陳　光　王　階　高嘉良　董　艷

100053 北京，中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院心血管科

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冠狀動脈粥樣硬化性心臟病血瘀證基因組學(xué)研究進展

陳光王階高嘉良董艷

100053 北京，中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院心血管科

【摘要】冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)血瘀證基因組學(xué)水平的研究，主要涉及結(jié)構(gòu)基因組學(xué)與功能基因組學(xué)。結(jié)構(gòu)基因組學(xué)主要研究冠心病血瘀證相關(guān)基因的單核苷酸多態(tài)性。功能基因組學(xué)是從轉(zhuǎn)錄水平研究基因差異表達譜。該文主要介紹冠心病血瘀證基因組學(xué)研究進展、存在的問題和研究前景。

【關(guān)鍵詞】冠狀動脈粥樣硬化性心臟??；血瘀證；基因組學(xué)；單核苷酸多態(tài)性；基因表達譜；證候

血瘀證是中醫(yī)臨床各科常見的一種證候。冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)最常見的證型之一即為血瘀證?；蚪M學(xué)(genomics)是闡明整個基因組的結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系以及基因之間相互作用的科學(xué)，包括結(jié)構(gòu)基因組學(xué)、功能基因組學(xué)和比較基因組學(xué)。隨著近年中醫(yī)藥研究現(xiàn)代化的進展，一些學(xué)者應(yīng)用基因組學(xué)方法，從分子水平探討冠心病血瘀證的證候?qū)嵸|(zhì)，主要涉及結(jié)構(gòu)基因組學(xué)和功能基因組學(xué)。

1結(jié)構(gòu)基因組學(xué)

結(jié)構(gòu)基因組學(xué)的主要內(nèi)容是基因組作圖和大規(guī)模測序。其中基因組作圖主要包括限制性片段長度多態(tài)性、可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列以及單核苷酸多態(tài)性(SNP)。目前對于冠心病血瘀證基因組學(xué)的研究主要涉及SNP。

1.1研究現(xiàn)狀

對于冠心病血瘀證SNP的研究主要涉及PAF-AH基因、血小板膜糖蛋白Ⅲa基因、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶基因、血管緊張素原基因、肌細胞增強因子2A基因。研究顯示，PAF-AH基因R92H、I198T多態(tài)性與冠心病血瘀證相關(guān)[1]。陳可冀院士團隊的研究表明，血小板膜糖蛋白Ⅲa的PLA1/PLA2基因多態(tài)位點不是漢族人冠心病和冠心病血瘀證的危險因素[2]。李建軍等[3]運用PCR結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳測定了119例冠心病血瘀證和41例非血瘀證患者血管緊張素轉(zhuǎn)換酶基因多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)冠心病血瘀證與該基因多態(tài)性無明顯相關(guān)性(P>0.05)。胡志希等[4]運用PCR技術(shù)檢測了41例早發(fā)冠心病血瘀證和45例非血瘀證患者血管緊張素轉(zhuǎn)換酶基因多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)該基因DD基因型及D等位基因與早發(fā)冠心病血瘀證發(fā)病相關(guān)(P<0.05)。李琳等[5]采用飛行時間質(zhì)譜分析技術(shù)檢測了25例早發(fā)冠心病血瘀證和30例非血瘀證患者血管緊張素轉(zhuǎn)換酶基因和肌細胞增強因子2A基因的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)前者rs4293、rs4267385位點與冠心病血瘀證無關(guān)，rs4343與冠心病血瘀證相關(guān)(P<0.05)；未發(fā)現(xiàn)后者與冠心病血瘀證相關(guān)。袁倩等[6]運用飛行時間質(zhì)譜分析技術(shù)和等位基因特異性PCR技術(shù)，檢測了50例早發(fā)冠心病血瘀證和26例非血瘀證患者血管緊張素原基因rs4762和rs699位點多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)這兩個SNP位點與湖南地區(qū)人群早發(fā)冠心病血瘀證均有相關(guān)性(P<0.01)。

