黃玉新 羅霆 劉昔輝 周珊 楊翠芳 高軼靜 楊翠鳳 段維興 周會(huì) 張革民 李楊瑞

摘 要 本研究的目的是明確甘蔗與斑割（斑茅割手密）復(fù)合體雜交后代F1材料的染色體核型構(gòu)成和遺傳行為，為有效利用甘蔗野生種質(zhì)提供細(xì)胞遺傳學(xué)的理論依據(jù)。采用甘蔗根尖細(xì)胞酶解去壁低滲法分別對(duì)3個(gè)不同甘蔗品種（系）與斑割復(fù)合體GXAS07-6-1的雜交后代進(jìn)行染色體數(shù)目鑒定和核型分析。結(jié)果表明：各親本和后代材料染色體數(shù)目在不同細(xì)胞中不恒定，染色體變幅為6～11條?；浱?3-159與GXAS07-6-1的F1材料GXASF108-1-1染色體核型公式為 2n=94=91 m+3 sm；桂糖01-53與GXAS07-6-1的F1材料GXASF108-2-28 染色體核型公式為2n=98=88 m+10 sm（1SAT）；桂糖02-761與GXAS07-6-1的F1材料GXASF108-3-7 染色體核型公式為2n=92=87 m+5 sm；3個(gè)F1材料的核型均為2B型。推斷甘蔗與斑割復(fù)合體雜交親子間的染色體基本按 “n+n”方式傳遞，同時(shí)可能存在部分染色體加倍現(xiàn)象，它們的雜種F1核型均為較原始的染色體2B類型。

關(guān)鍵詞 甘蔗；斑茅割手密復(fù)合體；核型分析；染色體傳遞

中圖分類號(hào) S566.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Genetic Analysis of Chromosomes for the Progeny Between

Sugarcane （Saccharum spp.）and Intergeneric Hybrid

Complex（Erianthus arundinaceus ×Saccharum spontaneum）

HUANG Yuxin1，2， LUO Ting2，3， LIU Xihui2，3， ZHOU Shan2，3， YANG Cuifang2，3，

GAO Yijing2，3， YANG Cuifeng1，2， DUAN Weixing2，3，

ZHOU Hui2，3， ZHANG Gemin2，3*， LI Yangrui2，3*

1 Agricultural College，Guangxi University，Nanning，Guangxi 530005，China

2 Guangxi Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement，Nanning，Guangxi 530007，China

3 Sugarcane Research Institute，Guangxi Academy of Agricultural Sciences/Key

Laboratory of Sugarcane Biotechnology and Genetic Improvement（Guangxi），

Ministry of Agriculture，Nanning ，Guangxi 530007，China

Abstract To incorporate genes from wild germplasm for laying a good cytogenetical foundation of sugarcane， karyotype composition and genetic behavior of chromosome were explored for the F1 progeny between sugarcane （Saccharum spp.）and intergeneric hybrid（Erianthus arundinaceus×Saccharum spontaneum）. Chromosome number calculation and karyotype analysis were carried out for the progeny between 3 clones（Saccharum spp.）and GXAS07-6-1（Erianthus arundinaceus×Saccharum spontaneum）by the means of cell wall degradation hypotonic smear method. The somatic chromosome numbers of all accessions were non-constant and the amplitude was 6-11. The somatic chromosome karyotypic types of F1 progeny for 3 crosses were 2n=94=91 m+3 sm， 2n=98=88 m+10 sm（1SAT），and 2n=92=87 m+5 sm，respectively. The “n+n”transmission and 2B karyotype of F1 progeny from sugarcane and intergeneric hybrid were indicated. The chromosomes of sugarcane and intergeneric hybrid complex（Erianthus arundinaceus×Saccharum spontaneum）were transmitted in the mode “n+n”but doubling possibly existed. The karyotypes of these three F1 progenies belong to the primitive 2B type.

