)瓶頸（Ammann et al.，1995；Tholozan et al.，1999）。16S rRNA位于原核細(xì)胞核糖體小亞基上，包括 10個(gè)保守區(qū)域和9個(gè)高變區(qū)域，其中保守區(qū)在細(xì)菌間差異不明顯，高變區(qū)具有屬或種的特異性，隨親緣關(guān)系不同有一定的差異，因此，16S rDNA作為揭示生物物種的特征核酸序列，被認(rèn)為是最適于細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育和分類鑒定的指標(biāo)。16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序，通常是選擇某個(gè)或某幾個(gè)變異區(qū)域，利用保守區(qū)設(shè)計(jì)通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后對(duì)高變區(qū)進(jìn)行測(cè)序分析和菌種鑒定，成為研究環(huán)境樣品中微生物組成結(jié)構(gòu)的重要手段。但就植物組織而言，葉綠體和線粒體與細(xì)菌在系統(tǒng)發(fā)育上具有高度的同源性（胡楷和吳慶書，2002），在對(duì)白芨內(nèi)生細(xì)菌的16S rDNA-V4變異區(qū)序列進(jìn)行Illumina MiSeq高通量測(cè)序后，確實(shí)發(fā)現(xiàn)部分序列歸屬于宿主葉綠體和線粒體，存在一定比例的宿主污染現(xiàn)象，為了使細(xì)菌多樣性的分析結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠，本研究剔除了宿主葉綠體和線粒體序列。為避開線粒體和葉綠體的干擾，下一步應(yīng)在不同高通量測(cè)序平臺(tái)上針對(duì)16S rDNA的9個(gè)高變區(qū)的選擇及組合做更多嘗試，評(píng)估樣本的復(fù)雜程度及宿主的污染情況，選擇合理的測(cè)序區(qū)域或設(shè)計(jì)特異性更高的引物，制定更好的測(cè)序策略，從而將高通量測(cè)序技術(shù)更好地應(yīng)用于植物內(nèi)生細(xì)菌研究。

目前關(guān)于白芨內(nèi)生細(xì)菌多樣性的研究尚無報(bào)道，但通過傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法發(fā)現(xiàn)其他植物內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)類群均為芽孢桿菌屬（Bacillus）細(xì)菌（丁雅迪等，2015），與本研究結(jié)果不一致。這也從側(cè)面反映出植物內(nèi)生細(xì)菌中未培養(yǎng)微生物占很大比例，培養(yǎng)方法分析的細(xì)菌僅限于那些能夠在人工培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的細(xì)菌，一些適合于分離培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)條件的菌株在分離過程中大量富集，而不適合于分離培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)條件的菌株在分離過程中逐漸衰退。許多研究已經(jīng)證實(shí)，通過傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法鑒定的微生物僅占環(huán)境生物總數(shù)的0.1%～10.0%（Ammann et al.，1995；Tholozan et al.，1999），說明通過傳統(tǒng)培養(yǎng)方法得到的結(jié)果并不能真實(shí)反映內(nèi)生細(xì)菌的多樣性。因此，采用高通量測(cè)序的研究方法與傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法相比，發(fā)現(xiàn)的內(nèi)生細(xì)菌種類不但豐富度可能有差別，而且優(yōu)勢(shì)種群也可能不同。已有研究表明，鞘脂單胞菌屬細(xì)菌能夠利用的底物廣泛，從多環(huán)芳烴類化合物、聚乙烯醇等高聚物到簡(jiǎn)單無機(jī)物N2+均能利用，某些種屬還能產(chǎn)生有價(jià)值的生物高分子（如β-胡蘿卜素、結(jié)冷膠）（胡杰等，2007），說明白芨內(nèi)生細(xì)菌可為復(fù)雜有機(jī)物的降解提供良好的微生物來源。至今，關(guān)于鹽單胞菌屬和短波單胞菌屬細(xì)菌功能、代謝的研究未見報(bào)道，其作為內(nèi)生細(xì)菌的主要類群尚屬首次報(bào)道。

