李付鵬 秦曉威 郝朝運(yùn) 閆林 伍寶朵 賴劍雄

摘 要 利用15對(duì)SSR引物，分析具有廣泛來源的70份可可資源的遺傳多樣性。結(jié)果表明，15對(duì)引物共擴(kuò)增出76個(gè)條帶，其中50個(gè)多態(tài)性條帶，占總帶數(shù)的65.8%。70份可可資源間遺傳相似系數(shù)（SM）在0.341～0.943之間，平均值為0.625，說明可可資源具有豐富的遺傳多樣性。在相似系數(shù)為0.65水平上，可將70份可可資源分成10類。利用Structure 2.3.2軟件分析群體結(jié)構(gòu)，結(jié)合可可果實(shí)相關(guān)性狀的表型數(shù)據(jù)，采用Tassel 2.1的一般線性模型（General linear model，GLM）進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析；結(jié)果表明18個(gè)位點(diǎn)與果重、果殼重、果長(zhǎng)、果徑圍、果殼厚顯著相關(guān)（p<0.05），各位點(diǎn)對(duì)表型變異貢獻(xiàn)率為5.5%～13.1%。

關(guān)鍵詞 可可；SSR；遺傳多樣性；關(guān)聯(lián)分析

中圖分類號(hào) S571.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Genetic Diversity and Association Analysis of

Cacao Germplasm Using SSR Markers

LI Fupeng1，2，3， QIN Xiaowei1，2，3， HAO Chaoyun1，2，3， YAN Lin1，2，3，

WU Baoduo1，2，3， LAI Jianxiong1，2，3 *

1 Spice and Beverage Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Wanning， Hainan 571533， China

2 Tropical Spice and Beverage Germplasm Repository， Ministry of Agriculture， Wanning， Hainan 571533， China

3 Ministry of Agriculture Key Laboratory of Genetic Resources Utilization of Spice and Beverage Crops， Wanning， Hainan 571533， China

Abstract Fifteen SSR primers were used to study the genetic diversity among wide original 70 cacao germplasm resources. Seventy-six loci were detected by the 15 primers， of which 50 were polymorphic and its polymorphic ratio was amounted for 65.8%. The genetic similarity was ranged from 0.341 to 0.943 among the accessions， with an average of 0.625. The results indicated that the cacao accessions were rich in genetic diversity. Based on the dendrogram of UPGMA， 70 accessions could be divided into ten groups at the level of 0.65. Based on the analysis of population structure，an association analysis between SSR markers and pod agronomic traits were performed using the Tassel 2.1 GLM（general linear model）program. Of the SSR loci， 18 were significantly associated with pod weight， pod shell weight， pod length， pod equatorial circumference， and pod shell thickness under GLM program， and the ratio of explanation on the phenotype variation of related markers ranged from 5.5%-13.1%.

Key words Theobroma cacao L.； SSR marker； Genetic diversity； Associate analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.02.003

可可（Theobroma cacao L.）與咖啡、茶并稱世界三大飲料作物，全世界熱帶地區(qū)均有栽培[1]。2014年世界可可收獲面積為1.01×107 hm2，總產(chǎn)量4.30×106 t，預(yù)計(jì)未來種植面積將繼續(xù)擴(kuò)大[2]?？煽墒侵袊?guó)新興的熱帶特色經(jīng)濟(jì)作物，適宜在海南島東南部推廣種植，栽培管理簡(jiǎn)單，是典型的“懶人作物”，有巨大的發(fā)展?jié)摿3-4]。

可可以經(jīng)濟(jì)利用價(jià)值高在世界農(nóng)業(yè)發(fā)展中占有重要地位，種質(zhì)資源的多樣性一直備受研究人員關(guān)注。自Pound[5]首次在亞馬遜河流域開展可可抗病種質(zhì)資源調(diào)查以來，世界可可主產(chǎn)國(guó)相繼開展了資源普查與收集工作，現(xiàn)已建立了10多個(gè)國(guó)家級(jí)和3個(gè)國(guó)際級(jí)種質(zhì)資源保存中心[6]。傳統(tǒng)上，人們依據(jù)地理起源和形態(tài)特征將可可分成Criollo，F(xiàn)orastero和Trinitario（Criollo×Forastero）3大遺傳類群。Motamayor等[7]和Utro等[8]分別利用SSR標(biāo)記和基因組序列分析可可種質(zhì)遺傳多樣性，將可可劃分成10大遺傳類群：Amelonado，Contamana，Curaray，Guiana，Iquitos，Maraňón，Nanay，Purús，Criollo和Nacional，為可可種質(zhì)的遺傳多樣性研究提供了有益參考。