Key words Sugarcane；Intergeneric hybrid complex；Karyotype analysis；Chromosome transmission

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.02.002

現(xiàn)代甘蔗品種由于原始親本有限，長(zhǎng)期的雜交或定向選擇，致使育成品種難以獲得突破[1-2]。通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交導(dǎo)入野生種質(zhì)血緣或優(yōu)異新基因是甘蔗突破性育種的重要途徑。利用斑茅和割手密雜交（Erianthus arundinaceus×Saccharum spontaneum）獲得的野生雜種F1材料斑茅割手密復(fù)合體GXAS07-6-1兼具雙親的優(yōu)點(diǎn)，其抗逆性、生勢(shì)等具有明顯的超親優(yōu)勢(shì)[3]，再利用斑割復(fù)合體GXAS07-6-1與甘蔗進(jìn)行雜交或回交，改變育種者幾十年來(lái)對(duì)斑茅和割手密野生種質(zhì)“單元化”雜交利用的策略，有可能同時(shí)聚合斑茅和割手密的優(yōu)異野生基因，以改良現(xiàn)有甘蔗品種，提高品種的綜合性狀水平。

甘蔗是高度雜合的異源多倍體或非整倍體植物，同一品種體細(xì)胞的染色體數(shù)目在不同個(gè)體及同一個(gè)體不同細(xì)胞之間有所差異[4]；同時(shí)，由于甘蔗的染色體組成及傳遞方式較為復(fù)雜和獨(dú)特，在甘蔗遠(yuǎn)緣雜交過(guò)程中，雙親的染色體在后代材料中的傳遞方式存在“不平衡現(xiàn)象”[5]。鄧祖湖等[6]對(duì)斑茅、Badila 及甘蔗與斑茅的雜交后代進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)與核型分析，結(jié)果表明，海南斑茅92-105和92-77核型屬于原始的1A型，參試的甘蔗無(wú)性系的核型均屬2B型，甘蔗斑茅雜交的染色體遺傳以“n+n”的方式進(jìn)行。王先宏等[7]利用GISH技術(shù)對(duì)16份甘蔗與蔗茅屬間的雜交后代F1染色體進(jìn)行研究，并對(duì)其中3份材料的中期染色體進(jìn)行核型分析，結(jié)果表明子代材料中具有7～10條不等的父本染色體，甘蔗×蔗茅雜種后代F1的染色體組成為“n+n”及“2n+n”，3份F1材料核型類型分別為2C、2C和2B。

本課題組于2006年通過(guò)利用廣西斑茅87-36（2n=60）和廣西割手密79-9（2n=64）雜交獲得斑割復(fù)合體GXAS07-6-1（2n=62）以來(lái)，對(duì)GXAS07-6-1與甘蔗雜交利用過(guò)程中的分子遺傳學(xué)和細(xì)胞遺傳學(xué)相關(guān)基礎(chǔ)進(jìn)行了研究，并獲得一批聚合斑茅和割手密雙親優(yōu)良性狀（基因）的雜種后代F1[8-10]。為了有效地利用斑割復(fù)合體改良甘蔗品種，需要了解斑茅割手密染色體在雜交利用過(guò)程中的傳遞動(dòng)態(tài)和遺傳規(guī)律。本研究對(duì)3個(gè)甘蔗品種（系）粵糖93-159、桂糖01-53、桂糖02-761及其與斑茅割手密復(fù)合體（GXAS07-6-1）的15個(gè)雜交后代F1材料進(jìn)行染色體數(shù)目鑒定，并對(duì)其中3個(gè)F1（GXAS F108-1-1、GXAS F108-2-28、GXAS F108-3-7）進(jìn)行核型分析，以期探討斑割復(fù)合體在雜交利用過(guò)程中的染色體傳遞動(dòng)態(tài)和遺傳規(guī)律，為甘蔗野生資源斑茅與割手密的復(fù)合雜交利用提供細(xì)胞遺傳學(xué)的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以斑茅割手密復(fù)合體GXAS07-6-1為父本，分別與3個(gè)不含斑茅及廣西割手密血緣的常用甘蔗親本粵糖93-159（廣州甘蔗糖業(yè)研究所選育，含熱帶種、爪哇割手密、印度割手密血緣）、桂糖01-53（廣西甘蔗研究所選育的品系，含熱帶種、爪哇割手密、印度割手密血緣）、桂糖02-761（廣西甘蔗研究所選育，含熱帶種、爪哇割手密、印度割手密、云南割手密及大莖野生種血緣）進(jìn)行雜交，雜種的真?zhèn)谓?jīng)SRAP和SSR分子標(biāo)記鑒定[9]，從中選取真雜種F1（GXASF1）15份（表1）進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)和核型分析。

