曾仙珍 王祥軍 李維國

摘 要 對巴西橡膠樹熱研7-33-97半年生組培苗的木質(zhì)部不同發(fā)育時期的木質(zhì)素、纖維素和半纖維素含量進行測定分析，用Van Soes方法計算得到木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的含量。結(jié)果表明，木質(zhì)素、纖維素和半纖維素在生長發(fā)育過程中的含量隨著生長發(fā)育逐漸增加。其中木質(zhì)素與纖維素的含量隨著生長發(fā)育趨于穩(wěn)定狀態(tài)，而半纖維素的含量從GX期開始迅速增加，直到SX期也沒有出現(xiàn)趨向穩(wěn)定的趨勢；木質(zhì)素/纖維素的比值在發(fā)育過程中變化不大，木質(zhì)素/半纖維素的比值及纖維素/半纖維素的比值在GX期均達最大。木質(zhì)素與纖維素的相關(guān)性顯著，積累是同步的。

關(guān)鍵詞 巴西橡膠樹；木質(zhì)素；纖維素；半纖維素；生長發(fā)育

中圖分類號 S794.1 文獻標識碼 A

Abstract In this paper， the content of lignin， cellulose and hemicellulose of xylem at different stages of Reyan 7-33-97 rubber tree seedlings wood， and the content of them were calculated by Van Soes method. The results showed that the content of lignin， cellulose and hemicellulose in the process of growth gradually increased. In addition， the content of lignin and cellulose tended to a stable state with the growing development， and the content of hemicellulose from GX period began to increase rapidly， until the SX period did not incline to stable trend. Cellulose/lignin ratio during the development process changed a little， lignin/cellulose ratios and ratio of cellulose/hemicellulose ratios in the GX were the largest. Correlation of lignin and cellulose showed that the accumulation of lignin and cellulose were synchronous.

Key words Hevea brasiliensis； Lignin； Cellulose； Hemicellulose； Growth and development

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.05.010

巴西橡膠樹原產(chǎn)地在巴西亞馬遜河流域馬拉岳西部地區(qū)，屬多年生高大落葉喬木，大戟科三葉橡膠屬，是天然橡膠的主要來源[1]。由于常規(guī)橡膠樹的種植方法需要8年才可以割膠，國內(nèi)外許多學者著手研究橡膠樹育種，在各方面取得了一定的進展，從20世紀50年代開始，研究橡膠樹的組織培養(yǎng)技術(shù)[2]，到90年代打開了橡膠樹的基因大門[3-4]。

近年來有許多關(guān)于植物木質(zhì)素、纖維素及半纖維素的研究，纖維素、半纖維素和木質(zhì)素都是細胞壁的組成成分[5]，隨著積累使細胞壁厚度和木質(zhì)化程度增加，增強細胞的支撐作用，提高抗風性。這些組分在發(fā)育中的組成、相互作用及如何應(yīng)激外界因素的影響，日漸被研究學者們重視[6]。目前，國內(nèi)外還沒有關(guān)于橡膠樹的幼苗樹莖在生長發(fā)育過程中的木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的報道。木材中的木質(zhì)纖維素的合成與積累并不是隨意發(fā)生的，與調(diào)控的基因和蛋白酶等有關(guān)，具有時間性和空間性[7-8]。對橡膠樹生長過程中木質(zhì)素、纖維素及半纖維素的含量變化進行研究，有助于明確橡膠樹的木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的形成機制及其規(guī)律，為研究橡膠樹的木質(zhì)素、纖維素、半纖維素合成的有關(guān)基因與蛋白質(zhì)提供一定的基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗選用的材料為種植于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院九隊苗圃的巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）半年生熱研7-33-97組培苗。統(tǒng)一選擇頂蓬葉子在古銅時期的材料，取4個時期樹皮分別為淡綠色（LGX）、綠色（GX）、半木栓化（SSX）、木栓化（SX）的木質(zhì)部部分（圖1）。

