摘 要：目的：研究諾斯卡品對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87-MG的增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用。方法：用不同濃度諾斯卡品作用于人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87-MG 24，.48小時，觀察形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)特性的改變。結(jié)果：諾斯卡品可以明顯抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖并促進(jìn)凋亡。結(jié)論：諾斯卡品可以嘗試作為膠質(zhì)瘤病人治療的新型化療藥物。

關(guān)鍵詞：膠質(zhì)瘤細(xì)胞；凋亡；Caspase；bcl-2

膠質(zhì)瘤（Glioma）是神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)惡性腫瘤，傳統(tǒng)治療主要包括腫瘤切除和放射治療。但由于腫瘤侵襲性極強(qiáng)，術(shù)后復(fù)發(fā)率極高。

諾斯卡品多年來一直作為鎮(zhèn)咳藥物使用，近年來抗腫瘤藥物實驗研究發(fā)現(xiàn)諾斯卡品及其衍生物具有抗癌活性，通過作用于微管，使腫瘤細(xì)胞長期處于靜止期，從而影響有絲分裂達(dá)到抑制增殖的目的。

體外及體內(nèi)實驗均表明諾斯卡品能夠明顯抑制乳腺癌、黑色素瘤等多種腫瘤細(xì)胞的增殖和周圍血管生成，并誘導(dǎo)其凋亡。更為重要的是，在多種小鼠腫瘤模型中，它對心、腎和肝臟等重要臟器無毒性或僅有輕微毒性。目前研究發(fā)現(xiàn)諾斯卡品誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制主要與caspase家族級聯(lián)反應(yīng)、線粒體途徑、以及Bcl-2家族成員相關(guān)。

本研究擬通過諾斯卡品作用于人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87-MG，觀察其增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡的作用，并探討其可能的機(jī)制。

1 方法

用諾斯卡品（50，100μmol/L）作用于人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87-MG 24，.48小時，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生物學(xué)特性的改變。利用細(xì)胞增殖抑制試驗（MTT方法）觀察不同濃度諾斯卡品對細(xì)胞活性的影響；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞生長周期變化；蛋白免疫印跡法（Western Blotting）檢測經(jīng)諾斯卡品處理后Bcl-2，及Bax，等相關(guān)凋亡因子蛋白表達(dá)水平的變化。

所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±S.D.）表示。所有數(shù)據(jù)在SPSS13.0軟件包上處理。采用非獨立樣本t檢驗， Spearman等級相關(guān)分析。P<0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 實驗選擇合適的諾斯卡品作用濃度

我們選擇了5個濃度梯度的諾斯卡品（25，50，100，200，

400μmol/L）作用于U87-MG細(xì)胞24h，48h，72h。結(jié)果發(fā)現(xiàn)諾斯卡品對U87-MG細(xì)胞具有明顯的抑制作用。濃度為50μmol/L的諾斯卡品24，48，72h后抑制率相近，在20%左右。濃度為400μmol/L的諾斯卡品24h.，48h，72h后，細(xì)胞的增殖抑制率相近，在85%左右。濃度為100μmol/L的諾斯卡品24h.，48h，72h后，抑制率在50%左右。

2.2 倒置顯微鏡觀察諾斯卡品對細(xì)胞形態(tài)的影響

用濃度為100μmol/L諾斯卡品作用于U87-MG細(xì)胞48h后，可見到培養(yǎng)基內(nèi)部分細(xì)胞呈不完全貼壁生長狀態(tài)，貼壁的細(xì)胞間連接減少、存在細(xì)胞碎片。對照組的細(xì)胞則貼壁生長，連接緊密，突觸多，核分裂象多見。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期變化

U87-MG細(xì)胞經(jīng)過諾斯卡品100μmol/L處理24h，48h后，收集所有漂浮和貼壁的細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測，諾斯卡品抑制U87-MG細(xì)胞于M期，表明諾斯卡品誘導(dǎo)的增殖抑制作用和細(xì)胞周期阻滯相關(guān)。

2.4 諾斯卡品通過caspase家族級聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)U87-MG細(xì)胞凋亡

Caspase家族在細(xì)胞凋亡過程中是執(zhí)行凋亡的主要酶類，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，諾斯卡品作用于U87-MG細(xì)胞24，48h后，可檢測到Caspase-3的激活以及PARP的裂解。

眾所周知，抗凋亡因子Bcl-2和促凋亡因子Bax通過線粒體介導(dǎo)的凋亡途中在多種人類腫瘤的形成及發(fā)展中起重要作用。諾斯卡品作用于U87-MG后可以檢測到Bcl-2蛋白的表達(dá)下降，但本實驗未檢測到Bax蛋白的表達(dá)有明顯變化（P<0.05）。

3 討論

諾斯卡品作為圍觀抑制劑可以使微管長時間的處于靜止期，但細(xì)胞內(nèi)微管蛋白的總量保持不變。這可能是動物模型實驗中諾斯卡品對重要臟器無明顯毒副作用的原因。諾斯卡品對腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷作用可能是由于腫瘤細(xì)胞存在紡錘體作用點機(jī)制的缺陷。

MTT結(jié)果表明諾斯卡品作用后，膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87-MG生長受到了明顯的抑制，且藥物濃度、作用時間與細(xì)胞活性呈較好的線性關(guān)系。

大量研究表明，caspase家族級聯(lián)反應(yīng)參與了細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制?；罨腃aspase通過特異性裂解底物導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，分為凋亡起始因子Caspase-2，8，9和凋亡執(zhí)行因子Caspase-3，6，7（15）。細(xì)胞凋亡開始后，起始因子激活執(zhí)行因子，最終激活Caspase-3，導(dǎo)致PARP蛋白的剪切。諾斯卡品作用于人腦膠質(zhì)瘤U87-MG細(xì)胞后，實驗檢測到了Caspase-3的激活和PARP的剪切。

Bcl-2作為重要的抗凋亡基因，在諾斯卡品作用組和對照組中表達(dá)量的明顯差異說明可能是通過控制抗凋亡因子Bcl-2的表達(dá)來調(diào)控細(xì)胞的增殖和存活。使用諾斯卡品作用后Bcl-2蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)，而Bax蛋白的表達(dá)基本無變化。說明諾斯卡品是通過通過作用于Bcl-2因子使其蛋白水平得以相應(yīng)降低并促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的凋亡。

4 結(jié)論

本實驗研究結(jié)果表明在體外實驗中諾斯卡品可以明顯抑膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87-MG的增殖并促進(jìn)其凋亡，其過程可能有多條信號通路共同調(diào)控，有待進(jìn)一步的研究證實。

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作者簡介：范菁（1984-），女，浙江杭州人，神經(jīng)腫瘤。