1.2 方法

染色體觀察與計(jì)數(shù)及核型分析。染色體制片參考黃東益等[11]、劉昔輝[8]等的方法，略有修改。將帶雙芽的莖段在28 ℃條件下恒溫培養(yǎng)，待其根長(zhǎng)到2 cm，取幼嫩、健壯的根尖，置于0.002 mol/L 8-羥基喹啉溶液中預(yù)處理3～5 h （室溫），后轉(zhuǎn)入固定液（甲醇 ∶ 冰乙酸=3 ∶ 1）于4 ℃冰箱固定12 h 以上，低滲30～60 min，用70%的酒精于4 ℃保存?zhèn)溆茫粚⒏庵糜?%纖維素酶和1%果膠酶的混合液中酶解6～9 h（酶解時(shí)間視根尖的粗細(xì)老嫩而定），用改良苯酚卡寶品紅溶液染色10～15 min，于空氣中干燥，在尼康正立熒光顯微鏡80i下觀察，每個(gè)材料取30個(gè)分散好的完整細(xì)胞，以眾數(shù)進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Image-Pro Plus 5.51（Media Cybernetics， Inc.）軟件測(cè)量染色體長(zhǎng)度，Microsoft Excel 2010 軟件分析作圖，繪制核型模式圖。染色體核型參數(shù)分析參考李懋學(xué)等[12]的標(biāo)準(zhǔn)。甘蔗為異源多倍體，染色體不進(jìn)行同源配對(duì)。染色體核型排列按從大到小、短臂向上、長(zhǎng)臂向下、著絲點(diǎn)在一條線上進(jìn)行排列。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘蔗及甘蔗×斑割復(fù)合體后代F1材料的染色體數(shù)目和傳遞方式推斷

從表2看，各親本及其后代材料的體細(xì)胞染色體數(shù)目在不同細(xì)胞中均不恒定?；浱?3-159染色體2n=112（眾數(shù)，下同），染色體變化范圍為102～112，變幅為11條，眾數(shù)所占比例為44.4% ；桂糖01-53染色體2n=104，染色體變化范圍為98～106，變幅為9條，眾數(shù)所占比例為42.9%；桂糖02-761染色體2n=110，染色體變化范圍為102～110，變幅為9條，眾數(shù)所占比例為39.1%?；浱?3-159×GXAS07-6-1后代GXASF108-1-1、GXASF108-1-2、GXASF108-1-4、GXASF108-1-8、GXASF108-1-9染色體數(shù)目為92～94，同一材料不同細(xì)胞染色體變幅為8～11條，眾數(shù)所占比例為40.0%～48.5%；桂糖01-53×GXAS07-6-1后代中GXASF108-2-24、GXASF108-2-28、GXASF108-2-43、GXASF108-2-62、GXASF108-2-67染色體數(shù)目為90～98，同一材料不同細(xì)胞染色體變幅為7～9條，眾數(shù)所占比例為40.6%～50.0%；桂糖02-761×GXAS07-6-1后代中GXASF108-3-6、GXASF108-3-7、GXASF108-3-8、GXASF108-3-12、GXASF108-3-13染色體數(shù)目為90～94，同一材料不同細(xì)胞染色體變幅為6～9條，眾數(shù)所占比例為37.5%～50.0%。15份甘蔗與斑割復(fù)合體的后代F1染色體眾數(shù)都為90～98條，平均為93，子代的體細(xì)胞染色體數(shù)目大于雙親各自單倍的配子體染色體數(shù)目之和（87、83、86），由此推測(cè)甘蔗斑割染色體基本按“n+n”方式傳遞。

