孫建波　鄒良平　李文彬　王宇光　彭明

摘 要 土壤微生物是土壤質(zhì)量和健康的敏感性指標。研究認為，根際微生物區(qū)系失調(diào)是作物土傳病害發(fā)生的一個重要原因。通過對香蕉不同生長期根際土壤中細菌多樣性和數(shù)量的研究，對香蕉枯萎病發(fā)生的機理及生物防治具有重要意義。實驗采用Real-time PCR和T-RFLP技術，對巴西蕉不同生長期根際細菌數(shù)量和多樣性進行了研究。結(jié)果表明：隨著香蕉生長期的增加，根際土壤細菌數(shù)量從3月的1.1×1010 copies/g土壤逐漸增加到7月的2.7×1010 copies/g土壤，隨后逐漸減少。然而，根際細菌多樣性從3月到7月呈逐漸減少趨勢，到7月達到最低，為1.99。另外，不同月份中優(yōu)勢菌的種類和在總細菌中所占的比例也不同。在實驗期內(nèi)，隨著香蕉生育期的延長，某些細菌種類大量繁殖，土壤根際細菌群落結(jié)構失衡，土壤微生物環(huán)境有惡化趨勢。

關鍵詞 香蕉；根際；土壤細菌群落；末端限制性酶切長度片段多態(tài)性；熒光定量PCR

中圖分類號 S668.1 文獻標識碼 A

Abstract Soil microorganism is a sensitivity index of soil quality and health. Some studies have indicated that the decline of microbial communities in the rhizosphere is an important reason for soil-borne diseases. The research on bacterial diversity in the rhizosphere of banana can be helpful to understand the mechanism of fusarium and know how to control it by biological methods. In this study， the techniques of Real-time PCR and terminal restriction fragment length polymorphlsm were used to analyze the abundance of soil bacteria and bacterial diversity in the rhizosphere of banana. During the growing stages from March to July， the abundance of bacteria changed from 1.1×1010 copies.g-1 soil in March to 2.7×1010 copies/g soil in July， and then gradually decreased. In contrast， the indices of bacterial diversity decreased from 2.52 in March to 1.99 in July. However， it increased gradually from July to September. In addition， significant changes of the bacterial community abundance and diversity of dominant bacteria were observed in the rhizosphere of banana. The species and proportion of dominant bacteria were significantly changed in different growing stages of banana. The results indicated that the abundance of soil bacteria and bacterial diversity in the rhizosphere were changed during the growing stage of banana.

Key words Banana； Rhizosphere； Soil bacterial communities； T-RFLP； Real-time PCR

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.06.019

香蕉枯萎病是一種土傳病害，目前化學藥劑和抗性育種對香蕉枯萎病的防效有限。因此，迫切需要尋找新的防治香蕉枯萎病的方法。近年來，越來越多的學者提出從根際微生物區(qū)系的角度來研究作物土傳病害的新思路。

土壤中微生物種群及結(jié)構的異常變動與作物土傳病害的發(fā)生密切相關。土壤中有益微生物與有害微生物之間保持著一定的動態(tài)平衡關系。已有研究表明，良好的根際微生物區(qū)系可以有效抑制土傳病害的發(fā)生[1-3]。研究認為，微生物種群結(jié)構失衡是導致連作障礙和作物減產(chǎn)的重要原因[4-5]。

當土壤中微生物多樣性水平降低、病原拮抗菌減少時，土壤抑制病害能力降低，病害隨之發(fā)生。吳鳳芝等[6]研究表明，不同作物與黃瓜間作提高了黃瓜土壤細菌多樣性，降低了黃瓜病情指數(shù)。王麗麗等[7]研究表明，通過增加煙草土壤中細菌群落的多樣性和數(shù)量，可以有效防控煙草青枯病和連作障礙。

因此，研究香蕉不同生育期土壤中微生物菌群的演替規(guī)律，進一步明確不同生育期的優(yōu)勢菌，進而針對性地引入病原拮抗菌和有益菌，對抑制病原菌增殖和病害發(fā)生具有重要意義，而目前還未見相關研究報道。

實時熒光定量PCR（Real-time PCR）技術由于具有較高的特異性和靈敏性，已廣泛應用于土壤微生物的檢測方面。末端限制性片段長度多態(tài)性（T-RFLP）技術能獲得大量因無法培養(yǎng)而不能獲得的微生物信息，已被用來研究復雜的細菌群落結(jié)構。

細菌在土壤微生物群落中數(shù)量和種類最多，在土壤生態(tài)系統(tǒng)中起著主要作用。本研究通過分析香蕉生長期根際土壤細菌群落的變化，為在實踐中通過土壤微生物種群和結(jié)構的改良，減輕香蕉土傳病害和連作障礙提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

