詹嘉紅

摘 要 以愈創(chuàng)木酚為底物，采用分光光度法對楊桃果實過氧化物酶（POD）的酶學特性進行研究。結果表明，楊桃POD反應時間不宜超過3.5 min，最適pH為 5.6，最適溫度為30 ℃，100 ℃處理 30 s 后 POD 活性完全喪失。POD催化的酶促褐變反應動力學符合米氏方程，動力學參數(shù)Km=1.68×10-2 mol/L，Vmax=15.267 U/min，相應的動力學方程為v=15.267[S]/（0.0168+[S]）（U/min）。抑制劑對 POD活性的抑制效果從大到小依次為抗壞血酸>L-半胱氨酸>亞硫酸氫鈉>檸檬酸。本研究可為楊桃保鮮貯藏和深加工過程中的酶促褐變控制提供理論參考。

關鍵詞 楊桃；過氧化物酶；酶學特性；抑制劑

中圖分類號 TS201.5 文獻標識碼 A

Abstract With spectrophotometry method and based on substrate of guaiacol， the enzymatic characteristics of peroxidase（POD） from Averrhoa carambola fruit were investigated. The results showed that the reaction time for POD should not exceed 3.5 min， the optimum pH and temperature of POD were 5.6 and 30 ℃， respectively. The POD activity was completely inactivated when it was incubated at 100 ℃ for 30 s. The reaction kinetic of enzymatic browning was accordant with Michaelis-Menten equation. The Km， Vmax and kinetic Equation were 1.68×10-2 mol/L，15.267 U/min and v=15.267[S]/（0.0168+[S]）（U/min）， respectively. Four inhibitors demonstrated different effects on POD activity，and their inhibitory capacity was decreased in the order：ascorbic acid>L-cysteine>NaHSO3> citric acid. This research aimed to provide reference and theoretical basis to protect Averrhoa carambola fruit from enzymatic browning in the course of processing and storage.

Key words Averrhoa carambola；Peroxidase；Enzymatic characteristics；Inhibitor

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.08.008

楊桃（Averrhoa carambola Linn.），又稱陽桃、五斂子、洋桃等，屬酢醬草科五斂子屬，是一種熱帶亞熱帶常綠喬木或灌木果樹，其果實也是中國南方重要的熱帶水果之一。楊桃果脆汁多、甜酸可口，其深加工產(chǎn)品有楊桃飲料、楊桃罐頭、楊桃蜜餞等。楊桃果實營養(yǎng)豐富，其富含的多酚物質具有抗腫瘤、抗氧化和抗動脈硬化等多種生理功能[1]。然而，楊桃鮮果在貯藏、運輸和加工過程中極易產(chǎn)生酶促褐變現(xiàn)象，嚴重影響其食用品質和商品價值。前人的研究表明，水果中的多酚氧化酶（POD）和過氧化物酶（POD）參與下的酶促反應是果實褐變的主要原因：果實中的酚類化合物在PPO和POD的催化條件下進行氧化還原反應而醌式化，再通過一系列的反應而聚合成黑色素[2]，從而導致果實褐變，如橄欖[3]、荔枝[4]、枇杷[5]等的褐變均與自身存在的這些酚酶密切相關。目前有關楊桃的褐變與其PPO的關系研究已有一些報道[6-7]，但針對楊桃POD活性及其與褐變關系的研究則鮮見報道。本試驗通過對楊桃鮮果中POD 的部分酶學特性進行探討，以期為楊桃保鮮貯藏和深加工過程中的酶促褐變控制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為紅種甜楊桃，購自當?shù)毓麍?。愈?chuàng)木酚、30%過氧化氫、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、檸檬酸、亞硫酸氫鈉、抗壞血酸、L-半胱氨酸等為分析純。

FA2004電子天平（上海精密科學儀器有限公司天平儀器廠）；UV2100型紫外可見分光光度計（尤尼柯（上海）儀器有限公司）；JJ-2組織搗碎勻漿機（富華儀器有限公司）；GL-16G-Ⅱ型高速冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠）；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市友聯(lián)儀器研究所）；PHS-2C型精密酸度計（上海雷磁儀器廠）等。