2.2 3份甘蔗與斑割復(fù)合體的后代F1材料核型分析結(jié)果

2.2.1 GXASF108-1-1的核型分析結(jié)果 GXASF108-1-1的核型參數(shù)見(jiàn)表3，其體細(xì)胞染色體數(shù)為2n=94，染色體相對(duì)長(zhǎng)度0.73～1.63，臂比為1.01～2.15，平均臂比為1.27，最長(zhǎng)染色體/最短染色體為2.67，核型分類為2B，核型不對(duì)稱系數(shù)為55.5。94條染色體中有91條為中部著絲粒染色體，3條為近中部著絲粒染色體，核型公式為2n=94=91 m+3 sm。染色體形態(tài)和核型模式見(jiàn)圖1、2。

2.2.2 GXASF108-2-28的核型分析結(jié)果 GXASF108-2-28的核型參數(shù)見(jiàn)表3，其體細(xì)胞染色體數(shù)為2n=98，染色體相對(duì)長(zhǎng)度為0.51～1.68，臂比為1.01～2.13，平均臂比為1.33，最長(zhǎng)染色體/最短染色體為3.14，核型分類為2B，核型不對(duì)稱系數(shù)為56.2。98 條染色體中有88條為中部著絲粒染色體，10條為近中部著絲粒染色體，90號(hào)染色體有一條隨體（圖3箭頭所示），核型公式為2n=98=88 m+10 sm（1SAT）。染色體核型模式見(jiàn)圖4。

2.2.3 GXASF108-3-7的核型分析結(jié)果 GXASF108-3-7的核型參數(shù)見(jiàn)表3，其體細(xì)胞染色體數(shù)為2n=92，染色體相對(duì)長(zhǎng)度為0.63～1.79，臂比為1.01～2.30，平均臂比為1.26，最長(zhǎng)染色體/最短染色體為3.14，核型分類為2B，核型不對(duì)稱系數(shù)為55.1。92 條染色體中有87條為中部著絲粒染色體，5條為近中部著絲粒染色體，核型公式為2n=92=87 m+5 sm。染色體形態(tài)和核型模式見(jiàn)圖5、圖6。

3 討論與結(jié)論

現(xiàn)代甘蔗品種由于親本遺傳基礎(chǔ)狹窄，長(zhǎng)期雜交或是定向選擇，育成品種異質(zhì)性低。通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交引進(jìn)野生種質(zhì)優(yōu)異基因、擴(kuò)寬甘蔗基因庫(kù)血緣成為育種家的共識(shí)。由于熱帶種和斑茅遠(yuǎn)緣雜交獲得的F1大多無(wú)花粉或花粉量少且不育，其回交后代蔗糖分改良相對(duì)較慢，而且伴有側(cè)芽多、氣根多、難脫葉、蒲心大、57號(hào)毛群發(fā)達(dá)等缺點(diǎn)[13-14]，所以盡管通過(guò)甘蔗斑茅種質(zhì)的研究與利用已獲得BC4代材料，但至今尚未育成含斑茅血緣的甘蔗品種，即可供生產(chǎn)或育種應(yīng)用的品種[15]。通過(guò)以割手密為載體或橋梁親本，與斑茅雜交獲得生勢(shì)好、莖蒲心程度相對(duì)較輕、無(wú)57號(hào)毛群、莖徑大、莖汁錘度高，花粉育性高的聚合雙親優(yōu)點(diǎn)的斑茅割手密復(fù)合體材料，再利用該復(fù)合體與甘蔗雜交或回交，就有可能創(chuàng)造出新的突破性優(yōu)良種質(zhì)。