盡管高通量測(cè)序技術(shù)可以克服不可培養(yǎng)的困難，但是該技術(shù)也存在弊端，由于測(cè)序讀長(zhǎng)相比Sanger一代測(cè)序短得多，再加上用于序列比對(duì)的數(shù)據(jù)庫目前還不夠完善，使得多數(shù)序列均無法被注釋到種的水平，因此，快速、準(zhǔn)確及全面的植物內(nèi)生微生物多樣性研究仍需要多種方法結(jié)合來完成。

4 結(jié)論

白芨內(nèi)生細(xì)菌主要由地桿菌屬、短波單胞菌屬、土壤桿菌屬、Kaistobacter屬、鞘脂單胞菌屬、希瓦氏菌屬、鹽單胞菌屬和假單胞菌屬等8個(gè)屬組成，其中，鞘脂單胞菌屬、地桿菌屬、鹽單胞菌屬和土壤桿菌屬為優(yōu)勢(shì)種群。采用llumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)可以檢測(cè)到采用傳統(tǒng)純培養(yǎng)和非培養(yǎng)技術(shù)未能發(fā)現(xiàn)的低豐度植物內(nèi)生細(xì)菌種類，能準(zhǔn)確反映植物內(nèi)生微生物的種類組成和真實(shí)比例，在植物內(nèi)生微生物研究中具有的明顯優(yōu)勢(shì)和可行性。

參考文獻(xiàn)：

陳澤斌， 代方平， 寸林江， 李啟， 陳艷芳， 許石劍， 方飛， 黃楊. 2014. 煙草內(nèi)生細(xì)菌分離方法的優(yōu)化研究[J]. 中國(guó)煙草學(xué)報(bào)， 20（1）： 90-95.

Chen Z B， Dai F P， Cun L J， Li Q， Chen Y F， Xu S J， Fang F， Huang Y. 2014. Research on separation optimization of endophytic bacteria in tobacco[J]. Acta Tabacaria Sinica， 20（1）： 90-95.

陳澤斌， 夏振遠(yuǎn)， 雷麗萍， 劉飛， 陳海如， 鐘永麗. 2012. 非培養(yǎng)方法解析煙草根部?jī)?nèi)生細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)， 27（1）： 201-209.

Chen Z B， Xia Z Y， Lei L P， Liu F， Chen H R， Zhong Y L. 2012. Investigation of endophytic bacterial community structure within the tobacco roots using culture independent techniques[J]. Acta Agriculturae Boreali-Sinica， 27（1）： 201-209.

丁雅迪， 熊智， 王明月， 劉紹雄， 毛德昌， 謝恩來， 王金華. 2015. 文山石漠化地區(qū)豆科植物根瘤內(nèi)生細(xì)菌多樣性分析[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 46（4）： 602-608.

Ding Y D， Xiong Z， Wang M Y， Liu S X， Mao D C， Xie E L， Wang J H. 2015. Diversity analysis of endophytic bacterial separated from the leguminous plants nodules of Wenshan rocky desertification areas[J]. Journal of Southern Agriculture， 46（4）： 602-608.

杜少康， 陳雙林， 林岱， 吳鳴謙， 王梅霞. 2009. 銀杏葉部?jī)?nèi)生真菌多樣性的研究[J]. 菌物學(xué)報(bào)， 28（4）： 504-511.

Du S K， Chen S L， Lin D， Wu M Q， Wang M X. 2009. Diversity of endophytic fungi in leaves of Ginkgo biloba[J]. Mycosystema， 28（4）： 504-511.

杜曉寧， 徐惠娟， 黃盼盼， 代金霞. 2015. 寧夏枸杞內(nèi)生細(xì)菌的多樣性及其抑菌活性研究[J]. 微生物學(xué)通報(bào)， 42（9）： 1779-1787.

Du X N， Xu H J， Huang P P， Dai J X. 2015. Diversity and antimicrobial activity of endophytic bacteria isolated from Lyciumn barbarum of Ningxia[J]. Microbiology China， 42（9）： 1779-1787.

樊有賦， 甘金蓮， 陳曄， 彭琴， 詹壽發(fā). 2008. 藥用蕨類植物狗脊內(nèi)生真菌的初步研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 36（9）： 3737-3755.

Fan Y F， Gan J L， Chen Y， Peng Q， Zhan S F. 2008. Preliminary study on the endophytic fungi in a medicinal fern Cibotium barometz[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences， 36（9）： 3737-3755.

