范春節(jié) 姚海榮 曾炳山 王勝坤 郭光生 覃偉權

摘 要 桉樹青枯病的發(fā)生由于影響因素較多導致其人工接種重復性差，因此需要獲得穩(wěn)定的青枯病感染，同時在此基礎上可以進行桉樹苗期青枯病的防治研究。在本研究中采用水培后傷新根和袋苗未經(jīng)水培直接傷根后轉(zhuǎn)移到青枯菌液中浸泡6、12、18、24 h后移植，調(diào)查桉樹幼苗青枯病發(fā)病率和生長狀況，同時通過在接種前噴施不同濃度的BR、MeJA、SA 3種激素，誘導桉樹抵抗青枯菌侵染，調(diào)查處理后苗木死亡率。結果表明，未經(jīng)過水培直接傷根移植的苗木更容易感染青枯菌，經(jīng)過24 h菌液浸泡處理后的幼苗的死亡率，達到86.67%，同時發(fā)現(xiàn)SA對緩解桉樹青枯病的發(fā)病有明顯的作用，且在噴施濃度為0.001 mmol時使用，青枯菌侵染的植株仍有75.0%的存活率。本研究獲得了桉樹幼苗穩(wěn)定感染青枯病的一種方式，為室內(nèi)研究桉樹幼苗感染青枯病的機制奠定基礎，同時獲得了降低桉樹青枯病發(fā)生的處理方式，為桉樹苗期青枯病的防治提供一種方案。

關鍵詞 巨桉；桉樹青枯病；青枯雷爾氏菌

中圖分類號 S763.7 文獻標識碼 A

Abstract To study the mechanism of denfending Eucalyptus bacterial wilt， obtaining an efficient inoculation method for Ralstonia solanacearum on Eucalyptus was necessary owing to its scarce and low replicability. On the basis of this， different concentrations of BR， MeJA and SA treatments were used to improve Eucalyptus resistance for R. solanacearum. In this study， immersion of wounded roots by water culture and soil culture in bacterial cell suspension 6 hours， 12 hours， 18 hours and 24 hours were tested. The plants wounded roots by soil culture in bacterial cell suspension 24 hours were proved to be the most efficient for inoculating Eucalyptus with R. solanacearum and the rate of death reached the highest for 86.67%. Meanwhile， it was found that SA treatments increased defence to R. solanacearum individually. Moreover， SA significantly increased the rate of survive by full coverage foliage spray before plants inoculated with R. solanacearum， which 0.001 mmol SA treatment gained the major improvement for 75.0% survival. This study developed an effective protocol for inoculation of R. solanacearum， which based for further investigated the mechanism of R. solanacearum infect Eucalyptus and supplied a method for affect against Eucalyptus bacterial wilt.

Key words Eucalyptus grandis； Eucalyptus bacterial wilt； Ralstonia solanacearum

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.08.017

桉樹青枯病是危害桉樹生產(chǎn)的主要病害之一，其病原為青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum Smith），在土壤中通過根部自然孔口或傷口侵入，然后沿輸導組織大量繁殖導致維管束輸導組織堵塞，水分及營養(yǎng)運輸困難。其外觀表現(xiàn)特征為生長勢弱、葉片枯萎但仍保持青色，后期葉片脫落整株枯萎死亡。桉樹青枯菌侵染的部位出現(xiàn)變褐壞死、根系腐爛變黑且壞死的根莖有發(fā)酵味，橫切后經(jīng)保濕數(shù)分鐘出現(xiàn)黃褐色或乳白色細菌溢膿[1-2]。桉樹青枯病發(fā)生受栽培條件、土壤養(yǎng)分、氣象因子、樹種等多種因素影響。如土壤養(yǎng)分不足，且栽培過易感的煙草、番茄等或曾發(fā)生過青枯病流行的區(qū)域更易發(fā)生，尤其是對于中國大面積推廣單一的尾葉桉、巨尾桉、巨桉無性系更易發(fā)生大面積的青枯病危害[3]。在高溫多雨的6～8月為發(fā)病高峰期，9～10月為病樹枯死期，尤其是經(jīng)歷臺風后的桉樹無性系林，其青枯病危害更為嚴重[4]。