1.2 方法

1.2.1 楊桃POD粗酶液的提取 稱取楊桃果肉25 g，先加適量4 ℃預冷的磷酸鹽緩沖溶液（0.05 mol/L，pH5.8），低溫研磨至勻漿，并定容至50 mL，放于4 ℃下的冰箱里浸提30 min后，將勻漿液以10 000 r/min轉速在4 ℃下離心20 min，上清液即為酶的粗提液，低溫保存用于酶活性分析。

1.2.2 楊桃POD活性測定 參考李合生[8]的愈創(chuàng)木酚法，略有改進。吸取 0.05 mol/L pH5.8磷酸緩沖液2.25 mL，加入0.05 mol/L愈創(chuàng)木酚2.0 mL，加入2% H2O2 0.25 mL，再加入0.5 mL粗酶液后迅速搖勻啟動反應，于室溫下測定波長470 nm的OD值，對照以緩沖液代替酶液。

1.2.3 反應時間對POD活性的影響 按照1.2.2 的測定方法，總反應體系分別反應 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5 min，測其吸光值。

1.2.4 pH對POD活性的影響 配制pH值分別為2.2、2.6、3.0、3.4、3.8、4.2、4.6、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.2、6.6、7.0、7.4、8.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液。按1.2.2的方法，在室溫下測定不同pH值下的吸光值。

1.2.5 反應溫度對POD活性的影響 按1.2.2方法建立反應體系，分別于5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65 ℃下預先保溫10 min，再加入0.5 mL粗酶液，振蕩后在原溫度條件下繼續(xù)保溫3 min，然后測定吸光值

1.2.6 POD的熱穩(wěn)定性研究 取等量酶液若干份，在100 ℃水浴中分別熱燙5、10、15、20、25、30 s，取出后迅速冷卻，按1.2.2的方法測定不同熱燙時間的吸光值。

1.2.7 底物濃度對POD活性的影響 分別配制濃度為0.005、0.01、0.02 、0.05、0.1、0.15 mol/L的愈創(chuàng)木酚溶液為底物，按照 1.2.2 的測定方法，測其在最適溫度、最適pH值及酶液濃度保持固定條件下的吸光值，計算酶活性。以每分鐘吸光度變化0.01為1個酶活性單位（以U/min表示）。

1.2.8 抑制劑對POD活性的影響 探討抗壞血酸（0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L）、亞硫酸氫鈉（0、20、40、60、80、100 mmol/L）、L-半胱氨酸（0、2、4、6、8、10 mmol/L）和檸檬酸（0、50、150、250、350、450 mmol/L）等抑制劑對POD活性的抑制作用，按1.2.2的方法，向反應體系分別加入各種濃度的抑制劑0.5 mL，緩沖液的量相應減少0.5 mL，在室溫下測定不同抑制劑作用下的吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均取3次重復平均值，采用Microsoft Excel進行數(shù)據(jù)分析。

2 結果與分析

2.1 楊桃POD反應進程曲線

由圖1可見，在反應初期，即3.5 min內(nèi)，隨著反應的進行，OD值（即產(chǎn)物生成量）幾乎成直線上升，即在這一時間段，酶促反應速率基本保持不變。因此，本實驗確定酶促反應時間以不超過3.5 min為宜。

2.2 pH對楊桃POD活性的影響

由圖2可見，該酶在pH值為5.6時，酶活性最高，表明該酶的最適pH值為5.6，當pH值為2.2和8.0時，POD活性分別為最大時的29.7%和55.9%。

2.3 溫度對楊桃POD活性的影響

由圖3可以看出，溫度與楊桃POD活性的關系曲線為較典型的鐘形曲線，在30 ℃以下酶活性隨著溫度的升高而升高，當溫度達到30 ℃時，吸光度出現(xiàn)峰值，酶活性達到最高，當溫度超過30 ℃，酶活性隨著溫度的升高而降低。當溫度達到65 ℃時，POD殘留的相對活性降至10.3%，而在5 ℃時，POD的相對活性是27.0%。因此，30 ℃為該酶的最適溫度。

2.4 楊桃POD熱穩(wěn)定性

由圖4可知，隨著處理時間的增加，POD活性迅速下降。當處理20 s后，殘存活性僅剩下38.1%，而處理30 s后，酶活性已很微弱。

2.5 底物濃度對楊桃POD活性的影響

由圖5可以看出，在底物濃度較低時（<0.01 mol/L），反應速率與底物濃度的關系幾乎呈斜率大于零的線性關系；隨著底物濃度增大，反應速率依然升高，但由于酶的數(shù)量有限，反應速率與底物濃度的關系不再是線性關系；當?shù)孜餄舛认喈敻邥r（>0.1 mol/L），酶促反應速率與底物濃度無關，反應達到最大反應速率[9]。