1.2 方法

1.2.1 NDF（中性洗滌纖維）含量的測定 參照Van Soest[9]和Goering[10]的方法，并稍作修改。稱取樣品1.0 g（記為m）和0.5 g無水亞硫酸鈉于圓底燒瓶中，加100 mL中性洗滌劑和2 mL十氫化萘輕搖混勻后至連接冷凝裝置，置于電爐上加熱，大火沸10 min后轉(zhuǎn)小火微沸1 h后冷卻10 min，將瓶內(nèi)的全部殘渣沖洗到砂芯漏斗中，抽濾，抽濾干凈后用丙酮沖洗3遍，放在105 ℃烘箱中烘至恒重，記為m2。

1.2.2 ADF（酸性洗滌纖維）的測定 參照文獻[9-10]的方法，并稍作修改。稱取樣品1.0 g（記為m′）于圓底燒瓶中，加100 mL酸性洗滌劑和2 mL十氫化萘混勻后，置于電爐上大火煮沸10 min轉(zhuǎn)小火微沸1 h，冷卻10 min，將殘渣抽濾干凈，用丙酮沖洗殘渣，105 ℃烘箱烘至恒重記為m2′。

1.2.3 木質(zhì)素含量的測定 參照文獻[9-10]的方法，并稍作修改。在1.2.2中烘干的漏斗中加入1.0 g酸洗石棉，加入72%的硫酸溶液用玻璃棒將樣品和石棉攪成糊狀，待硫酸流出時，每隔1 h加硫酸溶液并攪動，3 h后過濾，用超純水洗滌殘渣至濾液的pH值為中性，放到105 ℃烘箱中烘至恒重記為m3。再放在500 ℃電爐灼燒2 h后轉(zhuǎn)入105 ℃烘箱中烘干至恒重，記為m4。稱取1 g石棉，放入已知質(zhì)量的漏斗中加硫酸溶液，同實驗組一樣做法，最后記錄石棉的失重記為m5，作為空白對照，m5<0.002 g。

1.3 數(shù)據(jù)處理

半纖維素的質(zhì)量分數(shù)：

ω（半纖維素）=ω（NDF）-ω（ADF）

酸性木質(zhì)素ADL的質(zhì)量分數(shù)計算：

纖維素的質(zhì)量分數(shù)計算：

ω（纖維素）=ω（ADF）-ω（72%硫酸處理后的殘渣）

采用SPSS軟件對所得的數(shù)據(jù)進行方差分析ANOVA和多重比較分析LSD Duncan；p<0.05為差異顯著，p<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 幼莖木材不同生育期的木質(zhì)素、纖維素和半纖維素含量

橡膠樹在生長的各個階段中，木材中的化學成分的組成不同，在本研究中，測定了半年生的橡膠樹組培苗幼莖木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的含量，不同發(fā)育階段的木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的積累都隨著生長發(fā)育逐漸增加（圖2）。

木質(zhì)素含量在LGX時最低，隨著植株的生長發(fā)育而逐漸增加，在SX期時最高。木質(zhì)素含量在整個生長過程中增加不大，從LGX期到GX期快速增加，GX期之后直到SX期，含量的增長趨勢逐漸減弱，趨于穩(wěn)定。用SPSS統(tǒng)計軟件對各時期木質(zhì)素的含量進行ANOVA分析（表1），顯示GX期與SSX期和SX期的木質(zhì)素含量差異不顯著，LGX期的木質(zhì)素含量與其他3個時期的木質(zhì)素含量均達到了極顯著差異

纖維素的含量從LGX期到SSX期快速增長，從SSX期到SX期纖維素的含量變化不大，增長緩慢。這4個生長發(fā)育的過程中，SSX期與SX期的纖維素沒有顯著性差異，在其他各組之間比較結(jié)果顯示均達到了顯著的差異。