郭良棟. 2001. 內(nèi)生真菌研究進(jìn)展[J]. 菌物系統(tǒng)， 20（1）： 148-152.

Guo L D. 2001. Advances in endophyic fungi[J]. Mycosystema， 20（1）： 148-152.

何勁， 雷幫星， 宋貞富， 耿坤， 康冀川. 2014. 石斛內(nèi)生細(xì)菌DEB-2對(duì)5種辣椒病原真菌的抑制作用[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)， 41（2）： 157-162.

He J， Lei B X， Song Z F， Geng K， Kang J C. 2014. Determination of the inhibitory effect of endophyte DEB-2 on five pepper fungal pathogens in the laboratory[J]. Acta Phytophylacica Sinica， 41（2）： 157-162.

和志嬌， 呂麗芬， 楊麗云， 徐中志， 和加衛(wèi)， 程在全， 康平德， 袁理春. 2008. 白芨種質(zhì)資源遺傳多樣性的ISSR分析[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 21（4）： 1081-1085.

He Z J， Lü L F， Yang L Y， Xu Z Z， He J W， Cheng Z Q， Kang P D，Yuan L C. 2008. Genetic diversity of Bletilla rchb. f. germ plasms by ISSR analysis[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences， 21（4）：1081-1085.

侯曉強(qiáng)，郭順星. 2014. 鐵皮石斛促生長(zhǎng)內(nèi)生真菌的篩選與鑒定[J]. 中國(guó)中藥雜志， 39（17）： 3232-3237.

Hou X Q， Guo S X. 2014. Screening and identification of endophytic fungi with growth promoting effect on Dendrobium officinale[J]. China Journal of Chinese Materia Medica， 39（17）： 3232-3237.

胡桂萍， 鄭雪芳， 尤民生， 劉波. 2010. 植物內(nèi)生菌的研究進(jìn)展[J]. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 25（2）： 226-234.

Hu G P， Zheng X F， You M S， Liu B. 2010. Recent advances in research on endophytes[J]. Fujian Journal of Agricultu-

ral Sciences， 25（2）： 226-234.

胡杰， 何曉紅， 李大平， 劉強(qiáng). 2007. 鞘氨醇單胞菌研究進(jìn)展[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)， 13（3）： 431-437.

Hu J， He X H， Li D P， Liu Q. 2007. Progressin research of Sphingomonas[J]. Chinese Journal of Applied & Environmental Biology， 13（3）： 431-437.

胡楷， 吳慶書. 2002. 單細(xì)胞生物進(jìn)化研究的進(jìn)步[J]. 遺傳， 24（1）： 104-110.

Hu K， Wu Q S. 2002. The basic outline of the evolution of single cell life-form[J]. Hereditas， 24（1）： 104-110.

李淑彬， 黃娟， 周仁超， 李澤恩， 徐詩如， 阮婷， 龐啟華. 2015. 南藥植物高良姜內(nèi)生細(xì)菌多樣性及其促生潛力[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào)， 35（10）： 3204-3213.

Li S B， Huang J， Zhou R C， Li Z E， Xu S R， Ruan T， Pang Q H. 2015. Diversity and plant growth-promoting potential of bacterial endophytes of Alpinia officinarum Hance，a famous south-China medicinal plant[J]. Acta Ecologica Sinica， 35（10）： 3204-3213.

林福林， 楊昌云， 楊薇薇， 黃美蓉， 龐素秋. 2013. 中藥白芨的現(xiàn)代研究概況[J]. 中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志， 33（7）： 571-573.

Lin F L， Yang C Y， Yang W W， Huang M R， Pang S Q. 2013. Modern research of traditional Chinese medicine Bletilla[J]. Chinese Journal of Hospital Pharmacy， 33（7）： 571-573.

劉瑩， 崔炯莫， 李洪斌， 王艷萍， 湯真， 于海瑤， 吳艷云. 2008. 白芨超微粉對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍的影響[J]. 中草藥， 39（3）： 397-400.

Liu Y， Cui J M， Li H B， Wang Y P， Tang Z， Yu H Y， Wu Y Y. 2008. Effect of ultra-fine powder of Bletilla striata on experimental gastric ulcer in rats[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs， 39（3）： 397-400.