1.2存在問題解析

目前證候相關(guān)SNP的研究存在以下3個問題。第一，SNP位點豐富且分布廣泛，選擇待測基因與SNP位點難度較大，這也是導(dǎo)致結(jié)果陽性率低的原因之一。筆者認為，應(yīng)結(jié)合目前血瘀證的相關(guān)機制，如微循環(huán)障礙、血液高凝狀態(tài)、血小板活化和黏附聚集、血栓形成、免疫功能障礙相關(guān)基因，探討調(diào)節(jié)通路的上下游關(guān)系。例如，血漿同型半胱氨酸水平過高會引發(fā)動脈粥樣硬化，這與血瘀證明顯相關(guān)，而同型半胱氨酸甲基化反應(yīng)需要關(guān)鍵酶亞甲基四氫葉酸還原酶參與，N5,N10亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因第4外顯子的C677T堿基突變最為常見。胡木林等[7]選擇該基因進行檢測，發(fā)現(xiàn)MTHFR基因TT型可能是缺血性中風(fēng)病血瘀證發(fā)病的易感危險因素之一。第二，目前各研究的樣本量較小，且待測人群的特征是對照設(shè)計的關(guān)鍵點，進一步擴大樣本量進行驗證十分必要。第三，表型與基因型之間存在著“一對多”的關(guān)系，是預(yù)測高危SNP的理論基礎(chǔ)。因此，檢測單一基因的某一個位點遠遠不夠，根據(jù)小樣本多基因多位點的篩選結(jié)果進行擴大樣本量驗證，是解決方法之一。

1.3研究思路展望

根據(jù)中醫(yī)理論思考SNP的特點，可以得出以下兩點啟示。第一，SNP是個體間存在先天性差異的重要遺傳基礎(chǔ)。一個人的體質(zhì)很大程度上取決于先天因素，并體現(xiàn)在對某些疾病的易感性和對證候發(fā)生的傾向性。因此，SNP作為重要的內(nèi)在遺傳因素，可能是“血瘀體質(zhì)”客觀化研究取得進展的突破口。第二，中醫(yī)學(xué)與基因組學(xué)在整體觀的思維方式上是一致的，但中醫(yī)證候的發(fā)生、發(fā)展復(fù)雜，全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)也許可以為尋找與證候相關(guān)的遺傳因素提供思路。然而，目前大部分研究是利用“人類基因組單體型圖計劃(HapMap)”中發(fā)現(xiàn)的SNP制作的芯片，但許多疾病是由稀有突變造成，芯片往往遺漏了這部分信息。因此，全基因組外顯子測序，甚至完整的全基因組測序有待進一步利用。

2功能基因組學(xué)

功能基因組學(xué)的重要部分是轉(zhuǎn)錄組學(xué)。轉(zhuǎn)錄組學(xué)是在整體水平上研究細胞編碼基因的轉(zhuǎn)錄情況及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律，闡明生物體在特定生理或病理狀態(tài)下表達的所有種類的mRNA及其功能。2.1研究現(xiàn)狀分析

目前冠心病血瘀證mRNA相關(guān)研究主要利用微陣列、基因表達系列分析、大規(guī)模平行信號測序系統(tǒng)等技術(shù)，對血瘀證與非血瘀證患者進行檢測，試圖發(fā)現(xiàn)差異基因表達譜。陳可冀院士團隊[8]應(yīng)用寡核苷酸基因芯片技術(shù)，分析了冠心病血瘀證、非血瘀證及健康人的基因表達譜差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與血瘀證相關(guān)的差異基因有48個，其中上調(diào)基因26個，下調(diào)基因22個。王階等[9-12]運用差異顯示方法研究冠心病血瘀證患者外周血白細胞的mRNA,電泳結(jié)果顯示出95條差異條帶，通過反向Northern法驗證差異條帶，得出28個差異基因，并將其與美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)人類基因庫進行比對，獲得了與人類基因100%同源的3個差異基因(b13、49b、23b)，99%同源的2個差異基因(b12、36a)，98%同源的2個差異基因(25b、57d)，其中b13與23b分別是淋巴細胞活化信號分子家族成員1(SLAMF1)與Bcl-2相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1(BCLF1)，臨床驗證發(fā)現(xiàn)，二者在冠心病血瘀證組中顯著高表達。王萍等[13]采用表達譜芯片檢測了16例冠心病血瘀證患者和7名健康人的差異基因表達譜，發(fā)現(xiàn)了與冠心病血瘀證相關(guān)的差異基因26個，其中上調(diào)7個，下調(diào)19個。袁肇凱等[14]采用基因芯片技術(shù)，檢測了家系冠心病血瘀證、家系冠心病非血瘀證患者的差異基因表達譜，結(jié)果顯示家系冠心病血瘀證相關(guān)的差異基因有8個，上調(diào)4個，下調(diào)4個， KEGG 通路分析顯示差異主要涉及趨化因子、白細胞介素、補體系統(tǒng)、基質(zhì)金屬蛋白酶、成纖維細胞生長因子、內(nèi)皮細胞黏附因子。