半纖維素的含量從LGX到GX期半纖維素含量增加較為緩慢，從GX期開始，半纖維素迅速增加，直到SX期。LGX期與GX期之間半纖維素沒有顯著性差異，其他幾個時期之間都達到顯著性差異，且在LGX與SSX期和SX期之間均達到了極顯著。

木質(zhì)素與纖維素的含量隨著生長發(fā)育積累增長然后到SSX期后開始趨于穩(wěn)定，而半纖維素含量的增加到SSX時期和SX時期，并沒有趨向穩(wěn)定，還有增長的趨勢，半纖維素的大量積累是從GX時期開始。對于木質(zhì)素與纖維素的積累，SSX時期是一個轉(zhuǎn)折點，對于半纖維素，GX時期是一個轉(zhuǎn)折點，其合成迅速增加。

2.2 幼莖木材不同生育期木材中木質(zhì)素、纖維素、半纖維素含量的比值

橡膠樹在生長過程中，木材中的化學成分組成各有不同，在各時期，木質(zhì)素、纖維素、半纖維素之間比值的變化，結(jié)果如圖3顯示，在生長發(fā)育的各個階段中，比值會有所變化。

在幼苗的不同發(fā)育階段中，木質(zhì)素/纖維素的比值在發(fā)育過程中變化不大，說明在橡膠樹幼苗內(nèi)，木質(zhì)素和纖維素的增長速率相同。木質(zhì)素/半纖維素的比值及纖維素/半纖維素的比值變化趨勢相同，從LGX期到GX期都是在增大，在GX期最大，然后隨著生長發(fā)育逐漸減小，而且，結(jié)果顯示在SSX和SX期的比值均比LGX期的比值小，由此可見，隨著生長發(fā)育木質(zhì)化程度的增高，木質(zhì)素及纖維素的增長速率逐漸減小，且比半纖維素的增長速率低。

2.3 幼莖木材木質(zhì)素、纖維素、半纖維素合成及與發(fā)育階段間的相關(guān)性分析

對橡膠樹木質(zhì)素、纖維素和半纖維素與發(fā)育階段間的相關(guān)性分析見表2，可見，均有顯著相關(guān)性，Pearson值越大，相關(guān)性越高，二者的關(guān)系越密切。分析的結(jié)果中顯示，相關(guān)系數(shù)都超過0.7，說明木質(zhì)素、纖維素、半纖維素與發(fā)育階段之間存在相關(guān)性，而且木質(zhì)素與纖維素的相關(guān)系數(shù)達到0.968，在這4個因素中相關(guān)性最高，說明木質(zhì)素與纖維素的關(guān)系最密切，植株在生長發(fā)育過程中木質(zhì)素與纖維素的積累是同步的。

3 討論與結(jié)論

纖維素、半纖維素和木質(zhì)素是細胞壁的組成成分[11-12]，隨著合成[13-15]、積累使細胞壁厚度和木質(zhì)化程度增加，增強細胞的支撐作用，提高樹木的抗風性。前人對非洲、美洲和南美洲的81種熱帶植物的幼苗與大樹的木材化學成分的研究發(fā)現(xiàn)幼苗中的木質(zhì)素含量均高于大樹的木質(zhì)素含量[16-19]。在本次研究的幼齡橡膠樹組培苗中，木質(zhì)素與纖維素的含量隨著生長發(fā)育逐漸增加，增長的速率卻在減小。在巴西橡膠樹幼苗中，纖維素和木質(zhì)素的大量合成是在LGX到GX期，增長的速率是最大的，所以在這個階段纖維素和木質(zhì)素的合成最多。研究學者們從擬南芥、水稻和楊樹中研究了纖維素合酶及纖維素合酶基因[20-21]。對于木質(zhì)素合成酶的研究，現(xiàn)已有報道測出了擬南芥、煙草、楊樹、火炬松等植物的木質(zhì)素合成酶的DNA序列[22-26]。表達序列標簽分析和微陣列分析也被用于木質(zhì)部的發(fā)育研究，相繼得到了很好的結(jié)果[27-28]，對木材的發(fā)育機制的研究提供了平臺。劉彤等[29]根據(jù)與擬南芥木質(zhì)素合成基因高度同源的AtMYB20的克隆得到了調(diào)控橡膠樹木質(zhì)素合成的基因HbMYB20。幼苗木質(zhì)部中半纖維素的含量在LGX到GX期增加的速率不大。在GX期有較高的木質(zhì)素與纖維素比值和纖維素與半纖維素的比值，在這一時期木質(zhì)素的合成量最大，其次是纖維素，半纖維素的大量合成是在SSX和SX期。植物細胞中，纖維素與半纖維素由氫鍵相連形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，雖然木質(zhì)素與纖維素的相關(guān)性最高，但是纖維素與半纖維素的含量在后期較為接近，隨著生長發(fā)育，或許會更加接近。

