田亞然　范天剛　張鋼　李永紅

摘 要 低溫引起切花月季花朵過(guò)度重瓣化導(dǎo)致畸形在生產(chǎn)上亟需解決。以‘芬得拉（Rosa hybrida‘Vendela）為試材，以RT-PCR研究與月季花器官發(fā)育密切相關(guān)基因RhAP1， RhAP2， RhAP3， RhTM6， RhPI， RhAG， RhSHP， RhWUS在不同溫度不同花芽分化時(shí)期表達(dá)量。發(fā)現(xiàn)過(guò)度重瓣化形成關(guān)鍵時(shí)期，只有RhAG表達(dá)水平相對(duì)較高，且低溫下表達(dá)水平明顯低于常溫，相比其它基因變化最明顯。本課題組推測(cè)RhAG在低溫導(dǎo)致的過(guò)度重瓣化中可能起著主要調(diào)控作用。為深入研究，以RT-PCR結(jié)合RACE克隆到RhAG全長(zhǎng)。其全長(zhǎng)4 942 bp，包含7個(gè)內(nèi)含子、8個(gè)外顯子，開(kāi)放閱讀框747 bp，編碼248個(gè)氨基酸，N端含保守MADS-box、K-box結(jié)構(gòu)域，屬M(fèi)ADS-box家族。洋蔥表皮亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)其位于細(xì)胞核內(nèi)，屬核蛋白。上述結(jié)果對(duì)明確低溫導(dǎo)致月季花朵過(guò)度重瓣化分子機(jī)制提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 切花月季；RhAG；低溫；過(guò)度重瓣化；花器官發(fā)育

中圖分類(lèi)號(hào) S685.12 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract The excessive double flowers in rose caused by low temperature， resulting to abnormal flowers needs prompt solutions in production. To use Rosa hybrida‘Vendelaas the material and take RhAP1， RhAP2， RhAP3， RhTM6， RhPI， RhAG， RhSHP， RhWUS which are closely related to rose floral organ development as the research objects. Their expression quantity at different temperature and different flower bud differentiation period were analyzed by RT-PCR technique.We found that the expression level of RhAG was higher than others at the key period of excessive double flowers in rose caused by low temperature， the expression at low temperature was much lower and its change was the most obvious. It indicated that RhAG played a major regulatory role in the excessive double flowers in rose caused by low temperature.For further research， we amplified the full length of RhAG by RACE and RT-PCR techniques.The results showed that the cloned full-length cDNA of RhAG was 4 942 bp， containing a 747 bp open reading frame（ORF）which encoded 248 amino acids. It had 7 introns and 8 exons. Protein alignment analysis showed that RhAG protein contained a MADS domain and a K domain at N terminal which indicated that RhAG was a member of MADS-box family. We used onion epidermal sub-cellular location to locate RhAG， and found that RhAG was located in cell nucleus， it was a nucleoprotein.

Key words Cut rose； RhAG； Low temperature； Excessive double flowers； Flower organ development

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.06.016

重瓣性是觀賞植物花器官重要性狀[1]，過(guò)度重瓣化降低觀賞特性，嚴(yán)重影響經(jīng)濟(jì)效益。重瓣花起源分積累、臺(tái)閣、重復(fù)、苞片、花序、雌雄蕊6種[2]。月季屬雄蕊起源，重瓣和過(guò)度重瓣均源自雄蕊[3-4]。雄蕊瓣化屬花器官發(fā)育范疇，符合ABCE模型[5-6]，即A，E決定萼片特性，A，B，E決定花瓣特性，B，C，E決定雄蕊特性，C，E決定心皮特性。目前重瓣化分子機(jī)理研究主要集中在C功能基因突變導(dǎo)致下游調(diào)控因子變化導(dǎo)致重瓣化[7]，如金魚(yú)草C功能AG同源基因FAR的缺失突變導(dǎo)致雄蕊瓣化形成重瓣花[8]；麝香百合（Lilium longiflorum）因C類(lèi)基因向中央收縮使外輪雄蕊變成花瓣形成重瓣花[9]等。

