黎娟華　孫海彥　趙平娟　彭明

摘 要 以南方根結(jié)線蟲延長因子2基因（Mi-eft2）T克隆質(zhì)粒為模板，克隆該基因的3個(gè)部分片段（各200 bp），作為體外合成dsRNA的模版，利用該 dsRNA（F1ds，F(xiàn)2ds，F(xiàn)3ds）干擾南方根結(jié)線蟲2齡幼蟲（J2）的Mi-eft2表達(dá)。結(jié)果顯示，利用real-time PCR作為檢測方法，干擾處理后的J2線蟲Mi-eft2的表達(dá)量（F1、F2、F3），與對照處理的J2線蟲Mi-eft2的表達(dá)量（F0）相比，分別降低了21%、69%、0.02%。將經(jīng)過干擾處理的J2線蟲和作為對照處理的J2線蟲（500頭/株）分別接種5株番茄，培養(yǎng)45 d后觀察表型。發(fā)現(xiàn)干擾處理后J2線蟲與對照處理的J2線蟲接種番茄后產(chǎn)生的根結(jié)數(shù)相比較，分別減少了57.09%、68.94%、7.01%。說明Mi-eft2表達(dá)的沉默效應(yīng)會(huì)使南方根結(jié)線蟲對番茄造成的危害程度相應(yīng)降低，也說明了利用RNAi干擾該基因表達(dá)的方法有利于對南方根結(jié)線蟲病害防治方法的探索。

關(guān)鍵詞 南方根結(jié)線蟲；Mi-eft2；RNA干擾；雙鏈RNA

中圖分類號 S432.45 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract Three partial fragments（each 200 bp）of the elongation factor 2 gene（Mi-eft2）were PCR cloned by using the south root knot nematode（Meloidogyne incognita）Mi-eft2 T-cloning plasmid as the template. And the fragments were used as the templates for the in vitro synthesis of double strain RNA（dsRNA）. That three dsRNA（F1ds，F(xiàn)2ds，F(xiàn)3ds）were used to interfere the expression of Mi-eft2 of the M. incognita J2 nematodes. The J2 nematodes without interference treatment were used as the control treatment. As results， by using real-time PCR as the detection method， compared with the expression data of Mi-eft2 of the control treatment， the Mi-eft2 expression data of the J2 nematodes after interference-treatment（F1， F2， F3）were silenced in varying degrees， which reducing within 21%， 69%， 0.02%， respectively. The J2 nematodes after interference treatment and the J2 nematodes of the control treatment were inoculated 5 tomatoes respectively（500 nematodes/plant）， and then the plants were cultivated 45 days before phenotype investigation. As results， compared with the quantity of root knot caused by the control treatment J2 nematodes， the quantity of root knot caused by the J2 nematodes after-interference treatment reduced within 57.09%， 68.94%， 7.01%， respectively. The results provided that in this research， the disease severity of tomato caused by M. incognita would decrease accordingly， along with the silence effect of the expression of Mi-eft2. It suggested that the method by using RNAi to interfere this gene's expression would be good for the strategy study of the south root knot nematode disease control.