中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所從20世紀(jì)60年代開始，從世界可可主產(chǎn)區(qū)收集三大類可可遺傳資源近300份?？煽蔀楫惢ㄊ诜?，遺傳背景復(fù)雜，早期引進(jìn)的可可種質(zhì)經(jīng)過自然雜交又創(chuàng)制出大量表型特異的新種質(zhì)。Hansen等[9]首次將全基因組關(guān)聯(lián)分析用于植物后，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于小麥[10]、馬鈴薯[11-12]、木薯[13]等作物中。國(guó)外相繼在可可中開展了關(guān)聯(lián)研究，Schnell等[14]以149份可可資源為自然群體，利用46對(duì)SSR標(biāo)記的擴(kuò)增多態(tài)性與群體材料種苗豐產(chǎn)性進(jìn)行關(guān)聯(lián)，篩選出17個(gè)與豐產(chǎn)性顯著相關(guān)的位點(diǎn)。Marcano等[15]利用自然群體分析果重和粒重的QTLs，鑒定出5個(gè)與果重和粒重性狀關(guān)聯(lián)的區(qū)間。但是，關(guān)于可可果殼重、果長(zhǎng)、果徑圍、果殼厚等性狀與SSR標(biāo)記關(guān)聯(lián)分析少見報(bào)道。

為明確中國(guó)可可資源遺傳差異，本研究分析了70份可可核心種質(zhì)遺傳多樣性，明確其遺傳背景，為種質(zhì)準(zhǔn)確鑒定及資源創(chuàng)新提供可靠分子依據(jù)；通過挖掘與果實(shí)性狀顯著關(guān)聯(lián)的SSR標(biāo)記，從而為可可等位基因發(fā)掘以及分子標(biāo)記輔助選擇育種提供一些有意義的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料來自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所農(nóng)業(yè)部熱帶香料飲料作物種質(zhì)資源圃的70份可可資源，其中印尼18份（INA-）、厄瓜多爾7份（ECU-）、馬來西亞7份（MAS-）、泰國(guó)6份（THA-）、越南5份（VN-）、委內(nèi)瑞拉5份（WEN-）、科特迪瓦4份（CIV-）、巴新3份（PNG-）、科摩羅2份（COM-），名稱中有“SBRI-”的13份種質(zhì)為20世紀(jì)60～80年代香飲所在引進(jìn)基礎(chǔ)上創(chuàng)制的資源，詳見表1。2013年2～4月期間，考察70份可可資源材料的果重/g、果殼重/g、果長(zhǎng)/cm、果徑圍/cm、果殼厚/cm表型值。采集供試材料的嫩葉后，在實(shí)驗(yàn)室用液氮速凍研磨，保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.2 方法

1.2.1 總DNA提取 取出各研磨粉碎的可可葉片樣品，利用基因組DNA提取試劑盒（購(gòu)自O(shè)mega公司，D3471-01）抽提總DNA。1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提DNA質(zhì)量，UV-2310II型紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度，稀釋為20 ng/μL，備用。