有關(guān)環(huán)境因子對(duì)花器官同源轉(zhuǎn)化影響的研究?jī)H停留在生理方面。低于13 ℃石竹科（Caryophyllaceae）紅粉雪輪花瓣增加，雄蕊減少；重瓣香雪蘭高溫形成單瓣花[10]；月季‘芬德拉在晝/夜溫15/5 ℃雄蕊顯著減少，花瓣增加[4]等，其形成的分子機(jī)理尚未見(jiàn)報(bào)道。有關(guān)常溫月季重瓣化分子機(jī)理研究取得一定進(jìn)展，重瓣‘Malmaison和單瓣‘St Annes月季花器官形成不同階段，B功能基因RhTM6，RhAP3，RhpI表達(dá)基本相似，C類(lèi)唯RhAG在2個(gè)品種間有較大差異，后者轉(zhuǎn)錄本積累量為前者的5倍，且表達(dá)域擴(kuò)展[1]，表明常溫月季重瓣化AG具有決定作用。但迄今為止，低溫導(dǎo)致月季過(guò)度重瓣化分子機(jī)制仍不明確。

月季是第一大切花，過(guò)度重瓣化使品質(zhì)降低80%～90%，嚴(yán)重影響經(jīng)濟(jì)效益。據(jù)EST數(shù)據(jù)庫(kù)，RhAP1， RhAP2， RhAP3， RhTM6， RhPI， RhAG， RhSHP， RhWUS與月季花器官發(fā)育密切相關(guān)。AP1，AP2屬A功能基因，決定萼片、花瓣特性[11-12]。AP3，TM6，PI屬B功能基因[13]，決定花瓣、雄蕊特性；AG是唯一C功能基因；SHP屬D功能基因，控制心皮發(fā)育；WUS為頂端分生組織特征基因，維持AG活性[14]。本研究擬對(duì)比8個(gè)基因在花芽分化4個(gè)時(shí)期常溫與低溫表達(dá)差異，確定低溫引起過(guò)度重瓣化的關(guān)鍵基因，對(duì)其克隆并探討基因型，為解決月季生產(chǎn)瓶頸問(wèn)題提供理論依據(jù)，并為花朵品質(zhì)改良、分子育種提供基因儲(chǔ)備。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

實(shí)驗(yàn)自2014年9月在深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院進(jìn)行。以生長(zhǎng)健壯2年生‘芬得拉盆栽苗為試材，修剪后培養(yǎng)于Thermoline TPG-6000-TH生長(zhǎng)室。常溫（A）：25 ℃/15 ℃（晝/夜）；低溫（B）：15 ℃/5 ℃（晝/夜）。其它條件相同（光強(qiáng)70 μmol/（m2·s），光照時(shí)間12 h，相對(duì)濕度60%）。依據(jù)項(xiàng)目組前期月季花芽分化切片結(jié)果[4]對(duì)應(yīng)的在不同溫度下的萌芽天數(shù)和花芽直徑大小確定花芽分化期，2個(gè)月后分別取萼片原基分化期（第1時(shí)期），花瓣原基分化期（第2時(shí)期），雄蕊原基分化期（第3時(shí)期），雌蕊原基分化期（第4時(shí)期）花芽，液氮速凍后-80 ℃冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀器：ABI PRISMR 7500 Sequence Detection System，試劑盒：Invitrogen公司的Platinum SYBR Green qPCR Supermix-UDG。引物見(jiàn)表1。步驟見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。以RhTCTP為內(nèi)參。以最小Ct值作為判定標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)程序：94 ℃ 2 min，94 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40次循環(huán)，每次循環(huán)第3步進(jìn)行熒光采集，最后95 ℃ 1 min，退火至55 ℃，保溫1 min，檢測(cè)熒光值，繪制熔點(diǎn)曲線。基因表達(dá)情況采用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線法分析。以每個(gè)基因在常溫下第1時(shí)期表達(dá)量為對(duì)照，SPSS軟件分析差異顯著性。4個(gè)時(shí)期不同溫度處理的樣品均設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2.2 RNA的提取及cDNA的合成 步驟見(jiàn)pBiozol植物總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)。以Super Script TMII RNaseH Reverse Transcriptase（Invitrogen）和Random Primer合成單鏈cDNA。反應(yīng)體系和過(guò)程：0.5 μL oligo dT primers，1 μL dNTP，2 μg Total RNA，加DEPC至13 μL，70 ℃變性5 min，冰浴3 min，加4 μL 5×buffer，2 μL 0.1 mol/LDTT，反轉(zhuǎn)錄酶1 μL，42 ℃反應(yīng)90 min，冰浴10 min。

