涂紅艷 張愛玲 肖望 陳丹 曾海敏

摘 要 以白姜花根尖為材料，通過預(yù)處理、固定、解離和染色等步驟，對(duì)染色體制片技術(shù)進(jìn)行改良，得到了一種簡(jiǎn)單高效的可用于植物染色體數(shù)目分析的制片技術(shù)，主要步驟包括“取材-酸解離-低滲-染色-壓片”。采用改良技術(shù)得到的制片細(xì)胞膨大、染色體分散、形態(tài)清晰、分色良好。用該方法對(duì)白姜花、金姜花、所羅門姜黃和紅艷郁金等的體細(xì)胞染色體數(shù)目進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果分別如下：白姜花2n=34，金姜花2n=34，所羅門姜黃2n=63，紅艷郁金2n=49。

關(guān)鍵詞 白姜花；染色體制片；染色體數(shù)目

中圖分類號(hào) Q949.718.33 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Plant chromosome analysis technology is the most common and useful method in cytogenetics research. In the present study，three methods for plant chromosome preparation of Hedychium coronarium were compared including material pretreatment，fixation，dissociation and dyeing on the root tips. The results showed that the best experimental protocol for chromosome number analysis was ‘sample selection，acid dissociation，hypotonic，staining with improve phenol fuchsin，chromosome slide preparation，and the best dissociation way was with 37% HCl ∶ 95% C2H5OH=1 ∶ 3 at 28-30 ℃ for 6 min. Clear metaphase chromosome images with large cells，spreading and clear chromosome were obtained with the improved method. Subsequently，this method was applied to analyze the somatic chromosome numbers of H. coronarium，H. gardnerianum，Curcuma soloensis，Curcuma rubescens at metaphase，which were 2n=34，2n=34，2n=63，2n=49 respectively.

Key words Hedychium coronarium；Chromosome preparation；Chromosome number

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.05.026

姜科（Zingiberaceae）植物是熱帶、亞熱帶的特有植物，全世界約有50屬1 500種[1]，其中中國約19屬143種，主要分布在西南部至東部，姜科植物具較好的藥用、香料、調(diào)味、觀賞等價(jià)值，且資源豐富[2]。

植物染色體制片技術(shù)是植物細(xì)胞遺傳學(xué)、染色體工程、植物細(xì)胞生物學(xué)、植物細(xì)胞分類學(xué)等學(xué)科的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。植物染色體的數(shù)目、組型分析對(duì)于研究植物的分類、起源和演化都有重要的意義[3]。目前對(duì)國產(chǎn)姜科植物的染色體研究已開展了很多[1，4-5]，但仍有很多種類尚未有染色體資料或者結(jié)論多樣。以白姜花（Hedychium coronarium）為例，不同學(xué)者對(duì)其染色體數(shù)目進(jìn)行分析得出不同的結(jié)果，分別為34[4，6-8]、51[9]、54[10]。結(jié)果的不同可能與取材和實(shí)驗(yàn)方法有關(guān)。目前國內(nèi)外常用的染色體制片技術(shù)為2種，分別是壓片技術(shù)和去壁低滲干燥技術(shù)。壓片技術(shù)操作快速簡(jiǎn)單，但制片得到的染色體多交聯(lián)重疊，如胡秀等[7]以根尖為材料，利用壓片技術(shù)對(duì)白姜花染色體數(shù)目進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)即使制片圖像良好，也總是有幾條染色體相互貼近，難于對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確的計(jì)數(shù)。采用去壁低滲干燥技術(shù)制片，染色體分散性好，但操作繁瑣、技術(shù)要求高，如陳瑞陽[8-9]以白姜花根尖為材料，結(jié)果得到分散性好的染色體圖譜。

本研究分別以姜科植物白姜花（Hedychium coronarium）、金姜花（Hedychium gardnerianum）、 所羅門姜黃（Curcuma soloensis）和紅艷郁金（Curcuma rubescens）根尖為材料，將去壁低滲干燥技術(shù)中的后低滲程序結(jié)合到壓片技術(shù)中，同時(shí)結(jié)合優(yōu)化的解離方法，旨在建立一種適合于姜科植物染色體數(shù)目分析的改良制片技術(shù)，為姜科植物的遺傳育種提供細(xì)胞學(xué)研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料白姜花購自廣州芳村嶺南花卉市場(chǎng)，將其根狀莖埋于沙土中進(jìn)行催根；所羅門姜黃、金姜花和紅艷郁金采自廣州市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，將其種植于本課題組試驗(yàn)田，取根狀莖埋于沙土中進(jìn)行催根。