橡膠樹半年生幼苗不同育期細胞壁中的木質(zhì)素、纖維素及半纖維素的含量逐漸增加。幼齡木材的化學特征與大樹木材化學特征并不相同，幼齡木材發(fā)育過程中的化學成分的變化會體現(xiàn)在大樹中[30]，研究橡膠樹幼莖的木材化學成分對研究橡膠樹的木材特征具有重要意義。GX和SSX時期是一個轉(zhuǎn)折點，可進一步對GX和SSX期相關(guān)蛋白質(zhì)及代謝物的研究，探索橡膠樹在生長發(fā)育過程中，與木質(zhì)素、纖維素和半纖維素合成有關(guān)的蛋白質(zhì)及基因，為后續(xù)橡膠樹生長發(fā)育機制的研究提供研究方向。

參考文獻

[1] 邱海燕. 巴西橡膠樹REF、 RT和SRPP基因物理定位的研究[D]. ?？冢?海南大學， 2010.

[2] 譚德冠， 黃華孫， 莊南生， 等. 巴西橡膠樹倍性育種研究進展[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學， 2004（1）： 58-64.

[3] 田 郎. 生物技術(shù)在巴西橡膠樹遺傳改良中的應(yīng)用綜述[J]. 陜西林業(yè)科技， 2010（6）： 105-118.

[4] 何 鑫. 巴西橡膠樹JAZ和MYC家族幾個成員基因表達和產(chǎn)量相關(guān)性的研究[D]. ?？冢?海南大學， 2013.

[5] 宋東亮， 沈君輝， 李來庚， 等. 高等植物細胞壁中纖維素的合成[J]. 植物生理學報， 2008， 44（4）： 791-796.

[6] Josè-Estanyol M， Puigdomènech P. Plant cell wall glycoproteins and their genes[J]. Plant Physiology and Biochemistry， 2000， 38（1）： 97-108.

[7] 呂春娟. 喬木根系抗拉力學特性及其與化學成分關(guān)系[D]. 北京： 北京林業(yè)大學， 2013.

[8] 張 莉. 木質(zhì)纖維素組分分離工藝的研究[D]. 長春： 長春工業(yè)大學， 2014.

[9] Van Soest P J. Use of detergents in the analysis of fibrous feeds. II. A rapid method for the determination of fiber and lignin[J]. J Assoc of Anal Chem， 1963， 46： 829-835.

[10] Goering H K， Van Soest P J. Forage fiber analyses（apparatus， reagents， prcedures， and some applications）[J]. USDA Agr Handb， 1970.

[11] 宋東亮， 沈君輝， 李來庚. 高等植物細胞壁中纖維素的合成[J]. 植物生理學通訊， 2008， 44（4）： 791-796

[12] Josè-Estanyol M， Puigdomènech P. Plant cell wall glycoproteins and their genes[J]. Plant Physiology and Biochemistry， 2000， 38（1）： 97-108.

[13] Doblin M S， Kurek I， Jacob-Wilk D， et al. Cellulose biosynthesis in plants： from genes to rosettes[J]. Plant Cell Physiol， 2002， 43： l 407-1 420.

