陳新　方開星　馬平安　劉陳　王文泉

摘 要 克隆了野生木薯蔗糖合酶I基因的5′側(cè)翼序列，發(fā)現(xiàn)其5′UTR區(qū)存在一個前導內(nèi)含子，為了探究該基因啟動子的調(diào)控區(qū)域以及前導內(nèi)含子的可能功能，構(gòu)建了6個側(cè)翼序列梯度缺失載體并轉(zhuǎn)化煙草。結(jié)果表明：野生木薯蔗糖合酶I基因的前導內(nèi)含子可單獨起始基因的轉(zhuǎn)錄，部分啟動子序列的缺失會對基因的轉(zhuǎn)錄活性產(chǎn)生較大影響；不同缺失載體煙草轉(zhuǎn)化株響應ABA的程度和方向存在差異，可能與ABA響應相關順式作用元件的分布以及啟動子序列與前導內(nèi)含子的互作相關。該結(jié)果將會對木薯蔗糖合酶I基因的遺傳改良提供理論指導。

關鍵詞 蔗糖合酶；啟動子；前導內(nèi)含子；順式作用元件

中圖分類號 S533 文獻標識碼 A

Abstract The 5′ flanking sequence of sucrose synthase I gene was cloned in a wild cassava， and a leader intron in its 5′UTR. In order to explore the regulated domain of the promoter region and the possible function of leader intron， six deleted vectors were constructed and transformed into tobacco. The results showed that the leader intron of the wild cassava SuSy1 gene could start gene transcription by itself， and the sequence deletion in promoter had great influence on the transcription activity of SuSy1 gene. There were differences in magnitude and direction responding to ABA treatment among these transformed tobacco plants， it possibly caused by the distribution of ABA responsive cis-element， as well as the interactions between the regulated domains of promoter and the leader intron. In general， these results will provide theoretical guidance for genetic improvement of cassava SuSy1 gene.

Key words Sucrose synthase； Promoter； Leader intron；Cis-element

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.06.013

植物合成淀粉大都從分解光同化物蔗糖開始，并經(jīng)過一系列的生化過程來合成淀粉。蔗糖合酶（SuSy）和腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）是已知的2個在蔗糖向淀粉轉(zhuǎn)化過程中起重要作用的限速酶，其中蔗糖合酶是開啟蔗糖向淀粉轉(zhuǎn)化的第一個酶，催化蔗糖+UDP←→果糖+UDPGlc的可逆反應，UDPGlc是淀粉合成的前體[1]，而且蔗糖合酶的活性可被蔗糖、缺氧和傷害誘導上調(diào)[2]。

蔗糖合酶在植物各組織中普遍存在，且在庫器官中活性普遍較高[3]。在馬鈴薯中抑制蔗糖合酶基因的表達，其塊莖中蔗糖含量無明顯變化，但淀粉積累受到抑制且產(chǎn)量減少[4]，而過量表達SuSy4基因，蔗糖合酶活性顯著增強，塊莖中淀粉、ADPG 和UDPGlc 的含量增加，塊莖產(chǎn)量提高[5]。此外，在玉米中增強蔗糖合酶的活性也同樣可增加種子胚乳中的淀粉和ADPG含量[6]。由此可見，SuSy基因的表達豐度和酶活性可顯著影響植物庫器官吸收光同化物（尤其是蔗糖）的能力，而且蔗糖合酶是植物庫器官淀粉生物合成的重要調(diào)節(jié)酶。

木薯是重要的產(chǎn)淀粉熱帶塊根作物，也是中國熱區(qū)燃料乙醇加工的主要原料。木薯SuSy1是目前已知在木薯塊根中表達活性最高的蔗糖合酶基因家族成員[7]，本文克隆了野生木薯SuSy1基因的5′側(cè)翼序列，構(gòu)建梯度缺失啟動子對5′側(cè)翼序列中的調(diào)控區(qū)域進行鑒定，并對前導內(nèi)含子的功能進行推測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 本氏煙（Nicotiana benthamiana），由本實驗室繁殖并保存；木薯栽培品種KU50，來自中國木薯種質(zhì)資源圃（海南儋州）。

1.1.2 主要試劑 大腸桿菌菌株DH5a感受態(tài)由本實驗室制備并保存。RNAplant植物RNA提取試劑（Tiangen），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa），瓊脂糖凝膠回收試劑盒（Omega），限制性內(nèi)切酶（ThermoFisher）均購自于海南光威公司，其它藥品試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 野生木薯MeSuSyI基因5′側(cè)翼序列的克隆與分析 在木薯基因組數(shù)據(jù)庫（http：//phytozome.jgi.doe.gov）獲取cassava4.1_001871m（MeSuSyI）部分編碼序列及其5′端共計約3 000 bp，并以此序列利用Primer-BLAST程序設計引物SSP1和SSP2（表1）。以野生木薯W14的基因組DNA為模板得到特異PCR產(chǎn)物，經(jīng)回收、克隆至PMD18-T載體。利用順式作用元件分析軟件PLACE[8]和PlantCARE[9]，對獲得的5′側(cè)翼序列進行順式作用元件預測。