Key words Meloidogyne incognita； Mi-eft2； RNA interference； Double strain RNA

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.06.022

植物寄生性線蟲對農(nóng)作物的危害嚴(yán)重，影響了農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。南方根結(jié)線蟲（Meloidogyne incognita）是重要的植物寄生線蟲之一，寄主廣泛，在世界上每年造成的損失達(dá)上千億美元[1-2]?；瘜W(xué)防治，包括土壤熏蒸法，是最常用的防治根結(jié)線蟲的方法。但是大部分殺線蟲的藥劑都是非特異和有毒的，對環(huán)境、地下水和人畜危害較大，所以，化學(xué)防治方法受到了限制。農(nóng)作物植物寄生線蟲的危害越來越嚴(yán)重[3]，因此，對新的防治根結(jié)線蟲病害方法的研究非常重要。RNA干擾（RNA interference，RNAi）這種反向遺傳學(xué)方法可以使模式線蟲秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans，C. elegans）的基因沉默[4-5]。同樣，將RNA干擾的方法應(yīng)用于沉默根結(jié)線蟲的基因，使線蟲的生長發(fā)育和繁殖受到干擾，從而實(shí)現(xiàn)對根結(jié)線蟲防治的相關(guān)研究[6-8]，也是防治根結(jié)線蟲的一種新方向。如何選擇根結(jié)線蟲靶基因進(jìn)行沉默是這種方法的關(guān)鍵。筆者在發(fā)掘可用于培育沉默根結(jié)線蟲的轉(zhuǎn)基因植物過程中，克隆到一個(gè)南方根結(jié)線蟲的延長因子2基因（elongation factor 2，Mi-eft2），該基因與C. elegans的延長因子2基因（Ce-EF2）有 86.9%的同源性；蛋白質(zhì)功能預(yù)測結(jié)果表示，該基因具有水解酶的活性，在蛋白質(zhì)延長過程中起作用，與真核生物中的延長因子2基因（EF2）的功能相似[9-11]。在利用RNAi敲除模式線蟲秀麗隱桿線蟲基因，鑒定其功能的過程中發(fā)現(xiàn)，對EF2的沉默會(huì)引起線蟲發(fā)育受阻、胚胎致死及產(chǎn)卵減少，證明EF2基因是線蟲生命周期必須的重要基因[4]，而且該基因在真菌、細(xì)菌、動(dòng)物、植物中都很保守[12]。因此，筆者利用RNAi干擾南方根結(jié)線蟲Mi-eft2基因的表達(dá)，通過接種寄主植物番茄來研究南方根結(jié)線蟲危害植物的能力變化，有利于人們理解南方根結(jié)線蟲的生命周期和致病性，對探索防治南方根結(jié)線蟲病害方法的研究有一定意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、質(zhì)粒與材料 靶基因Mi-eft2的T克隆載體質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保存。Escherichia coli Top10感受態(tài)細(xì)胞購自天根公司（Tiangen Biotech Beijing CO.， LTD）。南方根結(jié)線蟲采自海南?？冢⒂诖笈镏袉温褖K純化和培養(yǎng)，培養(yǎng)新鮮孵化2齡幼蟲用于實(shí)驗(yàn)。番茄品種為廣東蔬菜研究所生產(chǎn)寶石F1。

1.1.2 試劑及測序 膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒為天根公司產(chǎn)品，RNA提取試劑盒為invitrogen公司的RNA purification regagent， dsRNA合成試劑盒為promega公司的T7 RioMAXTM Express RNAi System（貨號：P1700），real-time PCR產(chǎn)品（產(chǎn)品貨號：DRR081A）購自TAKARA公司，PCR反應(yīng)體系Taq MasterMix 2X（貨號KT201-02）購自天根公司，cDNA第一鏈合成試劑盒FastQuant RT Kit（with gDNase）購自天根公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。序列測定由上海生物工程技術(shù)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA第一鏈合成 總RNA的提取：將南方根結(jié)線蟲2齡幼蟲或成熟雌線蟲于提取液中研磨，提取方法參照說明書（DP320-02， DP407-02）。cDNA第一鏈合成以南方根結(jié)線蟲的總RNA為模板，使用天根公司的 FastQuant RT Kit（with gDNase）進(jìn)行，方法參照說明書（KR106）。

1.2.2 dsRNA目標(biāo)模板合成 根據(jù)筆者已發(fā)表的靶基因Mi-eft2的序列[9]，分別從該基因5′（自開放閱讀框起第1～200 bp）、3′（自開放閱讀框起第2 131～2 331 bp）和中間部分（自開放閱讀框起第1 459～1 659 bp）選擇3個(gè)長度為200 bp合成目的dsRNA片段，這3個(gè)模板片段分別命名為 Fragment1，F(xiàn)ragment2，F(xiàn)ragment3，簡寫為 F1，F(xiàn)2，F(xiàn)3。并根據(jù)這些片段分別設(shè)計(jì)引物，引物退火溫度60 ℃左右。因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)所用合成 dsRNA 的試劑盒，合成一個(gè)dsRNA片段，需要在同一個(gè)片段的5′、3′端分別添加含T7啟動(dòng)子的序列，并以這2個(gè)片段為模板合成dsRNA（詳情見試劑盒使用方法）。因此根據(jù)這3個(gè)片段分別設(shè)計(jì)了含T7啟動(dòng)子序列（以下加下劃線的序列）的引物。引物F1：F1-F-F：5′-TAATACG

