摘 要:目的:研究諾斯卡品對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87-MG的增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用。方法:用不同濃度諾斯卡品作用于人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87-MG 24,.48小時(shí),觀察形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)特性的改變。結(jié)果:諾斯卡品可以明顯抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖并促進(jìn)凋亡。結(jié)論:諾斯卡品可以嘗試作為膠質(zhì)瘤病人治療的新型化療藥物。
關(guān)鍵詞:膠質(zhì)瘤細(xì)胞;凋亡;Caspase;bcl-2
膠質(zhì)瘤(Glioma)是神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的原發(fā)惡性腫瘤,傳統(tǒng)治療主要包括腫瘤切除和放射治療。但由于腫瘤侵襲性極強(qiáng),術(shù)后復(fù)發(fā)率極高。
諾斯卡品多年來(lái)一直作為鎮(zhèn)咳藥物使用,近年來(lái)抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)諾斯卡品及其衍生物具有抗癌活性,通過(guò)作用于微管,使腫瘤細(xì)胞長(zhǎng)期處于靜止期,從而影響有絲分裂達(dá)到抑制增殖的目的。
體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均表明諾斯卡品能夠明顯抑制乳腺癌、黑色素瘤等多種腫瘤細(xì)胞的增殖和周圍血管生成,并誘導(dǎo)其凋亡。更為重要的是,在多種小鼠腫瘤模型中,它對(duì)心、腎和肝臟等重要臟器無(wú)毒性或僅有輕微毒性。目前研究發(fā)現(xiàn)諾斯卡品誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制主要與caspase家族級(jí)聯(lián)反應(yīng)、線粒體途徑、以及Bcl-2家族成員相關(guān)。
本研究擬通過(guò)諾斯卡品作用于人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87-MG,觀察其增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡的作用,并探討其可能的機(jī)制。
1 方法
用諾斯卡品(50,100μmol/L)作用于人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87-MG 24,.48小時(shí),顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生物學(xué)特性的改變。利用細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)(MTT方法)觀察不同濃度諾斯卡品對(duì)細(xì)胞活性的影響;流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)周期變化;蛋白免疫印跡法(Western Blotting)檢測(cè)經(jīng)諾斯卡品處理后Bcl-2,及Bax,等相關(guān)凋亡因子蛋白表達(dá)水平的變化。
所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示。所有數(shù)據(jù)在SPSS13.0軟件包上處理。采用非獨(dú)立樣本t檢驗(yàn), Spearman等級(jí)相關(guān)分析。P<0.05為有顯著性差異。
2 結(jié)果
2.1 實(shí)驗(yàn)選擇合適的諾斯卡品作用濃度
我們選擇了5個(gè)濃度梯度的諾斯卡品(25,50,100,200,
400μmol/L)作用于U87-MG細(xì)胞24h,48h,72h。結(jié)果發(fā)現(xiàn)諾斯卡品對(duì)U87-MG細(xì)胞具有明顯的抑制作用。濃度為50μmol/L的諾斯卡品24,48,72h后抑制率相近,在20%左右。濃度為400μmol/L的諾斯卡品24h.,48h,72h后,細(xì)胞的增殖抑制率相近,在85%左右。濃度為100μmol/L的諾斯卡品24h.,48h,72h后,抑制率在50%左右。
2.2 倒置顯微鏡觀察諾斯卡品對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響
用濃度為100μmol/L諾斯卡品作用于U87-MG細(xì)胞48h后,可見(jiàn)到培養(yǎng)基內(nèi)部分細(xì)胞呈不完全貼壁生長(zhǎng)狀態(tài),貼壁的細(xì)胞間連接減少、存在細(xì)胞碎片。對(duì)照組的細(xì)胞則貼壁生長(zhǎng),連接緊密,突觸多,核分裂象多見(jiàn)。
2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化
U87-MG細(xì)胞經(jīng)過(guò)諾斯卡品100μmol/L處理24h,48h后,收集所有漂浮和貼壁的細(xì)胞,用流式細(xì)胞儀檢測(cè),諾斯卡品抑制U87-MG細(xì)胞于M期,表明諾斯卡品誘導(dǎo)的增殖抑制作用和細(xì)胞周期阻滯相關(guān)。
2.4 諾斯卡品通過(guò)caspase家族級(jí)聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)U87-MG細(xì)胞凋亡
Caspase家族在細(xì)胞凋亡過(guò)程中是執(zhí)行凋亡的主要酶類,實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),諾斯卡品作用于U87-MG細(xì)胞24,48h后,可檢測(cè)到Caspase-3的激活以及PARP的裂解。
眾所周知,抗凋亡因子Bcl-2和促凋亡因子Bax通過(guò)線粒體介導(dǎo)的凋亡途中在多種人類腫瘤的形成及發(fā)展中起重要作用。諾斯卡品作用于U87-MG后可以檢測(cè)到Bcl-2蛋白的表達(dá)下降,但本實(shí)驗(yàn)未檢測(cè)到Bax蛋白的表達(dá)有明顯變化(P<0.05)。
3 討論
諾斯卡品作為圍觀抑制劑可以使微管長(zhǎng)時(shí)間的處于靜止期,但細(xì)胞內(nèi)微管蛋白的總量保持不變。這可能是動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中諾斯卡品對(duì)重要臟器無(wú)明顯毒副作用的原因。諾斯卡品對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷作用可能是由于腫瘤細(xì)胞存在紡錘體作用點(diǎn)機(jī)制的缺陷。
MTT結(jié)果表明諾斯卡品作用后,膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87-MG生長(zhǎng)受到了明顯的抑制,且藥物濃度、作用時(shí)間與細(xì)胞活性呈較好的線性關(guān)系。
大量研究表明,caspase家族級(jí)聯(lián)反應(yīng)參與了細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。活化的Caspase通過(guò)特異性裂解底物導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,分為凋亡起始因子Caspase-2,8,9和凋亡執(zhí)行因子Caspase-3,6,7(15)。細(xì)胞凋亡開(kāi)始后,起始因子激活執(zhí)行因子,最終激活Caspase-3,導(dǎo)致PARP蛋白的剪切。諾斯卡品作用于人腦膠質(zhì)瘤U87-MG細(xì)胞后,實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到了Caspase-3的激活和PARP的剪切。
Bcl-2作為重要的抗凋亡基因,在諾斯卡品作用組和對(duì)照組中表達(dá)量的明顯差異說(shuō)明可能是通過(guò)控制抗凋亡因子Bcl-2的表達(dá)來(lái)調(diào)控細(xì)胞的增殖和存活。使用諾斯卡品作用后Bcl-2蛋白的表達(dá)明顯下調(diào),而B(niǎo)ax蛋白的表達(dá)基本無(wú)變化。說(shuō)明諾斯卡品是通過(guò)通過(guò)作用于Bcl-2因子使其蛋白水平得以相應(yīng)降低并促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的凋亡。
4 結(jié)論
本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明在體外實(shí)驗(yàn)中諾斯卡品可以明顯抑膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87-MG的增殖并促進(jìn)其凋亡,其過(guò)程可能有多條信號(hào)通路共同調(diào)控,有待進(jìn)一步的研究證實(shí)。
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作者簡(jiǎn)介:范菁(1984-),女,浙江杭州人,神經(jīng)腫瘤。