1.2 方法

1.2.1 取材 上午9∶00～10∶30，分別取白姜花、金姜花、所羅門姜黃、紅艷郁金的白嫩根尖泡于冰水混合物中，帶回實(shí)驗(yàn)室，洗干凈后用于制片。

1.2.2 常規(guī)制片技術(shù) 具體步驟及方法見表1[11]。

1.2.3 去壁低滲干燥技術(shù) 具體步驟及方法見表2[8]。

1.2.4 改良的制片技術(shù) 將去壁低滲干燥技術(shù)的后低滲程序加入到壓片技術(shù)中，具體方法見表3。

1.2.5 不同解離液對(duì)制片的影響 配制不同成分的解離液，研究解離液的組成和解離溫度對(duì)制片的影響，解離液的組成見表4。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法所得白姜花染色體制片比較

利用常規(guī)的壓片技術(shù)進(jìn)行制片，解離后材料較硬，細(xì)胞很難分散開，無法把細(xì)胞壓到同一個(gè)平面，因此也無法制得能觀察到染色體的清晰圖像（圖1-A）。采用去壁低滲干燥技術(shù)時(shí)，經(jīng)酶解去壁、低滲干燥后能制得分散性好的染色體裝片，且染色效果好，制得的圖片染色體圖像清晰（圖1-B），但該技術(shù)操作程序復(fù)雜，技術(shù)難度大，耗時(shí)長(zhǎng)，耗材昂貴。利用改良制片技術(shù)簡(jiǎn)單快速、耗材少，但實(shí)驗(yàn)效果與去壁低滲干燥技術(shù)相當(dāng)，細(xì)胞較為膨大，染色體分散性好，且形態(tài)清晰、分色良好，細(xì)胞能輕易被壓到同一平面（圖1-C）。

2.2 不同解離方法對(duì)白姜花細(xì)胞大小和染色體分散程度的影響

對(duì)不同解離方法得到的白姜花細(xì)胞大小和染色散開區(qū)域大小的數(shù)據(jù)分別進(jìn)行差異性分析。結(jié)果顯示（表5），采用方法B、C、D，即解離液中37%HCl與95%乙醇的比值為1 ∶ 1、1 ∶ 2與1 ∶ 3時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒有顯著差異；但采用方法E、F，即解離液中37%HCl與95%乙醇比值為1 ∶ 4、1 ∶ 5時(shí)，與采用方法D（比值為1 ∶ 3的解離液）的實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在顯著差異。解離液中37%HCl與95%乙醇的比值為1 ∶ 3時(shí)，解離效果最好，制片質(zhì)量最高。對(duì)比常規(guī)方法A（即解離液組成為1 mol/L HCl，于60 ℃解離6 min），方法D[即解離液中37% HCl與95% 乙醇比值為1 ∶ 3，于常溫（28～30 ℃）下解離6 min]所得的細(xì)胞體積擴(kuò)大到原來的1.5倍，染色體分散區(qū)域擴(kuò)大了1.6倍（表5），這表明解離液的組成以及解離方法會(huì)直接影響到制片的效果。

不同的解離方法所得到的實(shí)驗(yàn)效果存在明顯的差異。6種解離方法中，白姜花染色體制片的最適解離方法為D，即37% HCl與95%乙醇比值為1 ∶ 3，制片得到的細(xì)胞較大，染色體染色深、分散性好，容易被壓在同一平面，且結(jié)構(gòu)完整、著絲點(diǎn)清晰可見（表5，圖2-D）。白姜花的染色體數(shù)為2n=34，這與之前幾位學(xué)者的研究結(jié)果相符[4，6-8]。

在濃度較高的HCl下解離，細(xì)胞壁被分解軟化，低滲后細(xì)胞膨脹較明顯（圖2-B、C、D），染色體分散。但HCl濃度太高，易導(dǎo)致染色體斷裂成小片段（圖2-B），無法準(zhǔn)確判斷染色體的數(shù)目。而采用低濃度HCl時(shí)，無法使細(xì)胞壁軟化，染色體很難被壓到同一平面（圖2-A），染色體多重疊交聯(lián)、分散性差（圖2-E、F）。