南春燕， 馬雅軍， 徐建農(nóng)， 梁健. 2013. 中華按蚊幼蟲腸道細(xì)菌宏基因組的組成研究[J]. 中國(guó)寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志， 31（2）： 114-119.

Nan C Y， Ma Y J， Xu J N， Liang J. 2013. Taxonomic composition of metagenomic community in the larval gut of mosquito Anopheles sinensis（Diptera： Culicidae）[J]. Chinese Journal of Parasitology and Parasitic Diseases， 31（2）： 114-119.

任愛梅， 張麗珂， 孟憲剛. 2010. 植物內(nèi)生真菌研究進(jìn)展與存在問題[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，（2）： 103-105.

Ren A M， Zhang L K， Meng X G. 2010. Research progress and existing problems of endophytic[J]. Guangdong Agricultural Sciences，（2）： 103-105.

孫達(dá)鋒， 史勁松， 張衛(wèi)明， 顧龔平， 朱昌玲， 薛華茂. 2009. 白芨多糖膠研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué)， 30（3）： 296-298.

Sun D F， Shi J S， Zhang W M， Gu G P， Zhu C L， Xue H M. 2009. Research progress on polysaccharide gum of Bletilla striata（Thunb.） Reichb. F[J]. Food Science， 30（3）： 296-298.

童文君， 張禮， 薛慶云， 侯北偉， 丁小余. 2014. 不同產(chǎn)地美花石斛內(nèi)生細(xì)菌分離及促生潛力比較[J]. 植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，23（1）： 16-23.

Tong W J， Zhang L， Xue Q Y， Hou B W， Ding X Y. 2014. Isolation of endophytic bacteria in Dendrobium loddigesii collected from different locations and comparison on their plant-growth-promoting potential[J]. Journal of Plant Resources and Environment， 23（1）： 16-23.

魏娟， 何冬旭， 李國(guó)紅， 張梁. 2015. 云南重樓內(nèi)生細(xì)菌的分離鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹分析[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)， 34（2）： 165-169.

Wei J， He D X， Li G H， Zhang L. 2015. Isolation and identification of endophytic bacteria in Paris polyphylla Smith var. yunnanensis（Franch） and phylogenetic analysis[J]. Journal of Food Science and Biotechnology， 34（2）： 165-169.

徐文婷， 張雅瓊， 董文漢， 白燕冰， 李澤生， 孫文麗， 楊生超， 謝世清， 梁泉. 2014. 石斛內(nèi)生真菌固體菌劑對(duì)鐵皮石斛組培苗促生作用研究[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 27（1）： 317-324.

Xu W T， Zhang Y Q， Dong W H， Bai Y B， Li Z S， Sun W L， Yang S C， Xie S Q， Liang Q. 2014. Growth promoting of Dendrobium endophytic fungus on Dendrobium officinale tissue culture seedlings[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences， 27（1）： 317-324.

徐亞軍. 2011. 植物內(nèi)生菌資源多樣性研究進(jìn)展[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，（24）： 149-152.

Xu Y J. 2011. Research progress on pesources diversity of plant endophytes[J]. Guangdong Agricultural Sciences，（24）： 149-152.

楊夢(mèng)莉， 郭鳳根， 賴泳紅， 崔曉龍， 王永霞， 肖煒， 沈銳. 2014. 巖白菜可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌多樣性分析[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)）， 29（3）： 315-320.

Yang M L， Guo F G， Lai Y H， Cui X L， Wang Y X， Xiao W， Shen R. 2014. Diversity of endophytic bacteria from Bergenia purpurascens[J]. Journal of Yunnan Agricultural University（Natural Science）， 29（3）： 315-320.

楊顯志， 郭仕平， 張玲琪， 邵華. 2003. 鬼臼類植物產(chǎn)鬼臼毒素內(nèi)生真菌的篩選[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)， 15（5）： 419-422.

Yang X Z， Guo S P， Zhang L Q， Shao H. 2003. Select of producing podophyllotoxin endophytic fungi from podophyllin plant[J]. Natural Product Research and Development， 15（5）： 419-422.