ACTCACTATAGGATGAAGGCTCGAATTCAA-3′F1-F-R： 5′-AAGGGTCCTAATCAACACCAACAA-3′；F1-R-F： 5′-ATGAAGGCTCGAATTCAA-3′/F1-R-R： 5′-TAATACGACTCACTATAGGAAGGGTCCTAA

TCAACAC-3′。F2引物：F2-F-F： 5′-TAATACGA

CTCACTATAGGATGGTGCAATGCATTTT-3′/ F2-F-R： 5′-AAGGGTCCTATGAAAGGCACAT-3′；F2-R-F： 5′-ATGGTGCAATGCATTTT-3′/ F2-R-R： 5′-TAATACGACTCACTATAGGAAGGGTCCTATGAAA

G-3′。F3引物：F3-F-F： 5′-TAATACGACTCACT

ATAGGGAATACAAGAGCCAGTC-3′/ F3-F-R： 5′-AGGGTCCTACAGTATTTGAACGCA-3′；F3-R-F： 5′-GAATACAAGAGCCAGTC-3′/ F3-R-R： 5′-TAA

TACGACTCACTATAGGAGGGTCCTACAGTATT-3′）。以Mi-eft2的T克隆載體質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增目標(biāo)片段。PCR反應(yīng)體系為Taq MasterMix 2× 25 μL（Taq MasterMix 2×包括：0.1 U Taq Polymerase/μL，500 μmol/L dNTP each，20 mmol/L Tris-HCl（pH8.3），100 mmol/L KCl，3 mmol/L MgCl2），正向引物（10 μmol/L）2 μL，反向引物（10 μmol/L）2 μL，模版0.2 μL（<1μg），dH2O（滅菌蒸餾水）補(bǔ)至50 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 變性20 s，退火20 s，72 ℃ 延伸20 s，退火溫度為 60 ℃，25個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳回收，連接于pMD18-T Simple載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10菌株的感受態(tài)細(xì)胞，然后送測序。

1.2.3 dsRNA合成 dsRNA的合成方法參照說明書（Part# TB316）。分別將添加T7啟動(dòng)子的5′，3′模板各500 ng加入合成體系，按照以下步驟進(jìn)行：①37 ℃條件下進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，30 min；②70 ℃，反應(yīng)10 min，再在室溫下冷卻20 min，目的為生成dsRNA；③加入DNase和稀釋了200倍的RNase，37 ℃，反應(yīng)30 min，目的為降解DNA模板和單鏈 RNA；④加入0.1體積3 mol/L的醋酸鈉（pH5.2），1體積的異丙醇，置冰上5 min，13 000 r/min離心收集沉淀；⑤加入0.5 mL冷凍的70%乙醇，13 000 r/min離心5 min，棄上清，自然風(fēng)干15 min，⑥加入原始反應(yīng)體積的2～5倍無核酸超純水溶解，原液稀釋100倍后，分光光度計(jì)OD260測濃度，-70 ℃保存待用。