[14] Joshi C P， Bhandari S， Ranjan P， et al. Genomics of cellulose biosynthesis in poplars[J]. New Phytol， 2004， 164： 53-6l.

[15] Saxena I M， Brown Jr R M. Cellulose biosynthesis： current views and evolving concepts[J]. Ann Bot， 2005， 96： 9-2l.

[16] Nuopponen M H， Wikberg H I， Birch G M， et al. Characterization of 25 tropical hardwoods with Fourier transform infrared， ultraviolet resonance Raman， and 13C‐NMR cross‐polarization/magic‐angle spinning spectroscopy[J]. Journal of Applied Polymer Science， 2006， 102（1）： 810-819.

[17] Santana M A E， Okino E Y A. Chemical composition of 36 Brazilian Amazon forest wood species[J]. Holzforschung， 2007， 61（5）： 469-477.

[18] Rana R， Langenfeld-Heyser R， Finkeldey R， et al. FTIR spectroscopy， chemical and histochemical characterisation of wood and lignin of five tropical timber wood species of the family of Dipterocarpaceae[J]. Wood Science and Technology， 2010， 44（2）： 225-242.

[19] Van Geffen K G， Poorter L， Sass-Klaassen U， et al. The trait contribution to wood decomposition rates of 15 Neotropical tree species[J]. Ecology， 2010， 91（12）： 3 686-3 697.

[20] Richmond T. Higher plant cellulose synthases[J]. Genome Biol， 2000（4）： 3001.1-3001.6.

[21] Tanaka K， Murata K， Yamazaki M， et al. Three distinct rice cellulose synthase catalytic subunit genes required for cellulose synthesis in the secondary wal1[J]. Plant Physiol， 2003， 133（1）： 73-83.

[22] Suzuki S， Li L， Sun Y H， et al. The cellulose synthasegene superfamily and biochemical functions of xylem-spe-cific cellulose synthase-like genes in Populus trichocarpa[J]. Plant Physio1， 2006， 142： 1 233-1 245.

[23] Bell-Lelong D A， Cusumano J C， Meyer K， et al. Cinnamate-4-hydroxylase expression in Arabidopsis Regulation in response to development and the environment[J]. Plant Physiology， 1997， 133（3）： 729-738.

[24] Sewall V J H， Ni W， Blount J W， et al. Reduced lignin contene and altered lignin composistion in transgenic tobacco down-regulated in expression of 1-phenylalanine ammonia-lyase or cinnamate 4-hydroxylase[J]. Plant Physiol， 1997， 115： 41-50.

[25] Barakat A， Bagniewska A， Choi A， et al. The cinnamyl alcohol dehydrogenase gene family in Populus： phylogeny， organization， and expression[J]. BMC Plant Biology， 2009， 9（26）： 1-15.

[26] MacKay J J， Liu W， Whetten R， et al. Genetic analysis of cinnamy alcohol dehydrogenase in loblolly pine： single gene in heritance， molecular characterization and evolution[J]. Molecular and General Genetics MGG， 1995， 247（5）： 573-545.

[27] Mellerowicz E J， Baucher M， Sundberg B， et al. Unravelling cell wall formation in the woody dicot stem[M]//Plant Cell Walls. Springer Netherlands， 2001： 239-274.

[28] Hertzberg M， Aspeborg H， Schrader J， et al. A transcriptional roadmap to wood formation[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2001， 98（25）： 14 732-14 737.

[29] 劉 彤， 楊文鳳， ?，F(xiàn)周， 等. 橡膠樹HbMYB20基因的克隆及其對擬南芥次生壁發(fā)育的調(diào)控[J]. 林業(yè)科學， 2015， 51（4）： 52-59.

[30] Martin A R， Thomas S C， Zhao Y. Size-dependent changes in wood chemical traits： a comparison of neotropical saplings and large trees[J]. AoB Plants， 2013， 5（8）： plt039.