1.2.2 SSR引物開發(fā)及遺傳多樣性分析 利用可可產(chǎn)量與品質(zhì)相關(guān)QTLs信息[16-17]，分析可可全基因組（http：//www.cacaogenomedb.org/），在90條系列中獲得65個(gè)微衛(wèi)星。采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)特異引物，再挑選均勻分布于可可10條連鎖群上的SSR引物53對(duì)，由上海生工生物工程公司合成。選用果重、果色、粒重等表型差異較大、不同來源的4份可可（VN-o1、SBRI-e7、PNG-tn13、WEN-ev1），使用Agilent SureCycler 8800 PCR儀進(jìn)行SSR反應(yīng)，反應(yīng)體系為20 μL，包含50 ng模板DNA，10 μmol/L的左右引物各0.5 μL，2 μL Buffer（10×），1.6 μL Mg2+（25 mmol/L），0.2 μL Taq（MBI Fermentas），補(bǔ)ddH2O至20 μL。PCR程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 45 s，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，10個(gè)循環(huán)，退火溫度每個(gè)循環(huán)下降1 ℃；94 ℃ 45 s，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保溫。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用8%的聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）檢測(cè)，電泳在君意東方JY-JX5型電泳儀上進(jìn)行，時(shí)間為90 min，電壓設(shè)定為150 V，電泳后銀染顯影。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用人工方法統(tǒng)計(jì)引物多態(tài)性，相同遷移位置，清晰度好的擴(kuò)增條帶賦值“1”，無條帶或肉眼不易分辨的弱帶賦值“0”。利用PopGen32軟件計(jì)算Nei's基因多樣性和Shannon信息指數(shù)；用NTSYS-pc2.1軟件，按SAHN鄰接法（neighbor-joining method，NJ）對(duì)供試資源進(jìn)行無權(quán)重配對(duì)算術(shù)平均數(shù)法（Unweighted pair group method using arithmetic averages，UPGMA）遺傳相似性聚類，并繪制樹狀聚類圖。

運(yùn)用Structure 2.3.2軟件進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析，群體數(shù)目K值的取值范圍為2～12，每個(gè)K值重復(fù)運(yùn)行10次，參照Evanno等[18]的方法，依據(jù)LnP（D）計(jì)算ΔK最小且逐漸趨于穩(wěn)定時(shí)的K值，為原始群體的亞群數(shù)，并計(jì)算所有材料相應(yīng)的Q值（第i材料其基因組變異源于第k群體的概率）。采用Tassel 2.1軟件基于一般線性模型（General linear model，GLM）的關(guān)聯(lián)分析，將各性狀的表型數(shù)據(jù)對(duì)標(biāo)記逐一進(jìn)行回歸分析，并計(jì)算各標(biāo)記對(duì)表型變異的解釋率。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物擴(kuò)增篩選及多態(tài)性

118對(duì)SSR引物中，有51對(duì)引物能擴(kuò)增出清晰、易于辨識(shí)的條帶，其中15對(duì)具有穩(wěn)定的多態(tài)性（圖1）；15對(duì)SSR引物在70份資源中共擴(kuò)增出76個(gè)條帶，平均每對(duì)引物5.07個(gè)；得到50個(gè)多態(tài)性條帶，占總帶數(shù)的65.8%，不同引物對(duì)揭示的等位基因?yàn)?～7個(gè)，平均每對(duì)引物3.33個(gè)（表2）。70份資源的Nei's基因多樣性指數(shù)平均為0.328，Shannon信息指數(shù)平均為0.496?？梢?，上述可可資源遺傳多態(tài)性豐富，也表明其遺傳背景的復(fù)雜性與基因的多樣性。

2.2 聚類分析

根據(jù)擴(kuò)增條帶的數(shù)據(jù)矩陣，分析參試材料間遺傳相似系數(shù)，結(jié)果表明，70份可可資源間遺傳相似系數(shù)（SM）介于0.341～0.943之間，平均值為0.625，從分子水平說明參試資源間存在豐富的遺傳差異。其中SBRI-s19與VEN-e12之間的遺傳相似系數(shù)最低（0.341），親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；THA-t16與MAS-tr17之間的遺傳相似系數(shù)最高（0.943），2份種質(zhì)分別來自泰國(guó)和馬來西亞，不僅來源地相近，分子水平上的親緣關(guān)系也非常緊密。

綜合SSR引物擴(kuò)增的50個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，得到70份可可資源的聚類分析樹狀圖。從圖2可見，在遺傳相似系數(shù)為0.65水平上可將70份可可資源分成10類。其中SBRI-sv18（B）、VEN-tn5（C）、ECU-sv8（E）分別單獨(dú)聚成一類，A、F、G類有2份資源。D類和H類均有17份資源，I類有12份資源，J類有15份資源，各自類群的種質(zhì)來源地不一，表明可可擴(kuò)散傳播區(qū)域比較廣泛。D、H、I、J類群資源的果重表型分別為552.51、603.84、584.87、628.75 g，類群間存在一定的差異性。在實(shí)踐中，可以有目的地選用不同類群間的種質(zhì)材料配制雜交組合，一方面可以創(chuàng)制新種質(zhì)，擴(kuò)大和豐富可可的遺傳背景，另一方面篩選表型優(yōu)異的株系，培育可可新品種。