1.2.3 RhAG基因的克隆與生物信息學(xué)分析 月季EST數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//bioinfo.bti.cornell.edu/cgi-bin/rose_454/index.cgi）獲得Unigene片段，Primer primer 5.0設(shè)計(jì)引物（見(jiàn)表1）。以cDNA為模版擴(kuò)增目的基因序列。TIANGEN凝膠回收試劑盒回收純化，連接載體pMD19-T Vector，轉(zhuǎn)化DH5ɑ。PCR檢測(cè)陽(yáng)性克隆送華大基因測(cè)序。

ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam）在線分析氨基酸理化性質(zhì)，TMHMM Serverv. 2.0蛋白跨膜性分析，PROSITE、InrerProScan預(yù)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)及功能位點(diǎn)，NCBI上Blast比對(duì)，分析與其他物種同源性，MEGA5.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，自展法（Bootstrap）與已報(bào)道其同源基因氨基酸序列進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析。

1.2.4 洋蔥表皮亞細(xì)胞定位 Blast X比對(duì)找出RhAG全部CDS序列。用帶XhoⅠ和SmaⅠ內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的引物（見(jiàn)表1）擴(kuò)增編碼區(qū)序列，連接到pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化DH5ɑ，PCR檢測(cè)陽(yáng)性送華大基因測(cè)序?；驑屴Z擊法將融合表達(dá)載體導(dǎo)入洋蔥表皮細(xì)胞中，使目的基因與綠色熒光蛋白（GFP）瞬時(shí)融合表達(dá)。Zeiss LSM510 META共聚焦顯微鏡下觀察洋蔥表皮細(xì)胞中的綠色熒光信號(hào)。

2 結(jié)果與分析

2.1 常溫和低溫下不同時(shí)期的基因表達(dá)分析

通過(guò)RT-PCR得到了8個(gè)基因常溫下4個(gè)時(shí)期的表達(dá)量（圖1）。對(duì)比發(fā)現(xiàn)：RhAP1，RhAP3主要在花瓣發(fā)育時(shí)期表達(dá)；RhAP2，RhTM6主要在萼片時(shí)期微弱表達(dá)；RhPI在4個(gè)時(shí)期均微弱表達(dá)，無(wú)明顯差異；RhAG在第1，2時(shí)期幾乎不表達(dá)，在雄蕊、雌蕊時(shí)期表達(dá)量顯著升高；RhSHP主要在花瓣、雌蕊時(shí)期表達(dá)；RhWUS在第2，3，4時(shí)期均表達(dá)。由以上分析本課題組發(fā)現(xiàn)在月季花發(fā)育過(guò)程中，只有RhAG符合前2個(gè)時(shí)期幾乎不表達(dá)，在雄蕊、雌蕊時(shí)期大量表達(dá)的特點(diǎn)，與重瓣花形成的關(guān)鍵時(shí)期特點(diǎn)相符。因此，常溫下RhAG是重瓣花形成的關(guān)鍵基因。