袁寧， 何俊蓉， 何銳， 李萍， 葉蘭香， 王海娥， 卓碧萍. 2009. 白芨組培快繁育苗技術(shù)研究[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 22（3）： 781-785.

Yuan N， He J R， He R， Li P， Ye L X， Wang H E， Zhuo B P. 2009. Tissue culture and rapid propagation of Bletilla striata[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences， 22（3）： 781-785.

趙杰， 毛曉健. 2008. 白芨的臨床應(yīng)用概況[J]. 中國(guó)民族民間醫(yī)藥，（5）： 28-29.

Zhao J， Mao X J. 2008. The clinical application of Bletilla[J]. Chinese Journal of Ethnomedicine and Ethnopharmacy， （5）： 28-29.

Ammann R R， Ludwig W， Schleifer K H. 1995. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation[J]. Microbiological Reviews， 59（1）： 143-169

Caporaso J G， Lauber C L， Walters W A， Berg-Lyons D， Lozupone C A， Turnbaugh P J， Fierer N， Knight R. 2011. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 108（S1）： 4516-4522.

DeSantis T Z， Hugenholtz P， Larsen N， Rojas M， Brodie E L， Keller K， Huber T， Dalevi D， Hu P， Andersen G L. 2006. Greengenes， a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB[J]. Applied and Environmental Microbiology， 72（7）： 5069-5072.

Edgar R C. 2013. UPARSE： highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads[J]. Nature Methods， 10（10）： 996-998.

Edgar R C， Haas B J， Clemente J C， Quince C， Knight R. 2011. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection[J]. Bioinformatics， 127（16）： 2194-2200.

Hess M， Sczyrba A， Egan R， Kim T W， Chokhawala H， Schroth G， Luo S， Clark D S， Chen F， Zhang T， Mackie R I， Pennacchio L A， Tringe S G， Visel A， Woyke T， Wang Z， Rubin E M. 2011. Metagenomic discovery of biomass-degrading genes and genomes from cow rumen[J]. Science， 331（6016）： 463-467.

Luo C， Tsementzi D， Kyrpides N， Read T， Konstantinidis K T. 2012. Direct comparisons of Illumina vs. Roche 454 sequencing technologies on the same microbial community DNA sample[J]. PloS One， 7（2）： e30087.

Petrinio， Fisher P J， Petrinile. 1991. Fungal endophytes of bracker （Pteridium aquilinum） with some reflections on their use in biological control[J]. Sydowia， 44（2）： 282-293.

Schulz B J， Boyle C J， Sieber T N. 2006. Microbial root endophytes[M]. Soil Biology，（9）： 17-18.

Sinclair J B， Cerkauskas. 1996. Latent infection vs endophytic colonization by fungi[M]. Minnesota： APS Press： 3-29.

Sogin M L， Morrison H G， Huber J A， Mark Welch D， Huse S M， Neal P R， Arrieta J M， Herndl G J. 2006. Microbial diversity in the deep sea and the underexplored “rare biosphere”[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 103（32）： 12115-12120.

Stierle A， Strobel G， Stierle D. 1993. Taxol and taxane production by Taxomyces andreana， an endophytic fungus of Pacific yew[J]. Science， 260： 214-216.

Sun X， Guo L D. 2012. Endophytic fungal diversity：review of traditional and molecular techniques[J]. Mycology， 3（1）： 65-76.

Tholozan J L， Cappelier J M， Tissier J P， Delattre G， Fede-

righi M. 1999. Physiological characterization of viable-but-nonculturable Campylobacter jejuni cells[J]. Applied and Environmental Microbiology， 65（3）： 1110-1116.

Wang Q， Garrity G M， Tiedje J M， Cole J R. 2007. Naive Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy[J]. Applied and Environmental Microbiology， 73（16）： 5261-5267.

Youssef N， Sheik C S， Krumholz L R， Najar F Z， Roe B A， Elshahed M S. 2009. Comparison of species richness estimates obtained using nearly complete fragments and simulated pyrosequencing-generated fragments in 16S rRNA gene-based environmental surveys[J]. Applied and Environmental Microbiology， 75（16）： 5227-5236.

（責(zé)任編輯 麻小燕）