2.3 果實(shí)性狀與SSR標(biāo)記關(guān)聯(lián)分析

Structure 2.3.2軟件分析表明，LnP（D）值隨假定亞群數(shù)K值的增大而呈現(xiàn)增大趨勢(shì)，由圖3可知，在K等于5時(shí)，LnP（D）值和ΔK均出現(xiàn)拐點(diǎn)，因此推測(cè)該群體材料可被分為5個(gè)亞群。

將K=5時(shí)，70份材料對(duì)應(yīng)的Q值作為協(xié)變量，基于GLM模型將SSR分子標(biāo)記變異與果重、果殼重、果長(zhǎng)、果徑圍、果殼厚等表型進(jìn)行回歸分析，尋找關(guān)聯(lián)的標(biāo)記，確定表型變異解釋率。共檢測(cè)到18位點(diǎn)與果重、果殼重、果長(zhǎng)、果徑圍、果殼厚在p<0.05水平上相關(guān)。其中有1個(gè)位點(diǎn)與果長(zhǎng)形狀的相關(guān)性呈極顯著（p<0.01）；其余17個(gè)位點(diǎn)中，1個(gè)與果重相關(guān)，3個(gè)與果殼重相關(guān)，4個(gè)與果長(zhǎng)相關(guān)，6個(gè)與果徑圍相關(guān)，3個(gè)與果殼厚相關(guān)。各位點(diǎn)對(duì)表型貢獻(xiàn)率為5.5%～13.1%；對(duì)表型貢獻(xiàn)率最大的是mTcCIR391-3（13.1%），它與果長(zhǎng)極顯著相關(guān)。值得一提的是，mTcCIR554-1標(biāo)記位點(diǎn)同時(shí)與果殼重、果長(zhǎng)、果徑圍相關(guān)，mTcCIR61-1標(biāo)記位點(diǎn)同時(shí)與果重、果殼重、果徑圍、果殼厚相關(guān)（表3）。

3 討論與結(jié)論

DNA分子標(biāo)記技術(shù)，可以從根本上揭示不同種質(zhì)間的遺傳差異，極大方便了種質(zhì)資源親緣關(guān)系研究，有助于提高育種效率。近年來，國(guó)外研究人員利用RFLP[19]、SSR[20-21]、SNP[22]等分子標(biāo)記分析了原產(chǎn)地和主產(chǎn)國(guó)可可種質(zhì)的遺傳多樣性，其中利用SSR標(biāo)記開展的研究較多。SSR標(biāo)記能揭示多態(tài)性高且比較穩(wěn)定，本研究利用SSR標(biāo)記分析了中國(guó)收集保存可可種質(zhì)遺傳多樣性，資源間Nei's基因多樣性指數(shù)平均為0.328，遺傳變異明顯，接近可可原產(chǎn)地的水平[23]。結(jié)果表明，中國(guó)收集保存的可可資源在分子水平上表現(xiàn)出高度的遺傳差異性，與其在果實(shí)和種子性狀表現(xiàn)出豐富的多樣性一致。

可可花結(jié)構(gòu)極為特殊，雄蕊被花瓣囊所包裹，主要依靠蚊蠓、蒼蠅、螞蟻等為其傳粉[24-25]?？煽僧惢ㄊ诜鄹捉Y(jié)實(shí)[26]，有性生殖后代遺傳背景高度雜合，因此種質(zhì)間表現(xiàn)出高水平的遺傳多樣性。70份參試資源在遺傳相似系數(shù)為0.65水平上，聚成10類，受限于參試資源的數(shù)量，類群間所包含的資源份數(shù)有較大差異。資源份數(shù)較多的I、J、D、H類群內(nèi)，其果重和單粒重表型也表現(xiàn)出廣泛的多樣性，也說明可可資源遺傳豐富。先前的研究結(jié)果表明，果重與種子產(chǎn)量呈顯著的正相關(guān)，但與果實(shí)經(jīng)濟(jì)系數(shù)呈極顯著負(fù)相關(guān)；果徑圍、果長(zhǎng)均與種子產(chǎn)量呈極顯著的正相關(guān)[27]。結(jié)合種質(zhì)的遺傳多樣性和性狀表型，在育種實(shí)踐中可以挑選MAS-tr7、MAS-tr18、CIV-f20、SBRI-fv17、ECU-sv8、PNG-tn13等資源作為親本，配制雜交組合，在雜交后代中篩選攜帶雙親優(yōu)良表型的單株，培育新品種。

