曾文丹　陸柳英　謝向譽　嚴華兵

摘 要 通過對不同優(yōu)良木薯品種體細胞胚胎及芽器官發(fā)生能力進行比較研究。結(jié)果表明，不同品種之間的體細胞胚胎和芽器官發(fā)生能力因基因型不同而差異顯著。KU 50體細胞胚發(fā)生率最高，為81.33%，其次為SC 205，誘導率為61.33%。而RYG 60未成功誘導出初生體細胞胚。誘導的體細胞胚經(jīng)循環(huán)繼代培養(yǎng)可形成次生胚狀體。將次生胚狀體轉(zhuǎn)入成熟培養(yǎng)基，經(jīng)光培養(yǎng)后可形成綠色的成熟體細胞胚，進而再生成植株。以KU 50體細胞胚萌發(fā)率最高，為42.2%。以子葉為外植體比以膨大的腋芽為外植體誘導初生體細胞胚的發(fā)生率高，除SC 205和NZ 199外，其余品種的誘導率均在85%以上。其中以新選048誘導效果最好，可達91.67%。將子葉切片置于器官發(fā)生培養(yǎng)基上可誘導不定芽的發(fā)生，誘導頻率變幅為12.3%～71.0%，其中MCol 22和新選048誘導效果較好。

關(guān)鍵詞 木薯；基因型；體細胞胚胎發(fā)生；芽器官發(fā)生；再生植株

中圖分類號 S533 文獻標識碼 A

Abstract A comparative study of the capacity of somatic embryogenesis and shoot organogenesis using different cassava cultivars was done. The results showed that there was a significant difference in the capacity of somatic embryogenesis and shoot organogenesis between different cassava cultivars due to different genotypes. Incidence of the somatic embryo of KU 50 was the highest，thatwas 81.33%； and the next was the SC 205， that was 61.33%. And the somatic embryo of RYG 60 was not induced. Secondary SE was establised in mature medium to induce green mature somatic embryogenesis and then the plants were grown after culture using light. Somatic embryo germination rate of KU 50 was the highest，that was 42.2%. Inducing rate of primary somatic embryos using the cotyledon was higher than using swollen axillary buds. Inducing ratewas over than 85% in all varieties except SC 205 and NZ 199. The inducing effect of Xinxuan 048 was the best， that was 91.67%. The formation of adventitious buds could be induced though cotyledons slice were incubated in organ culture medium and the inducing rate was between 12.3% and 71.0%； The inducing effect of MCol 22 and Xinxuan 048 was the best.

Key words Cassava； Genotype； Somatic embryogenesis； Shoot organogenesis； Plant regeneration

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.06.001

木薯（Manihot esculenta Crantz）用途廣泛，不僅是非洲地區(qū)重要的糧食作物和世界重要的工業(yè)原料，且在生物能源開發(fā)和利用中占有非常重要的地位，經(jīng)濟價值和開發(fā)應(yīng)用潛力大[1-3]。木薯遺傳背景復雜，有性子代分離嚴重，為典型的無性繁殖作物，加上生產(chǎn)周期較長，開花難、花粉育性低、自交不親和、坐果率低等因素，應(yīng)用常規(guī)育種技術(shù)難以實現(xiàn)品種的目標性狀的定向遺傳改良[4-5]?；蚬こ碳夹g(shù)是將一些重要的農(nóng)藝性狀基因（如抗病、抗蟲，產(chǎn)量和品質(zhì)等）導入目的作物，實現(xiàn)農(nóng)作物定向改良的一種快速育種手段。倪萬潮等[6]將人工合成的Cry1A基因?qū)朊藁ǎ@得了高抗棉鈴蟲的轉(zhuǎn)基因植株。Lucca等[7]采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高了水稻植株對鐵元素的生物利用率和吸收率，使大米中鐵元素含量明顯增加。與其他作物相比，木薯的生物技術(shù)起步晚，自1982年Stamp等[8]首次報道木薯體細胞胚發(fā)生以來，大多的研究主要針對非洲和南美洲的一些傳統(tǒng)品種（如TMS60444）的體細胞胚研究。我國木薯體細胞胚發(fā)生和再生植株的報道主要是集中在外植體選擇、激素和碳源種類及濃度的篩選、培養(yǎng)方式等影響因子[9-13]。對多數(shù)木薯品種誘導體細胞胚的發(fā)生能力而言，以Picloram比2，4-D誘導效率高[14]。Groll等[15]研究發(fā)現(xiàn)次級體細胞胚在含活性炭和0.1 μmol/L ABA的培養(yǎng)基上能更快速的分化和萌發(fā)；在體細胞胚成熟培養(yǎng)基中添加活性炭更有助于體細胞胚的成熟。Mathews等[16]認為體細胞胚成熟后經(jīng)脫水處理，可顯著提高體細胞胚的再生率。張鵬等[17]研究發(fā)現(xiàn)在芽器官發(fā)生培養(yǎng)基中添加AgNO3可明顯增加木薯不定芽的發(fā)生能力，增加再生芽的數(shù)量。