1.2.2 轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建與遺傳轉(zhuǎn)化 MeSuSyI基因5′側(cè)翼序列的梯度缺失依次為-1027U1IU2（轉(zhuǎn)錄起始位點為+1，-1027表示轉(zhuǎn)錄起始位點前1 027 bp，U1表示前導內(nèi)含子前54 bp UTR，I表示前導內(nèi)含子，U2表示前導內(nèi)含子后20 bp UTR），-876U1IU2，-651U1IU2，309U1IU2，U1IU2和-1027，并利用引物組合SSP1027、SSP876、SSP651、SSP309、SSPU1和SSPR1，及SSP1027和SSPR2以野生木薯基因組DNA為模板進行PCR擴增（表1）。將上述特異PCR產(chǎn)物純化、酶切后連接到pCAMBIA1301轉(zhuǎn)化載體上，替換原來的CaMV35S 啟動子驅(qū)動GUS基因的表達，得到的梯度缺失轉(zhuǎn)化載體依次命名為pE1027U1IU2：：GUS， pE876U1IU2：：GUS， pE651U1IU2：：GUS， pE309U1IU2：：GUS， pEU1IU2：：GUS and pE1027：：GUS。這6個轉(zhuǎn)化載體利用農(nóng)桿菌（EHA105）介導的方法轉(zhuǎn)化本生煙草（Nicotiana benthamiana）獲得陽性轉(zhuǎn)化芽。

1.2.3 植物材料的培養(yǎng)與處理 所有轉(zhuǎn)基因陽性芽在潮霉素濃度為25 mg/L的MS培養(yǎng)基上生長，16 h光照8 h黑暗，環(huán)境溫度26 ℃。3周后選取根系發(fā)達的粗壯植株置于室內(nèi)常溫煉苗，6～7 d后開蓋并加入少量水浸泡2 h，剪去黃化葉并洗掉根系上的培養(yǎng)基，移栽到花盆中（營養(yǎng)土v ∶ 椰糠v=1 ∶ 1）覆膜保濕，7 d后揭膜置于溫室生長，據(jù)其長勢施用少許肥料，并適時收取T1代本氏煙轉(zhuǎn)基因種子。

取T1代種子，70%酒精和2.5%次氯酸鈉溶液消毒后，播于潮霉素MS固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，16 h光照8 h黑暗15 d后，取正常生長種子苗，一部分用于GUS蛋白組織染色，另一部分轉(zhuǎn)移到MS固體培養(yǎng)瓶繼續(xù)生長，待苗齡45～60 d時選取長勢良好的植株直接取樣，或ABA處理后取樣用于GUS蛋白酶活性定量檢測。

ABA處理：每個培養(yǎng)瓶中加入1.0 mL濃度為100 μmol/L的ABA溶液，使其均勻覆蓋于培養(yǎng)基表面，后置于以前的光照環(huán)境中1.5 h，取轉(zhuǎn)基因本氏煙植株展開葉液氮速凍。對照和ABA處理的每個轉(zhuǎn)化載體均取樣3株混合為一個實驗樣品，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 轉(zhuǎn)基因植株的組織化學染色和GUS酶活定量檢測 取4葉期左右的轉(zhuǎn)基因煙草無菌苗，浸入X-Gluc染色液（GBT， St. Louis， USA），置于37 ℃溫浴過夜，顯色后酒精脫色并拍照。GUS酶活定量檢測參照 Jefferson等[10]和Zhu等[11]的方法進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生木薯SuSy1基因5′側(cè)翼序列的克隆與分析

木薯SuSy1基因（cassava4.1_001871m）是其家族在貯藏器官中表達活性最高的成員，根據(jù)網(wǎng)站http：//phytozome.jgi.doe.gov中木薯品種AM560基因組草圖提供的5′側(cè)翼序列信息設計引物，以野生木薯基因組DNA為模板，PCR擴增獲得了約2.1 kb的DNA序列?？寺〔y序后，獲得野生木薯SuSy1基因ATG上游2 146 bp序列，進一步分析發(fā)現(xiàn)，野生木薯SuSy1基因的5′側(cè)翼序列中有1個1 042 bp的前導內(nèi)含子（Leader Intron， 圖1）。啟動子區(qū)的TATA box，CAAT box等關鍵元件和其它順式作用元件的分布詳見表2。