1.2.4 南方根結(jié)線蟲Mi-eft2基因的RNA干擾和檢測 南方根結(jié)線蟲2齡幼蟲Mi-eft2基因的 RNA干擾方法參照Rosso等[13]Yohei等[14]。將2齡幼蟲浸泡在50 μL的含有1.0 μg/μL的dsRNA特定溶液中[14]（1.25 g/L NaCl，0.75 g/L NH2PO4，1.5 g/L Na2HPO4，3 mol/L spermidine，0.05% gelatine，1% resorcinol），對照處理將線蟲浸泡在不含dsRNA的特定溶液中。室溫條件下浸泡4 h。將對照和干擾處理后的線蟲分別取樣提取總RNA，然后合成第一鏈cDNA，以此為模板，根據(jù)線蟲Mi-eft2基因和內(nèi)參基因actin的序列分別設(shè)計(jì) PCR引物，PCR產(chǎn)物根據(jù)所用試劑盒產(chǎn)品說明設(shè)計(jì)為150 bp，目標(biāo)基因的PCR引物為：E2-F/E2-R（E2-F：5′-ATGGTGCAATGCATTTT-3′/ E2-R：5′-AAGGGTC

CTATGAAAGGCA-3′），內(nèi)參基因β-actin的序列（CF099470）引物為Act-F/Act-R（Act-F：5′-AGGC

TGGATTTGCGGGTGATGAT-3′/ Act-R：5′-AAGAG

GTATCTTGACTTTGAA-3′）。然后利用Real time PCR的方法檢測處理后目標(biāo)基因的表達(dá)變化情況，確定對南方根結(jié)線蟲目標(biāo)基因的 RNA干擾效果。Real time PCR反應(yīng)體系為：SYBRR Premix Ex TaqTM II（2×）12.5 μL，正向引物（10 μmol/L）1 μL，反向引物（10 μmol/L）1 μL，模板 2 μL，dH2O（滅菌蒸餾水）補(bǔ)至25 μL。所用儀器為Stratagene公司的Mx3005p。Real-time PCR程序?yàn)闄z測相對表達(dá)量的算法Comparative Quantitation（Calibrator），反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)熱30 s；95 ℃，5 s，60 ℃，20 s秒，40個(gè)循環(huán)，并采集信號；每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，PCR 3次重復(fù)。數(shù)據(jù)分析軟件為MxPro-3005p。

1.2.5 RNA干擾后線蟲和寄主植物的共培養(yǎng) 將發(fā)芽后14 d大的番茄苗移到直徑10 cm的塑料花盆，土壤和蛭石比例為3 ∶ 1；每盆單獨(dú)放置培養(yǎng)7 d，然后將對照（未經(jīng)處理的線蟲）和經(jīng)過 RNA干擾處理的線蟲經(jīng)鏡檢確定數(shù)量，500頭/株，放置在番茄根附近，共培養(yǎng)45 d。對照和3個(gè)dsRNA片段共4個(gè)處理，每個(gè)處理和5盆番茄共培養(yǎng)；觀察線蟲侵染番茄結(jié)果，統(tǒng)計(jì)根結(jié)數(shù)和卵塊數(shù)。番茄培養(yǎng)條件為室外自然條件。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本研究所涉及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析：real time PCR 檢測基因相對表達(dá)量的數(shù)據(jù)分析由MxPro-3005p 自動(dòng)產(chǎn)生；干擾處理的線蟲接種番茄后所產(chǎn)生的根結(jié)數(shù)與對照處理的線蟲接種番茄后所產(chǎn)生的根結(jié)數(shù)通過Microsoft Excel進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)差統(tǒng)計(jì)再對以上兩類數(shù)據(jù)分別用SPSS 19.0中的Dunnett's多重比較進(jìn)行單向方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 dsRNA目標(biāo)模板及dsRNA的合成

根據(jù)設(shè)計(jì)好的引物組合（F1-F-F/F1-F-R，F(xiàn)1-R-F/F1-R-R；F2-F-F/F-2F-R，F(xiàn)2-R-F/F1-R-R；F3-F-F/F3-F-R，F(xiàn)3-R-F/F3-R-R）擴(kuò)增目標(biāo)片段，產(chǎn)物分別記為：F1F，F(xiàn)1R；F2F，F(xiàn)2R；F3F，F(xiàn)3R。經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增片段大小為200 bp，與目標(biāo)片段序列一致。結(jié)果見圖1。

dsRNA目標(biāo)片段F1、F2、F3的合成模板分別為：F1F/F1R；F2F/F2R；F3F/F3R。將對應(yīng)的模板以500 ng的量加入反應(yīng)體系，dsRNA合成結(jié)果見圖2，分別標(biāo)記為 F1ds、F2ds、F3ds。目標(biāo)片段的大小是200 bp，因?yàn)閐sRNA的遷移速率比dsDNA慢，所以dsRNA產(chǎn)物的位置在 250 bp左右。所得產(chǎn)物經(jīng)OD260測濃度后用于RNA干擾溶液的配制。