盡管目前開展了一些桉樹青枯菌感病機制的相關研究[5-6]，由于青枯菌對桉樹根的吸附及發(fā)病影響因素較多[7-8]，在試驗中常發(fā)現(xiàn)桉樹青枯病的發(fā)病存在著不確定性。常采用剪頂包扎菌液法、傷根淋灌菌液法、WFT培養(yǎng)接種法在接種后常發(fā)現(xiàn)沒有出現(xiàn)發(fā)病現(xiàn)象，這成為室內(nèi)或苗圃研究桉樹青枯病的侵染機制和機理的限制性因素。因此建立起穩(wěn)定的侵染和感病方法顯得尤為重要。在進行桉樹青枯病防治中，國內(nèi)外開展了大量的研究，主要采用生化試劑[9]、菌根[10-11]、拮抗細菌防治[12]、誘導性激素[13-15]等方法。而水楊酸（Salicylic acid，SA）、油菜素內(nèi)酯（Brassinolide，BR）、茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）等生長調(diào)節(jié)劑是應對生物脅迫及非生物脅迫反應的重要信號分子，能誘導多種植物對生物和非生物脅迫產(chǎn)生持續(xù)抗性，減緩植物對包括病原菌侵染等多種逆境脅迫的傷害[16-19]。尤其是水楊酸在早期的研究中通過灌根或根部浸泡等方式發(fā)現(xiàn)其對緩解桉樹青枯病的發(fā)生有一定的作用[13-15]，值得注意的是這些操作方法在苗圃大規(guī)模育苗過程中操作難度大，難以真正實現(xiàn)。而油菜素內(nèi)酯和茉莉酸甲酯等激素尚未開展相關研究。

在本研究通過使用水培和土培2種方式接種桉樹青枯菌，研究其不同的侵染時間對桉樹感染青枯菌的影響，以期獲得穩(wěn)定的青枯菌侵染和發(fā)病。同時直接將不同濃度的水楊酸、油菜素內(nèi)酯、茉莉酸甲酯噴施到葉片，研究其對緩解桉樹青枯病發(fā)病的影響，篩選出合適的激素以及濃度，為進一步苗期桉樹青枯病的防治應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所需材料以巨桉（E. grandis）無性系GL1組培苗為材料，由中國林業(yè)科學研究院熱帶林業(yè)研究所繁育中心保存。將組培生根苗移植到苗圃3個月，以黃心土為基質(zhì)，待其高度為20～30 cm，取生長良好的植株進行試驗。

1.2 方法

1.2.1 青枯菌菌株分離與培養(yǎng) 感染青枯病的植株2015年7月9日采集于廣東省惠州市惠東縣。在野外觀察發(fā)現(xiàn)，發(fā)病植株癥狀為整株植物枯死，葉片為青色，葉片不脫落，截斷15 min后出現(xiàn)乳白色細菌溢膿（圖1-A和圖1-B），具有典型的青枯菌感染癥狀。取回2 m長樹干后，進行青枯菌分離和鑒定。使用單面刀片切取木質(zhì)部進行病原菌分離，采用稀釋分離法培養(yǎng)于2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）培養(yǎng)基平板上，分離出菌落為圓形、乳白色、中間隆起、液化、具光澤（圖1-C），具有典型的青枯菌菌株特征。純化的菌株采用無菌水在4 ℃下保存。接種的菌株在TTC培養(yǎng)基上培養(yǎng)，30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，配置成濃度為3×108 CFU/mL的菌液備用。

1.2.2 侵染與處理 對于水培后侵染的植株，首先洗去黃心土，然后水培培養(yǎng)14 d，長出大量新根后作為試驗材料進行處理，測量苗高。使用雙面刀片進行傷根處理，將新根劃傷后放置在菌液中6、12、18、24 h后，移植到營養(yǎng)盆中，栽培基質(zhì)選用泥炭土，為防止土壤中其他微生物對青枯菌感染的影響，所用的泥炭土采用121 ℃、0.1 Mpa滅菌30 min處理，以下處理與之相同。未經(jīng)水培處理的植株，將根清洗干凈后后直接放入到青枯菌菌液中6、12、18、24 h后移植到營養(yǎng)盆中，栽培基質(zhì)選用泥炭土。1個月后統(tǒng)計死亡率和苗高。

1.2.3 桉樹青枯菌PCR驗證 DNA提取和PCR檢測方法采用王勝坤等[20]的方法，以16S rRNA為靶基因的青枯菌特異性引物序列OLI1/Y2， 由上海生工生物工程有限公司合成。序列如下：上游引物OLI1：5′-GGGGGTAGCTTGCTACCTGCC-3′、下游引物Y2：5′-CCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3′，擴增片斷長度為288 bp。