香蕉品種為巴西蕉（Musa sp.， AAA， Cavendish group cv. Baxi）。香蕉組培苗于2月種植于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術研究所試驗田。供試土壤熱帶紅壤土，前茬未種植任何作物。土壤基本理化性質(zhì)為：有機質(zhì)含量1.48%、堿解氮595.60 mg/kg、有效磷129.30 mg/kg、速效鉀43.39 mg/kg、pH6.65。試驗地采用常規(guī)管理，人工去除雜草。每2個月采用抖落法收集根部土壤，過篩后存于4 ℃冰箱。各處理重復3次，每次重復4株香蕉。對照不種植任何作物。

1.2 方法

1.2.1 土壤總DNA的提取 利用Fast DNA SPIN kit for soil（Qbiogene）提取。DNA的純度和濃度利用紫外分光光度計測定（Jasco，Tokyo，Japan）。每個土樣平行提取3次混合作為1次重復。

1.2.2 Real-time PCR 細菌群落數(shù)量的大小利用實時熒光定量PCR（Real-time PCR）來分析。Real-time PCR反應體系：25 μL反應體系中包含12.5 μL SYBRGreen PCR Master Mix，10 ng模板DNA，0.1 μmol/L細菌通用引物338F：5′-CCTACGGGAG

GCAGCAG-3′和518R：5′-ATTACCGCGGCTGCTG

G-3′[8]。反應條件為：95 ℃ 3 min；95 ℃變性30 s，53 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，40個循環(huán)。每一個土壤樣品3次重復。

1.2.3 標準品制備 利用通用引物27F：5′-AGA

GTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-GGTTAC

CTTGTTACGACTT-3′[9]擴增細菌保守區(qū)16S rDNA片段。反應體系和條件同上。PCR純化后與pGEM-T載體連接構建重組質(zhì)粒。將測序正確的陽性克隆擴增培養(yǎng)后提取質(zhì)粒DNA，用紫外分光光度計測定其濃度，梯度稀釋后用作標準品。標準品質(zhì)量濃度根據(jù)核酸分子長度和阿伏加德羅常數(shù)換算成模板拷貝數(shù)濃度。

1.2.4 細菌群落數(shù)量大小的計算 待測樣品與標準品應用同一反應條件，同時進行Real-time PCR，根據(jù)熒光定量PCR儀自動生成的標準曲線計算對待測樣品進行定量分析。

1.2.5 T-RFLP 用細菌通用引物27F：5′-AGAG

TTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-GGTTACC

TTGTTACGACTT-3′[10]。擴增細菌16S rDNA保守區(qū)片段。其中27F引物的5′端用6-carboxyfluorescein（6-FAM）熒光標記以便檢測。25 μL PCR反應體系如下：10×PCR buffer（無Mg2+）2.5 μL，dNTP（10 mmol/L）0.5 μL，Mg2+（25 mmol/L）2 μL，引物（20 μmol/L）各0.25 μL，Taq DNA polymerase（5 U/μL）0.25 μL，模板DNA 0.5 μL。反應條件為95 ℃ 3 min，95 ℃變性30 s，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，30個循環(huán)。每個土壤樣品3次重復，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后混合并用Qiagen gel extraction kit（Qiagen， Germany）純化。純化后的PCR產(chǎn)物用HaeIII限制性內(nèi)切酶進行酶切。20 μL酶切反應體系中包含8 μL PCR產(chǎn)物，2.0 μL 10×PCR buffer，3U HaeIII內(nèi)切酶，混勻后37 ℃酶切3 h。酶切產(chǎn)物用純化試劑盒（Omega）進行脫鹽純化。純化產(chǎn)物送往上海生工生物公司在ABI 373測序儀（Applied Biosystems）上進行基因掃描。

1.3 數(shù)據(jù)分析

末端限制性片段（Terminal restriction fragments，T-RFs）的大小和強度采用GENEMAPPER（4.0，Applied Biosystem）軟件進行分析。每個T-RF的相對豐度以相對峰面積值（即每個T-RF所擁有的峰面積占總峰面積的百分比）計算。為避免雜峰的干擾，T-RF相對豐度低于2%的不予考慮，另外，片段長度小于50 bp或大于600 bp的T-RF也不予分析。相對豐度大于6%的T-RF被認為各處理中的主要細菌。本實驗中各相對豐度為前5位的T-RF所代表的細菌被稱為各處理中的優(yōu)勢細菌。利用BIO-DAP軟件進行細菌群落多樣性指數(shù)（Shannon Diversity H′）的計算。利用SPSS進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 香蕉不同生長期根際細菌數(shù)量分析

本實驗中基于細菌16S rRNA保守基因進行Real-time PCR擴增，對香蕉根際土壤總細菌進行定量分析。實驗結(jié)果表明，在香蕉生長的不同時期，根際細菌數(shù)量發(fā)生了明顯的變化。3、5、7和9月根際土壤細菌數(shù)量分別為1.1×1010、1.5×1010、2.7×1010、1.2×1010 copies/g土壤（圖1）。由圖1可以看出，3～7月，根際細菌數(shù)量呈逐漸增加趨勢，到7月達到最大值，隨后逐漸下降。Duncan檢驗表明，7月細菌數(shù)量顯著高于其它月份。

