丁海燕，丁 晨

(大慶師范學院生物工程學院，黑龍江大慶 163712)

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小麥籽粒DNA提取方法的比較及SSR反應(yīng)體系的優(yōu)化研究

丁海燕，丁 晨

(大慶師范學院生物工程學院，黑龍江大慶 163712)

摘要：為了快速獲得較高質(zhì)量的DNA用于SSR分析，并建立一套穩(wěn)定的SSR反應(yīng)體系，以小麥單粒干種子為材料，比較了CTAB法和SDS法獲得的DNA條帶清晰度和RNA殘留帶的清晰度；同時，研究了模板DNA濃度、引物濃度、dNTPs濃度以及Taq酶用量對SSR結(jié)果的影響。結(jié)果表明，CTAB法微量提取小麥干種子DNA可獲得理想的擴增結(jié)果；SSR的最佳反應(yīng)體系是：模板DNA濃度為4.0～4.8 ng·μL-1，Taq酶用量為1 U，引物濃度為50～200 nmol·L-1，dNTPs濃度為50～500 μmol·L-1。

關(guān)鍵詞：小麥；種子；CTAB法；SDS法；SSR

小麥SSR位點多，多態(tài)性豐富[1]，被廣泛應(yīng)用于小麥及其近緣物種的遺傳作圖[2]、小麥遺傳多樣性研究和核心種質(zhì)的構(gòu)建[3]。SSR系譜分析能準確地鑒別大量等位基因，適合于區(qū)分同一物種的不同基因型，特別是親緣關(guān)系非常近、而其他方法無法區(qū)分的品種或種質(zhì)材料[4]。Lrlley等[5]利用小麥基因組的42條染色體的42對SSR標記分析了來自匈牙利、澳地利和德國的各20個小麥品種，用3個基因組中的1組SSR標記就可以清晰地將來自3個不同地方的小麥品種區(qū)分開來。此外，SSR標記為鑒定小麥及其外源染色體提供了新的途徑[6]。舒煥麟等[7]利用黑麥SSR引物SCM-9、SCM-39、SCM-102以及小麥SSR引物Xgwm-106對來源于小麥-黑麥雜交組合的3個材料進行了分析，結(jié)果表明，這3個材料均為1R/1D代換系并伴有3RS的小片段插入。而SSR技術(shù)對反應(yīng)條件要求比較嚴格[8]，模板DNA質(zhì)量、退火溫度和引物濃度等是影響SSR擴增的重要因素。楊俊寶等[9]研究了從種子中獲得的DNA對SSR擴增的影響，結(jié)果表明，從小麥干種子中快速獲得的總DNA、產(chǎn)量和質(zhì)量均適合進行SSR分析；代 芳等[10]探究了退火溫度對小麥SSR的影響，結(jié)果表明，每對引物都有其合適的退火溫度。李 勇等[11]探索了模板DNA、dNTPs和引物等對小麥SSR的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對PCR擴增結(jié)果影響最顯著的有引物、Mg2+和TaqDNA聚合酶。但目前，以小麥種子為材料，采用CTAB法和SDS法所提取的DNA不經(jīng)RNA酶處理直接用于SSR-PCR擴增的研究尚未見報道。鑒于此，本研究以小麥單粒干種子為材料，對提取DNA的兩種主要方法進行比較；同時，對影響SSR結(jié)果的模板DNA濃度、引物濃度、dNTPs濃度以及Taq酶用量進行探討，旨在建立一套適合小麥SSR分析的最佳反應(yīng)體系。

1材料與方法

1.1材 料

供試材料為普通小麥中國春，由哈爾濱師范大學遺傳實驗室提供。

1.2DNA提取方法

1.2.1CTAB 法

取一粒小麥干種子，放入經(jīng)-20 ℃冰箱冷凍過的研缽內(nèi)，加入適量液氮研成粉末，分裝于1.5 mL離心管，加入700 μL已預熱到65 ℃的2×CTAB提取液(2%CTAB;1.4 mol·L-1NaCl;10 mmol·L-1Tris-HCl，pH 8.0;20 mmol·L-1EDTA)。置65 ℃水浴中保溫50 min，不時輕輕倒轉(zhuǎn)離心管以混勻。從水浴中取出離心管，冰上冷卻5 min，加入等體積的酚-氯仿-異戊醇(酚∶氯仿∶異戊醇=25∶24∶1)抽提，輕輕混勻20 min。13 000 r·min-1離心10 min，取上清液。再次加入等體積酚-氯仿-異戊醇，輕輕混勻20 min。13 000 r·min-1離心10 min，取上清液，加入等體積徑-20 ℃冰箱預冷的異丙醇，輕輕混勻，置-20 ℃冰箱30 min，13 000 r·min-1離心10 min，棄上清液，70%酒精沖洗2次，稍氣干(空氣干燥)，溶于30 μL 1×TE中，測DNA 濃度，并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量。