由Lineweaver-Burk方程1/v=Km/Vmax×1/[S]+1/Vmax，作出1/v對1/[S]的雙倒數(shù)圖（圖6），得直線方程y=0.001 1x + 0.065 5，根據(jù)直線斜率和截矩求得該反應的米氏常數(shù)Km=1.68×10-2 mol/L，最大反應速率Vmax=15.267 U/min，相應的動力學方程為v=15.267[S]/（0.016 8+[S]）（U/min），其中擬合直線相關系數(shù)達到0.999，可見楊桃POD的酶促反應動力學符合米氏方程。

2.6 抑制劑對楊桃POD活性的影響

由圖7可見，隨著抗壞血酸濃度增加抑制效果明顯增強，當抗壞血酸濃度為1.0 mmol/L時，POD受抑制程度為66.8%；當濃度為2.5 mmol/L時，酶活性幾乎被完全抑制。

由圖8可知，當亞硫酸氫鈉濃度小于40 mmol/L時，POD酶活性被抑制的效果較弱，當濃度大于40 mmol/L時，隨著亞硫酸氫鈉濃度增加抑制效果顯著提高，當濃度為100 mmol/L，酶活性受抑制程度高達95.0%。

由圖9可見，當L-半胱氨酸濃度小于6 mmol/L時，隨著濃度的升高，其抑制效應逐漸增強。當濃度從6 mmol/L增加到10 mmol/L時，抑制作用增強不明顯，酶活性受抑制程度僅從79.0%增至87.5%。

圖10顯示，楊桃中POD 活性抑制需要使用較高濃度檸檬酸溶液，當檸檬酸濃度為150 mmol/L時，其受抑制程度為45.2%；當濃度為450 mmol/L時，其受抑制程度達到91.9%。

根據(jù)上述研究結果，以較低的抑制劑濃度呈現(xiàn)的最佳抑制效應分析，抗壞血酸的抑制效果最佳，其次是L-半胱氨酸，再次是亞硫酸氫鈉，檸檬酸抑制效果最差。

3 討論與結論

POD廣泛存在于動物、植物和微生物體內(nèi)，是一類以血紅素為輔基的氧化還原酶，在 H2O2存在下，它能催化酚類、類黃酮的氧化和聚合，從而導致組織褐變。POD活性受pH、溫度、底物濃度、抑制劑等因素的影響。楊桃果實POD有較廣泛的pH范圍，最適pH值為5.6，與甘薯葉[10]的最適pH一致，略高于枇杷果肉[11]POD的最適pH（5.0），在pH2.2～8.0之間，楊桃果實POD活性保持在30%以上，說明耐受范圍較廣。此外，本研究結果表明，楊桃果實POD的最適溫度為30 ℃，與香蕉果皮[12]、草莓[13]的最適溫度一致，略低于雪蓮果[14]和香蕉果實[15]的最適溫度（均為35 ℃）。POD是一種非常耐熱的酶，在果蔬加工中常被用作熱處理是否充分的指標[16]。大蕉的POD具有良好的熱穩(wěn)定性，100 ℃下加熱 30 min殘存活性還保持18.28%[17]，龍眼果肉中POD在100 ℃水浴處理7 min即完全失活[18]，相比之下楊桃果實POD對熱敏感，經(jīng)沸水浴30 s處理酶活則被鈍化。對于酶促褐變來說，在適宜溫度下，反應酶活越強，則酶促褐變程度越高，因此在實際操作中，可通過短時間高溫滅酶來抑制楊桃果實酶促褐變。

在POD活性測定系統(tǒng)中，以愈創(chuàng)木酚為底物的楊桃果實POD的Km值為1.68×10-2 mol/L，這比梅州金柚[19]POD的Km（8.74 mmol/L）值大，但比富士蘋果[20]POD的Km（129.09 mmol/L）值小很多，米氏常數(shù)（Km）是酶的一個特征性常數(shù)，Km值可近似地表示酶與底物之間的親和程度。說明楊桃果實POD氧化酚類物質的能力比梅州金柚POD的氧化能力弱，但比富士蘋果POD的氧化能力強很多。