構(gòu)建離體再生體系是開展生物技術(shù)的基礎(chǔ)。木薯離體再生和遺傳轉(zhuǎn)化與基因型密切相關(guān)，探討不同基因型品種間的高效再生體系已成為當前木薯基因工程研究的重要課題。本研究擬采用木薯體細胞胚誘導及其植株再生培養(yǎng)技術(shù)[18-19]，分析比較優(yōu)良木薯品種間體細胞胚發(fā)生率及芽器官發(fā)生率，篩選出適宜于木薯植株再生體系構(gòu)建的優(yōu)良品種，為木薯品種基因工程改良提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以木薯品種新選048、SC 205、NZ 199、MCol 22、KU 50、R-90、RYG 60為試驗材料。材料以試管苗的形式在基本培養(yǎng)基CBM上繼代保存。CBM培養(yǎng)基成分：MS鹽及其維生素、0.5 mg/L CuSO4、2%蔗糖和0.6%瓊脂粉。pH值為5.8。繼代培養(yǎng)條件：溫度（27±1） ℃、光照時間16 h/d、光照強度1 500～2 000 lx。

1.2 方法

1.2.1 不同品種間體細胞胚發(fā)生及植株再生能力

（1）體細胞胚的誘導。選取繼代培養(yǎng)3～4周的組培苗，切去其頂芽后將帶側(cè)芽的莖段水平放置誘導芽膨大培養(yǎng)基CAM（CBM+10 mg/L 6-BA）上，采用16 h/d光照培養(yǎng)3～5 d，在體式顯微鏡下用5號針頭挑取膨大的腋芽，放置體細胞胚誘導培養(yǎng)基CIM（CBM+12 mg/L Picloram）上誘導體細胞胚。每個處理接種4個平皿，每個平皿接種芽分生組織25個，重復3次。接種后暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度（27±1） ℃，每4～5 d觀察1次，14 d后統(tǒng)計體細胞胚的誘導率及其產(chǎn)胚量。

（2）體細胞胚的繼代培養(yǎng)與次生胚狀體的形成。將誘導的初生體細胞胚從培養(yǎng)組織塊剝離，置于新鮮相同培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，誘導和擴增次生胚狀體。2～3周后繼代1次，觀察并統(tǒng)計體細胞胚增殖速率。

（3）體細胞胚的成熟與萌發(fā)。將次生體細胞胚移置成熟培養(yǎng)基CMM（CBM+0.1 mg/L 6-BA），采用光照培養(yǎng)直至子葉明顯長大并變綠。每個處理接種4個平皿，每個平皿接種25個外植體，重復3次。14 d后統(tǒng)計體細胞胚成熟率。將成熟胚轉(zhuǎn)移置CBM培養(yǎng)基上誘導萌發(fā)，30 d后統(tǒng)計成苗率。培養(yǎng)條件：溫度（27±1） ℃、光照時間16 h/d、光照強度1 500～2 000 lx。