2.2 南方根結(jié)線蟲Mi-eft2基因的RNA干擾及檢測

對南方根結(jié)線蟲RNA干擾處理和對照處理的線蟲進(jìn)行采樣，通過鏡檢發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過RNAi處理的線蟲活力和對照處理線蟲活力相當(dāng)。將采樣的線蟲提取總RNA，用于檢測目標(biāo)基因干擾效果實(shí)驗(yàn)；將對照處理的線蟲（名稱是F0）Mi-eft2基因表達(dá)量設(shè)為 Calibrator，數(shù)值是1，檢測其它3個(gè)片段干擾處理線蟲的相對表達(dá)量（名稱和數(shù)值分別為：F1：0.79、F2：0.31、F3：0.98，均為平均數(shù)），結(jié)果見圖3所示。從結(jié)果可以看出，F(xiàn)2的目標(biāo)基因表達(dá)量比對照目標(biāo)基因表達(dá)量減少了大約69%，F(xiàn)1的目標(biāo)基因表達(dá)量比對照的目標(biāo)基因表達(dá)量則減少了大約 21%，方差分析顯示 ：F2、F1的結(jié)果與對照 F0 的結(jié)果相比差異顯著，而F3的目標(biāo)基因表達(dá)量與對照相比變化不大。由此推測目標(biāo)片段F2的dsRNA對線蟲該基因的干擾效果最明顯，F(xiàn)1的dsRNA對線蟲該基因的干擾效果則次之，F(xiàn)3的dsRNA對線蟲該基因的干擾效果基本沒有發(fā)生變化。

2.3 RNAi處理后的線蟲對寄主植物接種結(jié)果

用 RNAi 處理過的線蟲接種番茄 45 d后，將番茄根上的泥用水沖凈，在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)所產(chǎn)生的根結(jié)數(shù)量，與對照處理（標(biāo)記為F0i）進(jìn)行比較。3個(gè)dsRNA處理過的線蟲接種番茄（分別標(biāo)記為：F1i、F2i、F3i）產(chǎn)生的根結(jié)數(shù)見圖4所示。對照F0i番茄根中平均產(chǎn)生了48.93個(gè)根結(jié)；F1i番茄在根中平均產(chǎn)生了21個(gè)根結(jié)，相比對照減少了57.09%；F2i番茄在根中則平均產(chǎn)生了15.2個(gè)根結(jié)，相比對照減少了68.94%；F3i 番茄在根中則產(chǎn)生了45.5個(gè)根結(jié)，相比對照減少了7.01%。從圖3和圖4可以看出，線蟲目的基因表達(dá)受到干擾程度和線蟲接種番茄后在根中產(chǎn)生根結(jié)的數(shù)量變化趨勢一致，說明對Mi-eft2表達(dá)的干擾，影響了南方根結(jié)線蟲在番茄根中產(chǎn)生根結(jié)的數(shù)量，干擾越大，影響就越大，產(chǎn)生的根結(jié)數(shù)量越少，對植物造成的危害也減少。

3 討論與結(jié)論

據(jù)報(bào)道，南方根結(jié)線蟲Mi-eft2基因的保守區(qū)域和真核生物延長因子2的保守區(qū)域同源性很高，說明該基因在線蟲里高度保守；同時(shí)預(yù)測 Mi-eft2推測蛋白MI-EFT2具有和真核生物延長因子2相似的功能[9]。因此對該基因的分離和鑒定有利于人們認(rèn)識南方根結(jié)線蟲的生長發(fā)育周期。隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展，根結(jié)線蟲病的為害逐年加重[15-16]，RNA干擾可以沉默根結(jié)線蟲的基因，使線蟲的生長發(fā)育和繁殖受到干擾，從而實(shí)現(xiàn)對根結(jié)線蟲的防治[6-8]，也是一種值得探索的新方向。