通過(guò)SPSS分析4個(gè)時(shí)期8個(gè)基因常溫、低溫表達(dá)差異發(fā)現(xiàn)：RhAP1在1，2，3時(shí)期差異極顯著（圖1），在第1時(shí)期差異最明顯；RhAP2在1，2，4時(shí)期差異極顯著，在第2時(shí)期差異最明顯；RhAP3在1，3，4時(shí)期差異極顯著，在第1時(shí)期差異最明顯；RhPI在1，3時(shí)期差異極顯著，在第1時(shí)期差異最明顯；RhAG在第3，4時(shí)期差異極顯著，均很明顯；RhSHP在第1時(shí)期差異極顯著；RhTM6在1，2時(shí)期差異極顯著；RhWUS在2，3，4差異顯著。由此可見(jiàn)，與月季花器官發(fā)育密切相關(guān)的基因中，只有RhAG在花朵過(guò)度重瓣化形成關(guān)鍵時(shí)期--3，4時(shí)期在常溫與低溫的表達(dá)量相比其他基因變化最明顯。由此推測(cè)在低溫導(dǎo)致的過(guò)度重瓣化中RhAG可能起主要調(diào)控作用。

2.2 RhAG基因的克隆

采用Tail-PCR技術(shù)獲得RhAG基因組序列。分析表明：全長(zhǎng)4 942 bp，包含7個(gè)內(nèi)含子，8個(gè)外顯子，開(kāi)放閱讀框747 bp，編碼248個(gè)氨基酸（圖2），5′UTR長(zhǎng)48 bp，3′UTR長(zhǎng)324 bp，分子量約28.5 ku，理論等電點(diǎn)9.40，未發(fā)現(xiàn)含跨膜區(qū)域。BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)N端含約60個(gè)氨基酸的MADS-box保守區(qū)域，在110～172氨基酸之間有一個(gè)K-box區(qū)域（圖2），具M(jìn)ADS-box家族典型結(jié)構(gòu)特征。本課題組將月季AGAMOUS基因命名為RhAG。

2.3 氨基酸序列對(duì)比和系統(tǒng)聚類(lèi)分析

通過(guò)同源蛋白氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)RhAG和擬南芥AtAG，矮牽牛FBP6，金魚(yú)草PLE，水稻OsMADS58，煙草NAG1，玉米ZAG1和番茄TAG1的氨基酸序列在MADS-box及K-box區(qū)域有極高相似性（圖2）。MADS-box區(qū)域?qū)τ贒NA結(jié)合必需，K-box區(qū)域在AG和其他MADS基因協(xié)同作用中發(fā)揮重要作用[15]。同時(shí)，利用C1uSta1X1.81軟件，采用MEGA5.0將RhAG所編碼氨基酸序列與已報(bào)道AG同源基因氨基酸序列進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析，發(fā)現(xiàn)RhAG和同屬玫瑰MASAKO C1聚為一枝（98.4%）；在遺傳距離上，RhAG與草莓FvAG、蘋(píng)果MADS14、可可TcAG、非洲菊GAGA2和毛果楊PTAG1進(jìn)化距離較近（圖3）。

2.4 亞細(xì)胞定位分析

細(xì)胞中蛋白質(zhì)合成后被轉(zhuǎn)運(yùn)到特定細(xì)胞器，只有轉(zhuǎn)運(yùn)到正確的部位才能參與細(xì)胞的各種生命活動(dòng)[15]。以沒(méi)有融合目的基因的空載體pUC-SPYNE為對(duì)照，本課題組構(gòu)建了綠色熒光蛋白（GFP）與RhAG的融合表達(dá)載體以檢測(cè)RhAG在細(xì)胞中的具體功能部位。結(jié)果表明（圖4）：對(duì)照的GFP綠色熒光信號(hào)在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、細(xì)胞核內(nèi)均有分布，分布并無(wú)特異性；而融合了RhAG蛋白的RhAG-GFP在細(xì)胞內(nèi)僅分布在細(xì)胞核內(nèi)，這說(shuō)明RhAG是核定位蛋白。