（4）體細胞胚子葉誘導次生體細胞胚的發(fā)生。取誘導14 d后的成熟子葉為外植體，用解剖刀切成大小為0.04～0.25 cm2子葉切片，移置體細胞胚誘導培養(yǎng)基CIM上，采用暗培養(yǎng)誘導次生胚狀體。每個處理接種4個平皿，每個平皿接種外植體25個，重復3次。

1.2.2 不同品種間芽器官發(fā)生能力

（1）成熟體細胞子葉切片誘導芽器官的發(fā)生。取誘導14 d后的成熟子葉為外植體，用解剖刀切成大小為0.04～0.25 cm2子葉切片，移置芽器官發(fā)生培養(yǎng)基COM（CBM+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA+4 mg/L AgNO3）上。每個處理接種4個平皿，每個平皿接種25個外植體，重復3次。培養(yǎng)條件同誘導體細胞胚成熟。3周后觀察不定芽誘導情況。將帶有芽原基及其再生不定芽的膨大培養(yǎng)小塊轉(zhuǎn)入芽伸長培養(yǎng)基CEM（CBM+0.4 mg/L 6-BA），經(jīng)培養(yǎng)后獲得再生苗。

（2）不定芽生根培養(yǎng)。將上述再生苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基（1/2 MS+0.02 mg/L NAA+20 g/L蔗糖）中進行生根培養(yǎng)。培養(yǎng)條件同誘導體細胞胚成熟。

1.2.3 再生植株的移栽 待組培幼苗生長健壯、根系較發(fā)達，株高長至5 cm左右時，移入溫室煉苗，放置7 d左右，擰松瓶蓋，使瓶內(nèi)環(huán)境與外界相當，讓組培苗在自然狀態(tài)下馴化3～5 d后，洗凈幼苗附著的培養(yǎng)基，移植于栽培基質(zhì)（泥沙 ∶ 草炭土=1 ∶ 2）中。30 d后統(tǒng)計成活率。

1.3 統(tǒng)計與分析

所得數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0和Excel 2010軟件進行統(tǒng)計與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同木薯品種初生體細胞胚的發(fā)生及其繼代增殖

挑取膨大的芽分生組織（圖1-A），放置到體細胞胚誘導培養(yǎng)基誘導初生體細胞胚（圖1-B）的形成。由表1可知，7個木薯品種均能成功誘導愈傷組織的發(fā)生，除RYG 60外，其余木薯品種愈傷組織誘導率差異不顯著。且試驗中發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生的愈傷組織類型不同，一類為非胚性愈傷組織，其愈傷組織透明，海綿狀，結(jié)構(gòu)疏松；另一類為胚性愈傷組織，其質(zhì)地較脆。所測試品種中KU 50體細胞胚發(fā)生率最高，為81.33%，其次為木薯品種SC 205，其誘導率為61.33%。RYG 60未成功誘導體細胞胚。木薯品種新選048、MCol 22、KU 50產(chǎn)胚量顯著高于其他品種，分別為4.2、5.0、4.6個。SC 205產(chǎn)胚量低，僅為1.97個。結(jié)果表明木薯品種的基因型是決定體細胞胚胎發(fā)生的關(guān)鍵因素之一。

因隨著體細胞胚的繼代增殖，非胚性愈傷生長速度較初生體細胞胚快，需于1周內(nèi)將誘導的初生體細胞胚剝離進行繼代培養(yǎng)，誘導次生體細胞胚（圖1-C）的發(fā)生。在相同的繼代培養(yǎng)基上，胚狀體的增殖速率和形態(tài)也明顯受基因型的影響。木薯品種新選048、MCol 22、KU 50、R-90次生胚的發(fā)生率較高，在2周內(nèi)即可擴增2倍以上，而SC 205和NZ 199次生體細胞胚發(fā)生率低。不同木薯品種所誘導的胚狀體形態(tài)也各不相同（圖2）。

2.2 體細胞胚的成熟和萌發(fā)