1.2.4 BR、MeJA、SA的施用 試驗用BR、MeJA、SA母液購自Sigma-Aldrich，用無水乙醇配制成母液，根據(jù)濃度所需使用無菌水稀釋到所需濃度，營養(yǎng)液和噴施液的乙醇終濃度控制在0.1%（V/V）。對照采取施用相同濃度的乙醇溶液。采用濃度分別為0、0.001、0.01、0.05、0.1、0.25 mmol的24-epiBR、MeJA、SA噴施整株桉樹，2 d后將植株進行浸根24 h處理，每個處理重復3次，每個重復10株。以未噴施激素植株接種病原菌植株作為對照。1個月后統(tǒng)計成活率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

死亡率、抽高率和成活率經(jīng)過反正弦轉(zhuǎn)換后進行分析，其中抽高率=（1個月后苗高-原苗高）/原苗高×100%。顯著性分析采用Sigmaplot進行統(tǒng)計分析，使用One-way ANOVE方法進行多重比較分析，p≤0.10為顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 不同處理方式對青枯病染菌的影響

結果表明，使用水培和土培的植株浸泡青枯菌菌液時，浸泡時間對桉樹感染青枯菌起到顯著性影響。且都是隨著時間的增加，桉樹苗木死亡率逐漸增加。在浸泡24 h時，水培和土培植株的死亡率分別達26.67%和86.67%（圖2-A）。而對土培植株進行處理時，6～18 h處理之間并沒有顯著性差異。值得注意的是使用水培植株在菌液中浸泡6 h時，與對照相比并沒有顯著性差異，只有在12～24 h達到顯著。說明從根接觸到菌液到青枯菌進入到桉樹根維管組織中需要一定的時間。同時發(fā)現(xiàn)，直接使用土培植株的死亡率高于使用水培植株。土培植株在浸泡6 h時植株死亡率已達到53.33%，遠高于采用水培植株浸泡青枯菌菌液導致的最高值?？赡苁怯捎谠谇謇硗僚嘀仓甑母鶗r，會對根造成更大的傷害，使得青枯菌易于吸附和進入桉樹根細胞內(nèi)。而在水培植株中主要是幼嫩的新根，幼根中未形成完整的輸導組織，不利于青枯菌的吸附和運輸，說明新根可能并不是青枯菌浸染的主要途徑。同時對不同處理時間的水培苗和土培苗生長高度進行測量，發(fā)現(xiàn)水培苗和土培苗的生長高度并未受到顯著性的影響，可能是由于生長時間的原因。盡管如此，仍然可以看到采用土培苗經(jīng)過24 h泡菌處理中，抽高率僅為45.42%，低于對照54.01%（圖2-B）。可能是在24 h浸泡處理時，青枯菌菌株已經(jīng)進入桉樹體內(nèi)，但并未致死，從而導致桉樹的生長受到抑制；也可能是由于長時間菌液浸泡對桉樹的根產(chǎn)生了一定的傷害。

2.2 桉樹青枯病染菌的確定

為了進一步確認死亡植株是否感染青枯菌菌株，通過取莖部木質(zhì)部組織，進行病原菌的再分離，結果發(fā)現(xiàn)死亡植株莖部能夠重新分離出青枯菌菌株，且菌落具有明顯的青枯菌的生長特征（圖3-A），而對照組并未分離出青枯菌菌株。進一步通過PCR驗證，如圖3-B所示，能夠擴增出青枯菌的特異性條帶，說明確實是青枯菌的感染導致。