2.2 香蕉不同生長期根際細菌多樣性分析

根據(jù)統(tǒng)計分析可知，不同時期根際細菌的種類和相對豐度都發(fā)生了明顯的變化。去除雜峰干擾后的有效片段在3、5、7、9月的數(shù)量分別為15、14、10、13條。3～7月，細菌群落數(shù)逐漸減少，到9月又有所上升。主要細菌種類在不同生長期也表現(xiàn)出差異：3、5、7、9月的主要細菌種類分別為10、8、6、8種。

圖2是香蕉不同生長時期根際細菌多樣性的變化情況。3、5、7、9月根際土壤細菌多樣性分別為2.52、2.48、1.99、2.08。從圖中可以看出，3～7月，Shannon多樣性指數(shù)呈下降趨勢，然后又逐漸上升。

表1顯示了香蕉不同生長期根際土壤中優(yōu)勢群落情況。在3月和5月，共有的優(yōu)勢菌T-RF為231、196、307 bp的細菌。但它們在不同月份占總細菌中的比例卻不相同。在3月，231、196、307 bp的峰面積占總峰面積的比例分別為14.0%、10.7%、8.9%。而在5月，231、196、307 bp所占總峰面積的比例卻變?yōu)?4.3%、11.7%、9.8%。在7月和9月，共有的優(yōu)勢菌只有231 bp所代表的細菌。并且231 bp所占比例從7月的10.3%減少為9月的8.9%。另外，每個月份特有優(yōu)勢菌群的數(shù)量也發(fā)生了變化，3、5、7、9月特有細菌的數(shù)目分別為1種（328 bp）、1種（232 bp）、4種（72、188、66、90 bp）和1種（217 bp）。

以上結(jié)果表明：香蕉生長期間根際土壤細菌數(shù)量、多樣性和群落結(jié)構發(fā)生了明顯的變化。

3 討論

本研究結(jié)果表明：香蕉根際微生物數(shù)量隨著香蕉生長發(fā)育階段的不同而不同。香蕉根際細菌數(shù)量在7月達到最大后開始下降。金凌波等[11]研究表明，春季大豆從苗期到盛花期，根際細菌數(shù)量增加，盛花期到成熟期，又呈現(xiàn)減少趨勢。于翠等[12]研究表明，本溪山櫻根際解磷細菌數(shù)量在萌芽期最低，之后逐漸升高，落葉期又開始降低。并且認為，是由于根系生理代謝活動的強弱不同導致了解磷細菌數(shù)量的差異。這些結(jié)果均與本研究的結(jié)果相似。本研究中，香蕉根際土壤細菌多樣性指數(shù)隨著生育期的延長呈現(xiàn)出先下降然后又上升的趨勢。趙春芳等[13]研究表明，正茬麥冬在生長期，其根際土壤細菌多樣性也呈現(xiàn)先下降再上升趨勢，并且這種變化與作物生長代謝的強弱有關。本試驗中，根際土壤細菌數(shù)量在7月達到最高，然而多樣性指數(shù)在7月卻最低，這原因可能是香蕉根系在7月生理代謝旺盛，其代謝產(chǎn)物僅有利于某些特定菌群的生長而發(fā)展成為優(yōu)勢菌群，這些優(yōu)勢菌群對另外一些菌群具有競爭優(yōu)勢，結(jié)果造成少數(shù)優(yōu)勢菌群的大量繁殖，另外一些菌群在競爭中被抑制或消失。

根際土壤微生物的數(shù)量和種群結(jié)構與根系分泌物關系密切[14-15]。香蕉生長前期植株生長代謝逐漸加強，分泌物也逐漸增多，從而有利一些細菌的生長。7月后微生物數(shù)量呈下降趨勢，這種變化可能與根系代謝下降從而根系分泌物減少有關。微生物種群在競爭根系分泌物營養(yǎng)的同時，會造成一些微生物種群的消失[16-17]，這樣就打破了根際微生物種群的平衡，進而造成根際微生物多樣性呈下降趨勢。

4 結(jié)論

試驗表明：隨著香蕉生長期的增加，某些細菌種類大量繁殖，土壤根際細菌群落結(jié)構失衡，土壤微生物環(huán)境有惡化趨勢。劉艷霞等[18]研究認為，煙草土壤微生物多樣性的提高有利于土壤保持健康的生態(tài)平衡，從而抑制煙草青枯病的發(fā)生。因此，本研究結(jié)果從根際微生物生態(tài)方面為香蕉枯萎病的防治提供了一定的借鑒。

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