將次生體細胞胚轉(zhuǎn)置于成熟培養(yǎng)基培養(yǎng)。14 d左右，體細胞胚明顯膨大并形成綠色成熟子葉胚（圖1-D）。由表2可見，除SC 205、NZ 199外，其余品種胚狀體成熟率均在80%以上。將成熟體細胞胚轉(zhuǎn)入CBM培養(yǎng)基誘導植株再生。其中，KU 50成苗率最高，為42.2%，SC 205成苗率最低，為6.2%。其他品種的成苗率為25%～35%。

2.3 成熟胚狀體子葉切片誘導次生體細胞胚發(fā)生

取誘導14 d的成熟子葉作為外植體，用解剖刀將其切成0.04～0.25 cm2的子葉切片（圖1-E），移置CIM培養(yǎng)基誘導次生胚狀體。培養(yǎng)5 d左右，子葉切口邊緣形成愈傷組織，繼續(xù)暗培養(yǎng)，愈傷組織邊緣形成球狀胚，最終胚狀體逐漸增多并長大（圖1-F）。由表3可知，以子葉為外植體，體細胞胚的發(fā)生率比以膨大的腋芽為外植體高。所測品種中，新選048體細胞胚發(fā)生率最高，為91.67%，產(chǎn)胚量為8.47個。MCol 22、KU 50、R-90體細胞胚發(fā)生率均在80%以上。NZ 199體細胞胚發(fā)生率最低，僅為30.33%，產(chǎn)胚量為1.67個。

2.4 成熟胚狀體子葉切片誘導芽器官發(fā)生

取誘導14 d的成熟子葉切片移置芽器官發(fā)生培養(yǎng)基誘導不定芽。光照培養(yǎng)3～5 d后，切片邊緣先形成愈傷組織，部分子葉邊緣向上卷曲，繼續(xù)培養(yǎng)10 d左右，子葉切片的切口處形成芽原基，進而發(fā)育成從生小芽（圖1-G）。由圖3可知，不同基因型品種其芽器官的發(fā)生能力存在顯著差異。其中以MCol 22和新選048子葉不定芽的發(fā)生率較高，分別為71%和62%。而NZ 199子葉不定芽的發(fā)生率僅為12.3%。

2.5 再生植株的移栽與成活

將體細胞胚萌發(fā)及芽器官發(fā)生所形成的小苗（圖1-H）轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，4～6周后形成再生植株（圖1-I）。

由圖4可知，基因型對木薯的移栽成活率也有一定程度的影響。所測試的6個品種中，新選048、MCol 22、NZ 199移栽成活率均達到80%以上，其中以MCol 22移栽成活率最高，為89.5%。R-90的移栽成活率最低，為66.4%。

3 討論

建立一套高效的植株再生及基因轉(zhuǎn)化體系是利用基因工程開展作物遺傳改良的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。木薯的離體植株再生途徑分為兩種，即器官和體細胞胚胎發(fā)生途徑。其中器官發(fā)生途徑又分為間接器官發(fā)生途徑和直接器官發(fā)生途徑[20]。本研究借鑒并優(yōu)化了張鵬等[18]和Bull等[19]的木薯體細胞胚誘導及植株再生方法，研究不同優(yōu)良木薯品種的體細胞胚直接再生途徑和子葉誘導不定芽器官發(fā)生途徑。目前，木薯體細胞胚的誘導大部分以膨大的腋芽為外植體進行體細胞胚誘導[21]。本研究發(fā)現(xiàn)部分木薯品種（如新選048）以膨大的腋芽為外植體，體細胞胚的發(fā)生率僅為40.33%，而以子葉切片為外植體，誘導率高達91.67%；此外，在顯微鏡下挑取膨大的腋芽進行體細胞胚誘導，需要豐富的經(jīng)驗和嫻熟的技術(shù)，人為因素誤差大，不宜大規(guī)模培養(yǎng)。而以子葉切片為外植體誘導體細胞胚的發(fā)生操作簡單，且誘導率高，是理想的外植體材料。