2.2 野生木薯SuSy1基因啟動子調(diào)控區(qū)間的篩選

在進行GUS酶活測定前，首先獲得了植物總蛋白濃度測定的標準曲線：Ya=20.936Xa-13.285，R2=0.997 9，Ya為蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），和4-MU熒光標準曲線：Yb=0.474 3Xb-64.568，R2=0.999 1，Yb為4-MU的量（nmol）。參考前人的GUS酶活檢測方法，對梯度缺失啟動子啟動GUS基因的活性進行了定量測定，發(fā)現(xiàn)在6個梯度缺失載體轉(zhuǎn)化苗中，pE876U1IU2：：GUS和pEU1IU2：：GUS植株的GUS酶活明顯高于其它轉(zhuǎn)化植株，由此可知，野生木薯SuSy1基因的前導內(nèi)含子具有啟動活性，可以直接起始基因的轉(zhuǎn)錄；-1027至-877區(qū)間的151 bp序列對啟動子活性有較強的抑制作用；-876至-652區(qū)間的225 bp序列可極大地提高啟動子的轉(zhuǎn)錄活性；SuSy1基因的啟動子與前導內(nèi)含子組合起來的啟動活性低于前導內(nèi)含子單獨驅(qū)動的啟動活性（圖2～3）。

2.3 野生木薯SuSy1基因啟動子對ABA的響應

轉(zhuǎn)化植株脫落酸（ABA）處理1.5 h后，取上部葉片測定GUS酶活，發(fā)現(xiàn)6個梯度缺失載體轉(zhuǎn)化苗中，pE1027U1IU2：：GUS和pE651U1IU2：：GUS植株GUS酶活極顯著上調(diào)，pE876U1IU2：：GUS、pEU1IU2：：GUS和pE1027：：GUS植株GUS酶活極顯著或顯著下調(diào)（圖3）。由此可知，p1027U1IU2與p1027和pU1IU2響應ABA處理的方向相反，p1027U1IU2上調(diào)，而p1027和pU1IU2下調(diào)；ABA處理條件下，p876U1IU2下調(diào)GUS基因的表達，預示-1027至-876區(qū)間的151 bp序列正向響應ABA處理，可能存在ABA結(jié)合順式作用元件；p651U1IU2活性上調(diào)，而p309U1IU2 ABA處理前后差異不顯著，表示-876至-652區(qū)間225 bp序列負響應ABA處理，而-651至-310區(qū)間的342 bp序列對ABA無明顯的響應；p1027和pU1IU2在ABA處理下，啟動活性均呈下調(diào)趨勢，而p1027U1IU2和p651U1IU2上調(diào)，說明啟動子區(qū)的部分序列需要與前導內(nèi)含子一起形成特定的二級結(jié)構(gòu)才能正向響應ABA，且這部分序列應該是-1027至-876區(qū)間和-651至-309區(qū)間。

3 討論與結(jié)論

本研究克隆了野生木薯SuSy1基因的5′側(cè)翼序列，發(fā)現(xiàn)在其5′UTR區(qū)存在1個前導內(nèi)含子，而且該內(nèi)含子具有啟動活性，可單獨起始GUS基因的轉(zhuǎn)錄；p876U1IU2啟動活性較高，若需要提高SuSy1基因轉(zhuǎn)錄活性并保持其組織特異性，可使用p876U1IU2為啟動序列。野生木薯SuSy1基因5′側(cè)翼梯度缺失啟動子對ABA處理響應明顯，可能與啟動子中分布有較多ABA響應順式作用元件有關，如-1027至-877區(qū)間存在3個MYB元件，-876至

-652區(qū)間存在4個MYB元件和1個W-box，-651至-310區(qū)間存在3個MYB元件和2個W-box（表2）。另外，整個啟動子區(qū)廣泛分布根特異表達元件ROOTMOTIFTAPOX1，與SuSy1基因在塊根中轉(zhuǎn)錄活性高具有一致性[7]。

前導內(nèi)含子在調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄活性上功能多樣，如微管蛋白基因（Ostub16）的前導內(nèi)含子是維持其高轉(zhuǎn)錄活性所必需的[12]，馬鈴薯SuSy3基因失去前導內(nèi)含子會導致轉(zhuǎn)錄活性喪失，馬鈴薯SuSy4基因的前導內(nèi)含子缺失會對該基因的組織特異性和轉(zhuǎn)錄活性產(chǎn)生較大影響[13-14]，另有擬南芥COX5c和MHX基因的前導內(nèi)含子既可提高該基因的轉(zhuǎn)錄活性，還可促進基因mRNA翻譯為蛋白質(zhì)[15-16]。本研究中野生木薯SuSy1基因的前導內(nèi)含子缺失后，對基因轉(zhuǎn)錄活性影響不大，但前導內(nèi)含子自身的啟動活性很高，比其他梯度缺失啟動子都要高，包括p1027。由此推測，野生木薯SuSy1基因的前導內(nèi)含子并不是維持基因轉(zhuǎn)錄活性所必需的，它的功能可能與環(huán)境脅迫和激素處理條件下的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關，主要表現(xiàn)形式可能是啟動子中的特定序列可與前導內(nèi)含子形成特定的二級結(jié)構(gòu)來影響基因的轉(zhuǎn)錄，但究竟以何種形式進行轉(zhuǎn)錄調(diào)控還需進一步研究。

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