2.3 激素處理對緩解青枯病的作用

通過對不同激素預處理苗木，然后進行菌液浸根接種。由圖4可以看出，SA、BR、MeJA都能在不同程度上緩解青枯菌引起的桉樹苗木死亡。其中SA對緩解桉樹青枯菌的發(fā)生起到顯著性的影響，在所有濃度處理的SA都能提高桉樹對青枯菌的抗性，尤其是在噴施0.001和0.01 mmol SA處理時，桉樹苗木存活率分別達到75.00%和71.17%，遠超過未進行處理的對照植株的25.0%，而隨著濃度的升高，存活率反而下降，說明合適的SA處理濃度為0.001～0.01 mmol。同時在噴施0.01和0.10 mmol的BR對緩解桉樹青枯病的發(fā)生起到顯著性的抑制。在此濃度下桉樹獲得了超過50.0%的存活率。盡管如此，在0.001和0.25 mmol時外施BR并不能顯著的提高桉樹的存活率，說明BR的濃度對于緩解青枯病的發(fā)生非常重要。而在0.01和0.10 mmol濃度MeJA處理時，對于緩解桉樹青枯病的發(fā)生也起到顯著的效果，其中在施加0.10 mmol的MeJA時桉樹苗木存活率達到58.33%。這些結果表明，SA、BR和MeJA的處理都能顯著性的提高桉樹對青枯病的抗性，其中SA的效果最明顯，在所有的處理中，桉樹苗木存活率都超過了50.0%。而MeJA和BR處理在一定程度上可以緩解桉樹青枯病的危害，但需要篩選出合適的濃度。在濃度較低或較高時都難以達到預期的效果，如在0.001 mmol濃度的BR處理時，桉樹存活率只有35.0%，與對照相比并沒有達到顯著性差異。這些結果說明不同的激素在誘導桉樹抵御青枯菌侵入有特定的濃度響應機制。

3 討論與結論

通過不同的侵染處理獲得了青枯菌有效的侵染方式，土培植株清洗干凈的根經(jīng)過24 h浸泡會導致86.67%的桉樹植株感染青枯病死亡，為研究桉樹青枯菌的侵染機制奠定基礎。本研究中發(fā)現(xiàn)直接接種青枯病浸染率較高，可能是由于在直接接種過程中清洗根時會導致較多的根出現(xiàn)傷口。在國內(nèi)研究中多采用水培處理方法進行相關研究[21]，水培法操作簡單，易觀察到苗木發(fā)病。但水培法由于無法完整的模擬野外青枯病感染方式，同時青枯菌的吸附侵入受溫度、pH值、菌液濃度、菌種活力以及胞外多糖和脂多糖等內(nèi)外多種因素的影響[7-8]。因此在試驗中發(fā)現(xiàn)多種處理條件下青枯病發(fā)病不穩(wěn)定等現(xiàn)象。而在使用澆灌土壤、傷根侵染和注射菌液到莖基部進行測試青枯菌對桉樹的侵染，發(fā)現(xiàn)注射法接種效果最明顯，大多數(shù)植株和無性系出現(xiàn)典型的青枯病癥狀[22]。在本研究中發(fā)現(xiàn)直接進行移植的植株，在24 h侵染后獲得最好的效果，可能是在去除根部土壤過程中對根的傷害更多，為青枯菌進入桉樹維管束提供了更多的條件，同時說明青枯菌吸附到桉樹根部以及青枯菌進入桉樹根細胞內(nèi)需要一定的時間。

在本研究中，通過施用不同濃度的激素誘導植物抗病性，發(fā)現(xiàn)不同的BR、MeJA、SA對降低青枯病的死亡率具有不同的作用。SA的作用最明顯。在對尾葉桉幼苗SA淋根處理中也發(fā)現(xiàn)1～5 mmol水楊酸能明顯緩解其青枯菌的傷害[14-15]，而采用浸泡方式進行處理發(fā)現(xiàn)0.5 mmol的SA能夠明顯抑制桉樹幼苗發(fā)病率，而且在進一步的研究中證實這種抑制桉樹幼苗青枯病發(fā)病率是通過誘導作用而不是直接抑制或毒殺細菌[13]。本研究中發(fā)現(xiàn)通過噴施低濃度的SA（0.001～0.01 mmol）就能夠緩解青枯菌的侵染。同時在前期發(fā)現(xiàn)高濃度水楊酸的浸泡對桉樹苗有毒害作用[15]，因此在生產(chǎn)中使用噴施法可更加有效預防桉樹幼苗青枯病的發(fā)生，尤其是預防苗圃青枯病的發(fā)生和流行。同時在本研究中發(fā)現(xiàn)BR和MeJA對桉樹青枯病的緩解作用有限，但仍能夠起到一定的作用，鑒于其作用的機制與SA處理誘導植物的抗性機制不同，因此可以在使用SA處理時，同時施加特定濃度的BR和MeJA，可能對于緩解桉樹青枯病的發(fā)生有更好的作用。

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