本實驗7個供試品種中，KU 50的植株再生率最高，但僅為42.2%。由此可見，木薯體細胞胚直接再生植株仍存在一定的困難。這與朱文麗等[13]的研究結(jié)果一致。因此，如何通過優(yōu)化培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件，提高木薯體細胞胚直接再生率，有待下一步的研究和完善。

初生體細胞胚的誘導和芽器官發(fā)生受基因型影響很大，雖然初生體細胞胚可以通過不同誘導條件獲得，但不同品種間的誘導率存在顯著差異[22]。Dohm等[23]選用50個月季品種進行體細胞胚誘導，結(jié)果表明僅有69%的品種成功誘導初生體細胞胚，并且不同品種間誘導率差異顯著。Pelissier等[24]和黃先群等[25]探討了不同基因型向日葵體細胞胚的發(fā)生能力，結(jié)果表明不同基因型之間的體細胞胚發(fā)生率和平均胚數(shù)差異達到極顯著水平。方佳敏等[5]和趙珊珊等[14]研究發(fā)現(xiàn)不同木薯品種之間的體細胞胚胎發(fā)生和芽器官發(fā)生能力因基因型不同而差異顯著。本實驗對7個不同木薯品種的體細胞胚和不定芽發(fā)生能力的研究表明，基因型起著關(guān)鍵作用。在體細胞胚的誘導、繼代、成熟、再生以及芽器官發(fā)生等培養(yǎng)過程中，品種間的差異明顯，特別是初生體細胞胚的誘導率其差異達到極顯著水平。以誘導彭大的腋芽為外植體時，KU 50其誘導率達到81.33%，而RYG 60的誘導率為0。以子葉為外植體時，新選048的誘導率達91.67%，而NZ 199的誘導率僅為30.33%。在不定芽發(fā)生率中，以MCol 22和新選048的誘導率分別為71.0%和62.0%。SC 205和NZ 199的發(fā)生率較低，僅為17.3%和12.3%。木薯模式品種TMS60444已建立了成熟的脆性胚性愈傷體系結(jié)合農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法，成功獲得抗木薯非洲花葉病毒、蛋白質(zhì)改良等轉(zhuǎn)基因品系。而在其他品種鮮有成功的試驗報道。因此，通過開展不同優(yōu)良木薯品種的此類研究，擴寬優(yōu)良基因型的選擇，對木薯基因育種工程具有重要意義。本試驗所試木薯品種新選048具有長勢旺、適應(yīng)性強、豐產(chǎn)性好等特點，在生產(chǎn)上具有廣泛的應(yīng)用前景。其體細胞胚誘導和芽器官再生能力都較強，是開展國內(nèi)木薯轉(zhuǎn)基因育種、誘變育種的理想材料。木薯品種KU 50和SC 205體細胞胚發(fā)生能力較強，可通過對培養(yǎng)基等條件的優(yōu)化提高其器官發(fā)生能力，也可作為下一步遺傳轉(zhuǎn)化品種的優(yōu)選品種。

參考文獻

[1] 李開綿， 林 雄， 黃 潔. 國內(nèi)外木薯科研發(fā)展概況[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學， 2001， 21（1）： 56-60.

[2] 張 鵬， 楊 俊， 周文智， 等. 能源木薯高淀粉抗逆分子育種研究進展與展望[J]. 生命科學， 2014， 24（5）： 465-472.

[3] 馮 獻， 徐明冉， 詹 玲， 等. 木薯生物燃料產(chǎn)業(yè)化研究述評[J]. 中國農(nóng)學通報， 2010， 26（10）： 375-380.

[4] Yan H B， Lu L Y， Hershey C， et al. Cassava mutation breeding： current status and trends[J]. Plant Mutation Reports， 2013， 3 （1）： 37-44.

[5] 方佳敏， 劉 佳， 唐克軒， 等. 根癌農(nóng)桿菌介導的木薯遺傳轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化[J]. 熱帶作物學報， 2011， 32（9）： 1 697-1 703.

[6] 倪萬潮， 張震林， 郭三堆. 轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的培育[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學， 1998， 31（2）： 8-13.