2.3 改良制片技術(shù)獲得的幾種姜科植物染色體數(shù)目

分別利用改良制片技術(shù)對(duì)金姜花、所羅門姜黃和紅艷郁金的染色體數(shù)目進(jìn)行研究，均獲得了分散度高、染色清晰的圖像，如圖3所示。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析可知，金姜花的染色體數(shù)目為2n=34（圖3-A），所羅門姜黃的染色體數(shù)為2n=63（圖3-B），這與Skornickova等[12]的報(bào)道一致；紅艷郁金的染色體數(shù)目為2n=49條（圖3-C）。

3 討論與結(jié)論

染色體壓片技術(shù)是以人工外加的機(jī)械壓力而使染色體分散[11]，去壁低滲干燥技術(shù)是以酶分解細(xì)胞壁，再用低滲液使細(xì)胞吸脹，經(jīng)火焰干燥時(shí)借用水的表面張力使染色體分散開[8]。本研究在常規(guī)壓片技術(shù)的基礎(chǔ)上加入了去壁低滲干燥技術(shù)中的低滲程序，目的是使細(xì)胞吸水膨脹，染色體分散到細(xì)胞質(zhì)中，制片時(shí)便于使染色體分散開。在解離過程中，HCl起到分解細(xì)胞壁的果膠物質(zhì)和部分細(xì)胞質(zhì)的作用，從而使細(xì)胞易于分散，同時(shí)，HCl也可以使細(xì)胞壁適度軟化便于壓片。用HCl解離除了成本低外，解離后還能使細(xì)胞保留部分細(xì)胞壁成分，確保細(xì)胞不會(huì)因低滲過度而脹破并影響染色體的分辨。但是HCl對(duì)細(xì)胞壁的軟化程度直接影響到低滲的效果，濃度過高時(shí)容易導(dǎo)致染色體嚴(yán)重受損甚至完全分解；濃度過低又使細(xì)胞難以分散，導(dǎo)致低滲沒有任何效果。本研究采用添加乙醇的方法對(duì)HCl解離的最適濃度進(jìn)行了梯度設(shè)計(jì)和分析，得到了最適合用于酸解的HCl與乙醇的比例。

在改良制片技術(shù)中采用了改良苯酚品紅染液，其具有染色快、著色深、適應(yīng)性廣的特點(diǎn)，適合于多數(shù)植物根尖、幼芽、花藥以及細(xì)胞愈傷組織染色[13]。同時(shí)，由于其本身也是固定液，因此省去了固定材料的程序。經(jīng)固定的材料，細(xì)胞更松軟，更便于壓片。

采用去壁低滲干燥法制片需要通過預(yù)處理獲得較多的中期分裂相，以促進(jìn)染色體的收縮，使染色體變得短而粗。之前姜科植物染色體制片中多采用預(yù)處理這一步驟，如陳瑞陽[8]用秋水仙素預(yù)處理白姜花根尖3.5 h，Skornickova等[12]用二氯苯飽和溶液預(yù)處理姜黃根尖3 h，李維秀等[5]用8-羥基喹啉預(yù)處理10種姜科植物根尖4 h。上述預(yù)處理所耗時(shí)間較長(zhǎng)，且預(yù)處理藥物濃度使用不當(dāng)會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，如秋水仙素會(huì)引起多倍體的產(chǎn)生，8-羥基喹啉會(huì)引起染色體排列紊亂。本研究采用的改良制片技術(shù)，去除了預(yù)處理這一步驟，直接取材、酸解離、低滲、染色和壓片，方法簡(jiǎn)便快速，并減少了對(duì)細(xì)胞的毒害作用，但實(shí)驗(yàn)效果與去壁低滲干燥技術(shù)相當(dāng)，且細(xì)胞膨大、染色體分散性好、形態(tài)清晰、分色良好。

根尖染色體計(jì)數(shù)是鑒定植株染色體數(shù)最常用最可靠的方法之一。胡秀等[7]利用小孢子母細(xì)胞為材料對(duì)白姜花進(jìn)行染色體分析，從實(shí)驗(yàn)材料方面對(duì)白姜花的染色體數(shù)目研究方法進(jìn)行了改良。但植物的染色體數(shù)一般以體細(xì)胞染色體數(shù)目為準(zhǔn)，處于減數(shù)分裂期的細(xì)胞， 由于價(jià)體分析難以保證準(zhǔn)確，所以，除苔鮮和蕨類等因材料所限而用減數(shù)分裂細(xì)胞計(jì)數(shù)染色體外，針對(duì)其他植物，則一般只宜將其作為輔助計(jì)數(shù)材料[14]，利用根尖進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)仍然是最理想的方法。

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