2.2存在問題解析

目前血瘀證基因表達譜研究尚存在以下4點問題。第一，小樣本量芯片檢測的個體差異較大，擴大樣本量驗證和配對樣本設(shè)計較為關(guān)鍵。第二，冠心病血瘀證診斷標準和芯片技術(shù)不統(tǒng)一。統(tǒng)一診斷標準和芯片技術(shù)是整合各類研究的基礎(chǔ)。第三，某一種芯片只能檢測該芯片包含的捕獲目標序列，對于其他基因的檢測則存在盲點，這是芯片技術(shù)的缺陷之一。第四，單純以基因表達譜研究血瘀證的實質(zhì)存在還原論思維方法的局限性，對于差異表達譜的調(diào)節(jié)機制研究仍有必要，因為調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建是從分子層面選擇預(yù)防和治療疾病靶點的基礎(chǔ)。

2.3研究思路展望

基因表達譜可以提供某種條件下各種基因表達的信息，通過表達序列標簽(EST)技術(shù)推測相應(yīng)未知基因的功能。然而，轉(zhuǎn)錄組學(xué)對整體功能的解釋較為局限。合成生物學(xué)可以很好地解決這個問題[15]。合成生物學(xué)基于全基因組序列和“三大系統(tǒng)”(代謝途徑、信號傳導(dǎo)通路、基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò))的研究成果，利用核苷酸序列合成技術(shù)，人工設(shè)計和制造生物系統(tǒng)，研究保證生物存活所必需的最小基因組，從而更深入地理解生命本質(zhì)。

3中醫(yī)證候本質(zhì)研究

3.1目前觀點分析

證候本質(zhì)的研究歷經(jīng)了幾十年的發(fā)展，累積了大量結(jié)果，但尚未出現(xiàn)學(xué)術(shù)界認同的證候診斷“金標準”。仍有學(xué)者認為證候并非客觀存在，而是借助現(xiàn)象構(gòu)造的模型，抽象思維并不能被實驗性研究所證實[16]。另外，也有學(xué)者認為，證候的本質(zhì)并不等同于證候的物質(zhì)基礎(chǔ)[17]。證候研究的過程中往往受到不同患者疾病差異的影響，而患者證候的復(fù)雜性、證候診斷標準的多樣性、動物證候模型建立標準的不確定性，都是研究證候?qū)嵸|(zhì)的難點。

3.2證候研究展望

針對證候?qū)嵸|(zhì)研究的諸多問題與爭議，筆者認為：病證結(jié)合證候?qū)嵸|(zhì)研究，可以避免因為疾病本身的差異導(dǎo)致證候研究結(jié)果的不確定性。此外，基于標準化證候診斷積分的復(fù)雜證候配對樣本試驗，基于動物四診信息采集的證候模型的標準建立，是使試驗更加嚴密并得到國際認可的重要途徑。

3.3基因組學(xué)前景

基因組學(xué)在整體觀方面的優(yōu)勢為中醫(yī)本質(zhì)研究提供了平臺。然而，證候本身還映射著患者所處的社會、環(huán)境、氣候及其自身文化素養(yǎng)、性格情操等方面，基因組學(xué)研究是否可以滿足證候更高層次解讀的要求仍需要實踐檢驗。

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(收稿：2015-10-29 修回：2016-02-03)

(本文編輯：梁英超)

doi:10.3969/j.issn.1673-6583.2016.02.003

通信作者：王階，Email:wangjie0103@126.com

基金項目：國家自然科學(xué)基金(81473561)；國家科技部“重大新藥創(chuàng)制”重大科技專項(2013ZX09301307)；國家科技部“重大新藥創(chuàng)制”重大科技專項(2012ZX09102-201-006)