抗壞血酸、亞硫酸氫鈉、L-半胱氨酸和檸檬酸均能有效抑制楊桃果實POD活性，但抗壞血酸抑制楊桃果實POD活性的效果最佳，當抗壞血酸濃度為2.5 mmol/L時，酶活性幾乎為零。雖然抗壞血酸抑制效果好、安全性高，但若添加量過大時，也易引起非酶褐變。目前，在果蔬防褐處理中，提倡多種抑制劑結合使用以提高抗褐變效果。因此，在單因素抑制劑研究的基礎上，對不同抑制劑多因素協(xié)同作用的抑制效應今后還有待進一步深入研究。

參考文獻

[1] 馮 麗， 宋曙輝， 趙 霖， 等. 植物多酚種類及其生理功能的研究進展[J]. 江西農(nóng)業(yè)學報， 2007， 19（10）： 105-107.

[2] Montgomery M W， Sgarbieri V C. Isoenzymes of banana polyphenol oxidase[J]. Phytochemistry， 1975， 14（4）： 1 245-1 249.

[3] 謝 倩， 陳清西， 王 威，等. 橄欖果實過氧化物酶和多酚氧化酶酶學特性研究[J]. 熱帶作物學報， 2013， 34（8）： 1 519-1 524.

[4] 龐學群， 段學武， 張昭其，等. 荔枝過氧化物酶的純化及部分酶學性質研究[J]. 熱帶亞熱帶植物學報， 2004， 12（5）： 449-454.

[5] Ding C K， Chachin K， Ueda Y， et al. Inhibition of loquat enzymatic browning by sulfhydryl compounds[J]. Food Chemistry， 2002， 76： 213-218.

[6] 楊昌鵬， 胡艷妮， 陳智理，等. 楊桃多酚氧化酶的部分純化及其特性研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2010， 36（1）： 34-38.

[7] 胡艷妮， 楊昌鵬， 黃衛(wèi)萍，等. 楊桃若干品種及貯藏期間多酚氧化酶活性的變化[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學， 2008， 36（3）： 884-886.

[8] 李合生. 植物生理生化實驗原理和技術[M]. 北京： 高等教育出版社， 2003： 164-165.

[9] 張麗萍， 楊建雄. 生物化學簡明教程（第4版）[M]. 北京： 高等教育出版社， 2009： 159-160.

[10] 付偉麗， 唐靚婷， 王 松，等. 甘薯葉過氧化物酶的分離純化及其部分性質研究[J]. 食品科學， 2010， 31（7）： 223-227.

[11] 林建城， 吳智雄，彭在勤. 枇杷果肉過氧化物酶的分離純化及其性質研究[J]. 四川農(nóng)業(yè)大學學報， 2007， 25（4）： 419-424.

[12] Yang C P， Fujita S， Kohno K， et al. Partial purification and characterization of polyphenol oxidase from banana（Musa sapientum L.）peel[J]. J Agric Food Chem， 2001， 49（3）： 1 446-1 449.

[13] 韓 濤， 李麗萍. 果實和蔬菜中的過氧化物酶[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2000， 26（1）： 69-73.

[14] 周向軍， 高義霞，張生財. 雪蓮果過氧化物酶的特性和抑制研究[J]. 中國釀造， 2011（1）： 109-112.

[15] 楊昌鵬， 羅菊珍， 郭靜婕，等. 香蕉果肉過氧化物酶初步純化及特性研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學， 2008， 36（36）： 16 148-16 150.

[16] 王 璋. 食品科學[M]. 北京：中國輕工業(yè)出版社， 1999： 224-225.

[17] 李 健， 楊昌鵬， 陳智理， 等. 3個香蕉品種果實過氧化物酶的特性分析[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學， 2011， 50（15）： 3 093-3 101.

[18] 劉 暢， 徐玉娟， 李升鋒，等. 龍眼果肉中多酚氧化酶和過氧化物酶性質研究[J]. 食品工業(yè)科技， 2008， 29（7）： 102-104.

[19] 黎 婕， 陳 中，林偉鋒. 梅州金柚果肉中過氧化物酶特性的研究[J]. 食品工業(yè)科技， 2014， 35（1）： 133-136.

[20] 王 倩， 劉 偉， 劉成梅，等. 蘋果POD酶學性質及動態(tài)高壓微射流對POD的影響[J]. 食品與機械， 2011 ，27（2）： 4-7， 21.