關(guān)聯(lián)分析以自然群體為材料，省去構(gòu)建作圖群體所需的巨大工作量和時(shí)間，目前己發(fā)展成解析作物復(fù)雜數(shù)量性狀，繼而發(fā)掘優(yōu)異基因/QTL的有效方法之一。本研究利用15個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)5個(gè)果實(shí)相關(guān)性狀進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，共找到18個(gè)與果重、果殼重、果長(zhǎng)、果徑圍、果殼厚相關(guān)的SSR位點(diǎn)，分別位于3、4、6、8、10號(hào)染色體。本研究定位的與果重性狀相關(guān)的位點(diǎn)mTcCIR61-1位于第10染色體，Marcano等[15]在第10連鎖群上72 cM處定位出一個(gè)與果重性狀相關(guān)的位點(diǎn)，表型解釋率為10.8%，兩者位置相近。由于中國(guó)可可種質(zhì)均由國(guó)外引進(jìn)，來源廣泛，引進(jìn)資源多通過種子擴(kuò)繁，完全了解可可的系譜關(guān)系存在相當(dāng)大的困難，所以本研究對(duì)所選資源進(jìn)行種群結(jié)構(gòu)分析時(shí)只能依據(jù)遺傳差異進(jìn)行分類，各類群種質(zhì)的地域來源或者地理生態(tài)型不如Motamayor等[7]研究的清晰。以后，可將中國(guó)保存的可可資源的分子標(biāo)記多態(tài)性或基因組序列，與國(guó)際上譜系來源清晰的資源進(jìn)行比對(duì)，以明晰中國(guó)可可種質(zhì)傳播路徑與遺傳背景；進(jìn)而可對(duì)自然群體材料進(jìn)行全基因組SNP位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)分析，檢測(cè)優(yōu)良變異的等位基因，輔助分子設(shè)計(jì)育種。

參考文獻(xiàn)

[1] Iwaro A D， Bekele F L， Butler D R. Evaluation and utilisation of cacao（Theobroma cacao L.）germplasm at the International Cocoa Genebank， Trinidad[J]. Euphytica， 2003， 130（2）： 207-221.

[2] 國(guó)際可可組織[DB]. http： //www.icco.org/.2014/2015年鑒.

[3] 朱自慧. 世界可可業(yè)概況與發(fā)展海南可可業(yè)的建議[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2003， 23（3）： 28-33.

[4] 趙溪竹， 朱自慧， 王 華， 等. 世界可可生產(chǎn)貿(mào)易現(xiàn)狀[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2012， 32（9）： 76-81.

[5] Pound F J. Cacao and witches' broom disease of South America， with notes on the other species of Theobroma[M]// Report on a visit to Ecuador， the Amazon Valley and Colombia， April 1937-April 1938. Port-of-Spain， Trinidad and Tobago， 1938： 58.

[6] 秦曉威， 郝朝運(yùn)， 吳 剛， 等. 可可種質(zhì)資源多樣性與創(chuàng)新利用研究進(jìn)展[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2014， 35（1）： 188-194.

[7] Motamayor J C， Lachenaud P， da Silva e Mota J W， et al. Geographic and genetic population differentiation of the Amazonian chocolate tree（Theobroma cacao L.）[J]. PLoS One， 2008， 3（10）： e3 311.

[8] Utro F， Cornejo O E， Livingstone D， et al. ARG-based genome-wide analysis of cacao cultivars[J]. BMC Bioinformatics， 2012， 13（Suppl 19）： S17.

[9] Hansen M， Kraft T， Gaaaestam S， et al. Linkage disequilibrium mapping of the bolting gene in sea beet using AFLP markers[J]. Genet Res， 2001， 77（1）： 61-66.

[10] Maccaferri M， Saaguineti M C， Enrico N， et al. Population structure and long-range linkage disequilibrium in a durum wheat elite collection[J]. Mol Breeding， 2005， 15（3）： 271-290.