[7] Lucca P， Hurrell R， Potrykus I. Fighting iron deficiency anemia with irom-rich rice[J]. Journal of the American College of Nutrition， 2002， 21（3）： 184-190.

[8] Stamp J A， Henshaw G G. Somatic embryogenesis in cassava[J]. Zeitschrift Fur Planzenphysiologe， 1982， 105： 183-187.

[9] Li H Q， Guo J Y， Huang Y W， et al. Regeneration of cassava plants via shoot organogenesis[J]. Plant Cell Reports， 1998， 17： 410-414.

[10] 李洪清， 李美茹， 梁承鄴. 幾種影響木薯芽器官發(fā)生及植株再生的因素[J]. 植物生理學通訊， 2000a， 36（4）： 297-299.

[11] Zhang P， Phansiri S， Puonti-Kaerlas J. Improvement of cassava shoot organogenesis by the use of silver nitrate[J]. Plant Cell， Tissue and Organ Culture， 2001， 67（1）： 47-54.

[12] Ma G H， Xu Q S. Induction of somatic embryogenesis and adventitious shoots from immature leaves of cassava[J]. Plant Cell， Tissue and Organ Culture， 2002， 70： 281-288.

[13] 朱文麗， 莫 饒， 李開綿， 等. 激素對木薯體細胞胚胎發(fā)生與植株再生的影響[J]. 熱帶作物學報， 2010， 31（4）： 621-625.

[14] 趙姍姍， 李海霞， 劉 佳， 等. 我國主要栽培木薯品種體細胞胚胎發(fā)生與芽器官發(fā)生的研究[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報， 2010， 18（1）： 37-44.

[15] Groll J， Gray V M， Mycock D J. Development of cassava（Manihotesculenta Crantz） somatic embryos during culture with abscisic acid and activated charcoal[J]. Journal of Plant Physiology， 2002， 159（4）： 437-443.

[16] Mathews H， Schopke C， Carcamo R， et al. Improvement of somatic embryogenesis and plant recovery in cassava[J]. Plant Cell Reports， 1993， 12（6）： 328-333.

[17] 張 鵬， 傅愛根， 王愛國. AgNO3在植物離體培養(yǎng)中的作用及可能的機制[J]. 植物生理學通訊， 1997， 33（5）： 376-379.

[18] Zhang P， Gruissem W. Production of transgenic cassava（Manihot esculenta Crantz）[C]// Transgenic Crops of the World-Essential Protocols， 2004： 301-319.

[19] Bull S E， Owiti J A， Niklaus M， et al. Agrobacterium-mediated transformation of friable embryogenic calli and regeneration of transgenic cassava[J]. Nat Protoc， 2009（4）： 1 845-1 854.

[20] 康冬鴿， 李瑞梅， 胡新文， 等. 木薯的再生體系和基因轉(zhuǎn)化方法[J]. 基因組學與應(yīng)用生物學， 2009， 28（3）： 619-624.

[21] Rossin C B， Rey M E. Effect of explant source and auxins on somatic embryogenesis of selected cassava（Manihot esculenta Crantz）cultivars[J]. South African Journal of Botany， 2011， 77： 59-65.

[22] Hsia C N， Korban S S. Organogenesis and somatic embryogenesis in callus cultures of Rosa hybrid and Rosa chinensisminima[J]. Plant Cell， Tissue and Organ Culture， 1996， 44： 1-6.

[23] Dohm A， Ludwig C， Nehring K， et al. Somatic embryogenesis in roses[J]. Actahorticulturae， 2001， 547： 341-348.

[24] Pelissier B， Bouchefra O， Pepin R. Production of isolated somatic embryos from sunflower thin cell layers[J]. Plant Cell Report， 1990， 9： 47-50.

[25]黃先群， Genzbitelle L， Alibert B， 等. 向日葵下胚軸體細胞胚發(fā)生的基因型效應(yīng)[J]. 中國油料作物學報， 2006， 28（4）： 412-417.