由于甘蔗遺傳背景復(fù)雜，染色體傳遞呈現(xiàn)多種形式，有“n+n”，“n+2n”，“2n+n”和“2n+2n”等方式，且甘蔗遠(yuǎn)緣雜交中，減數(shù)分裂過(guò)程染色體配對(duì)異常，出現(xiàn)單價(jià)體、三價(jià)體、落后染色體以及微核等現(xiàn)象。鄭成木[4]的研究認(rèn)為，甘蔗細(xì)胞染色體數(shù)目的變化很可能是由于祖親（不同物種）的細(xì)胞周期不同，因而在雜種中來(lái)自不同物種的染色體的行為不同步，導(dǎo)致細(xì)胞分裂過(guò)程中染色體分配不均衡。王先宏等[16]對(duì)甘蔗與蔗茅的雜交后代F2、BC1進(jìn)行染色體遺傳分析，其結(jié)果也顯示各材料的體細(xì)胞染色體數(shù)目均不恒定，變幅為3～7條；雙親染色體在F2子代以“2n+n”方式傳遞，而在F2BC1子代則以“n+n”方式傳遞。本研究中GXAS07-6-1雙親分別是不同屬的甘蔗野生種質(zhì)廣西斑茅GXA87-36（2n=60）和廣西割手密GXS79-9（2n=64），染色體按“n+n”方式傳遞[8]?；浱?3-159、桂糖01-53、桂糖02-761 3個(gè)母本的染色體數(shù)分別為112、104、110條。15份甘蔗與斑割復(fù)合體的雜交后代F1材料中，同一組合的不同后代染色體數(shù)目存在一定差異，染色體數(shù)目都為90～98條；F1代的體細(xì)胞染色體數(shù)目比雙親各自單倍的配子體染色體數(shù)目之和多，染色體按不嚴(yán)格的“n+n”方式傳遞，由此推斷，同時(shí)很可能存在部分染色體加倍現(xiàn)象。Bremer[17]的研究也表明，雜種中的染色體數(shù)目比預(yù)期的雙親各自單倍的配子體染色體數(shù)目之和要多。

染色體核型分析能夠了解分類關(guān)系、遺傳變異和物種的進(jìn)化起源。本研究對(duì)3份甘蔗與斑割復(fù)合體的F1后代GXASF108-1-1、GXASF18-2-28、GXASF18-3-7進(jìn)行核型分析，發(fā)現(xiàn)其染色體由大多數(shù)中部著絲點(diǎn)和少數(shù)近中部著絲點(diǎn)組成，都屬于2B型。劉文榮等[18]、鄧祖湖等[6]、黃永吉等[19]對(duì)甘蔗與斑茅雜交后代的核型分析結(jié)果表明，其F1材料的核型主要屬于2B型。Stebbins[20]認(rèn)為，高等植物核型進(jìn)化的基本趨勢(shì)是由對(duì)稱向不對(duì)稱發(fā)展的，較原始的植物核型具對(duì)稱的中部著絲點(diǎn)染色體較多，而較進(jìn)化的植物核型具中部著絲點(diǎn)染色體較少，因此，3份甘蔗與斑割復(fù)合體的F1染色體較原始。由核型的不對(duì)稱系數(shù)來(lái)看，GXASF108-1-1的核型不對(duì)稱系數(shù)為55.5，GXASF108-2-28的核型不對(duì)稱系數(shù)為56.2，GXASF108-3-7的核型不對(duì)稱系數(shù)為55.1。3個(gè)材料的核型不對(duì)稱系數(shù)相差不大，但GXASF108-2-28較GXASF108-1-1，GXASF108-3-7不對(duì)稱，這可能與其母本的進(jìn)化程度相關(guān)。

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