[11] Gebhardt C， Ballvora A， Walkemeier B， et al. Assessing genetic potential in germplasm collections of crop plants by marker-trait association： a case study for potatoes with quantitative variation of resistance to late blight and maturity type[J]. Mol Breeding， 2004， 13（1）： 93-102.

[12] Simko I， Costanzo S， Haynes K G， et al. Linkage disequilibrium mapping of a Verticillium dahliae resistance quantitative trait locus in tetraploid potato（Solanum tuberosum）through a candidate gene approach[J]. Theor Appl Genet， 2004， 108（2）： 217-224.

[13] 何 靜， 王文泉， 鄭永清， 等. 木薯栽培品種農(nóng)藝性狀與分子標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2010， 31（5）： 693-700.

[14] Schnell R J， Olano C T， Brown J S， et al. Retrospective determination of the parental population of superior cacao （Theobroma cacao L）seedlings and association of microsatellite alleles with productivity[J]. J Amer Soc Hort Sci， 2005， 130（2）： 181-190.

[15] Marcano M， Pugh T， Cros E， et al. Adding value to cocoa （Theobroma cacao L.）germplasm information with domestication history and admixture mapping[J]. Theor Appl Genet， 2007， 114（5）： 877-884.

[16] Clement D， Risterucci A M， Motamayor J C， et al. Mapping quantitative trait loci for bean traits and ovule number in Theobroma cacao L.[J]. Genome， 2003， 46（1）： 103-111.

[17] Araújo I S， de Souza Filho G A， Pereira M G， et al. Mapping of quantitative trait loci for butter content and hardness in cocoa beans（Theobroma cacao L.）[J]. Plant Mol Biol Rep， 2009， 27（2）： 177-183.

[18] Evanno G， Regnant S， Goudet J. Detecting the number of clusters of individuals using the software STRUCTURE： a simulation study[J]. Mol Ecol， 2005， 14（8）： 2 611-2 620.

[19] N'Goran J A K， Laurent V， Risterucci A M， et al. The genetic structure of cocoa populations（Theobroma cacao L.）revealed by RFLP analysis[J]. Euphytica， 2000， 115（2）： 83-90.

[20] Saunders J A， Mischke S， Leamy E A， et al. Selection of international molecular standards for DNA fingerprinting of Theobroma cacao[J]. Theor Appl Genet， 2004， 110（1）： 41-47.

[21] Efombagn I B M， Motamayor J C， Sounigo O， et al. Genetic diversity and structure of farm and GenBank accessions of cacao（Theobroma cacao L.）in Cameroon revealed by microsatellite markers[J]. Tree Genet Genomes， 2008， 4（4）： 821-831.

[22] Ji K， Zhang D P， Motilal L， et al. Genetic diversity and parentage in farmer varieties of cacao（Theobroma cacao L.）from Honduras and Nicaragua as revealed by single nucleotide polymorphism（SNP）markers[J]. Genet Resour Crop Ev， 2013， 60（2）： 441-453.

[23] Sereno M L， Albuquerque P S B， Vencovsky R， et al. Genetic diversity and natural population structure of cacao（Theobroma cacao L.）from the Brazilian Amazon evaluated by microsatellite markers[J]. Conserv Genet， 2006， 7（1）： 13-24.

[24] Silva C R， Albuquerque P S， Ervedosa F R， et al. Understanding the genetic diversity， spatial genetic structure and mating system at the hierarchical levels of fruits and individuals of a continuous Theobroma cacao population from the Brazilian Amazon[J]. Heredity， 2011， 106（6）： 973-985.

[25] Thomas E， van Zonneveld M， Loo J， et al. Present spatial diversity patterns of Theobroma cacao L. in the neotropics reflect genetic differentiation in pleistocene refugia followed by Human-influenced dispersal[J]. PLoS One， 2012， 7（10）： e47 676.

[26] Chumacero de Schawe C， Durka W， Tscharntke T， et al. Gene flow and genetic diversity in cultivated and wild cacao（Theobroma cacao）in Bolivia[J]. Am J Bot， 2013， 100（11）： 2 271-2 279.

[27] 李付鵬， 王 華， 伍寶朵， 等. 可可果實(shí)主要農(nóng)藝性狀相關(guān)性及產(chǎn)量因素的通徑分析[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2014， 35（3）： 448-453.