筆者通過沉默南方根結(jié)線蟲的Mi-eft2基因，接種寄主植物番茄后發(fā)現(xiàn)：Mi-eft2的表達(dá)受到干擾后，該線蟲在番茄根中形成的根結(jié)數(shù)，與對照處理的根結(jié)數(shù)相比較，降低了57.09%～68.94%。與對照相比，目的基因的沉默會(huì)引起線蟲對寄主造成危害程度的變化，而且基因沉默的效果越大，線蟲對寄主的危害就越低，如圖3，圖4所示。這說明南方根結(jié)線蟲對寄主的危害能力可能跟Mi-eft2基因相關(guān)。但是該基因的沉默影響線蟲的發(fā)育、繁殖，還是影響線蟲的寄生能力還有待進(jìn)一步的研究鑒定。

本研究中，同一個(gè)基因，選取序列不同的區(qū)域來合成 dsRNA 片段，對該基因產(chǎn)生了不同的干擾沉默效果，從序列的 5′、3′端選取的片段，干擾效果沒有序列中間部分片段的干擾效果好，或許是因?yàn)樵诨蛐蛄械?′端和3′端附近一般會(huì)存在某些調(diào)控元件等蛋白結(jié)合位點(diǎn)[17]，影響了dsRNA片段對序列的沉默效應(yīng)。同時(shí)，進(jìn)行in vitro RNAi時(shí)，一般需設(shè)置一個(gè)非靶標(biāo)基因的dsRNA作為對照，以證明靶標(biāo)基因的沉默確實(shí)是靶標(biāo)基因的dsRNA導(dǎo)致的，國際上比較常用GFP作對照。雖然在本研究中沒有使用GFP作為對照，但是本研究所使用的 3 個(gè)片段合成靶標(biāo)基因dsRNA中，有1個(gè)片段幾乎沒有干擾效果，因此可認(rèn)為靶標(biāo)基因的沉默是由靶標(biāo)基因dsRNA導(dǎo)致的。從圖3、4可以看出，F(xiàn)2對線蟲基因的干擾效果與對照的結(jié)果相比，基因表達(dá)量降低了69%，該干擾處理后的線蟲接種寄主植物后危害降低了，表現(xiàn)在產(chǎn)生的根結(jié)數(shù)減少了68.94%；而 F1對線蟲基因的干擾效果與對照的結(jié)果相比，基因表達(dá)量降低了21%，該干擾處理后的線蟲接種寄主番茄后，產(chǎn)生的根結(jié)數(shù)量卻減少了57.09%，對寄主的危害程度與 F2 的對應(yīng)趨勢不同，這說明體外合成dsRNA片段可以快速地沉默線蟲的目的基因，但是干擾處理過的線蟲接種寄主植物后，在培養(yǎng)過程中，土壤和自然環(huán)境中不可控制的因素很多，所以使得研究結(jié)果具有一定的局限性。

由于Mi-eft2在真核生物中比較保守，對于本研究中用于合成dsRNA的3個(gè)DNA片段的選擇，可能會(huì)非特異沉默其他生物的eft2基因。因此，在利用體外合成dsRNA快速沉默南方根結(jié)線蟲目的基因來研究其特性外，今后筆者還將考慮該3個(gè)片段與其它線蟲甚至高等生物的同源性，通過與其他物種的序列比對，找出該基因DNA序列中非同源性的序列進(jìn)行合成靶基因dsRNA片段的設(shè)計(jì)，然后，再構(gòu)建表達(dá)該基因dsRNA的植物表達(dá)載體，得到相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植物，進(jìn)行接種線蟲的實(shí)驗(yàn)，以期獲得更準(zhǔn)確的結(jié)果。

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