3 討論與結(jié)論

溫度是影響植物成花的關(guān)鍵因素，低溫不僅影響花芽分化進(jìn)程，而且通過(guò)影響花瓣和雄蕊等花器官的發(fā)育造成花朵畸形[16]。本研究以EST數(shù)據(jù)庫(kù)得到的RhAP1， RhAP2， RhAP3， RhTM6， RhPI， RhAG， RhSHP， RhWUS 8個(gè)與月季花器官發(fā)育密切相關(guān)的基因?yàn)檠芯繉?duì)象，通過(guò)基因時(shí)空表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，RhAG在雄蕊、雌蕊分化期表達(dá)水平相對(duì)較高，且在低溫條件下表達(dá)量明顯低于常溫，相比其它基因變化最明顯。AG是在擬南芥中發(fā)現(xiàn)最早的花發(fā)育調(diào)控基因，也是唯一具有C功能的同源異形基因，AG是調(diào)控雄蕊和心皮發(fā)育的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[17]，是影響雄蕊和花瓣分化的關(guān)鍵基因[18]。

前人研究表明，擬南芥中AG早期調(diào)控雌雄蕊發(fā)育，后期決定細(xì)胞分化，并控制花分生組織的終止[14]。在重瓣百合‘Elodie中雄蕊重瓣化程度越高，C功能基因LelAG1在花器官發(fā)育3、4輪中的表達(dá)量越低[19]；日本重瓣晚櫻（Prunus lannesiana）‘Albo-rosea很可能是ag突變體[20]；在擬南芥中，AG缺失導(dǎo)致雄蕊轉(zhuǎn)變?yōu)榛ò晷纬芍匕昊?，?dāng)AG 反義基因?qū)牒髣t出現(xiàn)雄蕊、心皮轉(zhuǎn)變?yōu)榛ò旰突ㄝ郲21]等，都佐證了AG可能參與重瓣花形成。另外，月季花芽分化早期對(duì)溫度比較敏感，花瓣數(shù)量與溫度密切相關(guān)，低溫會(huì)導(dǎo)致花朵過(guò)度重瓣化產(chǎn)生畸形[4，22]。而在擬南芥中bell突變體能夠在溫度和時(shí)間上解除對(duì)AG基因的抑制作用，因此推斷AG基因的表達(dá)采用溫度和時(shí)間依賴(lài)型的分子機(jī)制[23]。本研究中，本課題組從切花月季‘芬得拉花芽中分離得到RhAG基因。RhAG屬于MADS-box基因，具有高度保守MADS-box區(qū)和K-box區(qū)域。通過(guò)對(duì)RhAG氨基酸序列比對(duì)分析，顯示切花月季RhAG與同屬玫瑰以及同科的草莓、蘋(píng)果、毛果楊的C功能基因進(jìn)化關(guān)系較近。同時(shí)，瞬時(shí)轉(zhuǎn)化RhAG-GFP在洋蔥表皮細(xì)胞中，證明其定位在細(xì)胞核內(nèi)。通過(guò)對(duì)切花月季RhAG在不同溫度及花器官發(fā)育各時(shí)期表達(dá)量進(jìn)行分析表明，RhAG在花器官發(fā)育進(jìn)程中的表達(dá)受溫度的影響，并且低溫導(dǎo)致RhAG基因表達(dá)量的降低。對(duì)低溫和常溫條件下RhAG基因表達(dá)量進(jìn)行比較，結(jié)果顯示無(wú)論在常溫還是低溫條件下，花器官發(fā)育的第1，2輪中都幾乎沒(méi)有表達(dá)，這與前人的研究結(jié)果一致[22]；在第3，4輪中，RhAG基因的表達(dá)量明顯升高，但低溫條件下的表達(dá)量比常溫條件下顯著降低。因此，低溫下月季花瓣過(guò)度重瓣化導(dǎo)致的花朵畸形與RhAG的表達(dá)降低息息相關(guān)，但此現(xiàn)象是通過(guò)RhAG單基因或與其他相關(guān)基因協(xié)同影響，及低溫引起切花月季過(guò)度重瓣化的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚需進(jìn)一步研究。

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