1.2.2SDS法

取一粒小麥干種子，放入經(jīng)-20 ℃冰箱冷凍過的研缽內(nèi)，加入適量液氮研成粉末，分裝于1.5 mL離心管，加入700 μL已預熱到65 ℃的提取緩沖液(100 mmol·L-1Tris-HCl，pH 8.0；50 mmol·L-1EDTA，pH 8.0；500 mmol·L-1NaCl；10 mmol·L-1β-巰基乙醇，此成分是以上成分混合滅菌后加入)，輕輕混勻。加入20%SDS裂解液，混勻后65 ℃水浴保溫30 min，不時輕輕倒轉(zhuǎn)離心管以混勻。從水浴中取出離心管，加入140 μL 5 mol·L-1醋酸鉀，混勻置冰上20 min，13 000 r·min-1離心10 min。取上清液加入等體積的氯仿-異戊醇(氯仿∶異戊醇=24∶1)抽提，混勻，13 000 r·min-1離心10 min。取上清液加入等體積經(jīng)-20 ℃冰箱預冷的異丙醇，置-20 ℃冰箱30 min沉淀DNA，13 000 r·min-1離心10 min。倒掉上清液，用70%酒精清洗2次，氣干，溶于30 μL 1×TE中，測DNA濃度，并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量。

1.3SSR反應(yīng)

1.3.1引 物

選用Saal等[12]所用引物Xgwm212、Xgwm114和Xgwm205，并交由大連寶生物公司合成。

1.3.2反應(yīng)體系和反應(yīng)程序

SSR程序優(yōu)化研究中，DNA濃度、引物濃度、Taq酶用量和dNTPs濃度分別設(shè)置5個梯度。其中，DNA濃度分別為1.6、2.4、3.2、4.0和4.8 ng·μL-1；引物濃度分別為50、70、100、200和500 nmol·L-1；Taq酶用量分別為0.5、1.0、1.5、2.0和3.0 U；dNTPs濃度分別為50、100、200、300和500 μmol· L-1。PCR程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性1 min，50 ℃/55 ℃/60 ℃退火30 s(退火溫度因引物不同而異[13])，72 ℃延伸1 min，40個循環(huán)[14]；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)在Cene 9700 PCR儀上進行[15]，擴增產(chǎn)物在 6%非變性聚丙烯酰胺凝膠上穩(wěn)壓120 V電泳，銀染顯色，然后用Umax型掃描儀掃描觀察。

2結(jié)果與分析

2.1不同DNA提取方法對擴增結(jié)果的影響

由圖1、圖2可知，CTAB法得到的DNA條帶整齊且清晰，雖然有RNA帶殘留，但是RNA帶比較弱，這種方法獲得的DNA可以直接用于PCR擴增，效果比較理想；而SDS法得到的DNA，除DNA帶清晰外，RNA帶也很亮很強，因此這種方法獲得的DNA需去除RNA，才能用于PCR擴增。此外，SDS法試驗結(jié)果穩(wěn)定性差，雖然圖中1～6點樣孔加樣量均為15 μL，且均是單次試驗獲得的DNA，但SDS法三次重復效果差異較大。

1、2和3：SDS法所提取的DNA；4、5和6：CTAB法所提取的DNA

1, 2 and 3: DNA extracted with SDS method; 4, 5 and 6: DNA extracted with CTAB method

圖1不同方法提取的DNA

Fig.1DNA extraction with different methods

2.2SSR反應(yīng)體系的優(yōu)化

利用CTAB法獲得的DNA對SSR反應(yīng)體系進行了優(yōu)化，結(jié)果如圖3所示。當Taq酶用量為1 U、引物濃度為50 nmol·L-1及dNTPs濃度為50 μmol·L-1時，模板DNA濃度為3.2、4.0和4.8 ng·μL-1時均可擴增出清晰的條帶，而模板DNA濃度為1.6和2.4 ng·μL-1時并未擴增出特異性條帶。當模板DNA濃度為4.0 ng·μL-1、Taq酶用量為1 U及dNTPs濃度為50μmol·L-1時，引物濃度為50、70、100和200nmol·L-1時均可擴增出清晰的條帶，而當引物濃度為500 nmol·L-1時，擴增條帶不清晰；當模板DNA濃度為4.0 ng·μL-1、Taq酶用量為1 U及引物濃度為50 nmol·L-1時，dNTPs在所有濃度梯度均可擴增出清晰條帶；當模板DNA濃度為4.0 ng·μL-1、引物濃度為50 nmol·L-1及dNTPs濃度為50 μmol·L-1時，Taq酶在所有用量梯度也均能擴增出清晰條帶。以上結(jié)果說明，模板DNA濃度和引物濃度對擴增結(jié)果影響較大。

1和2：以SDS法所提取的DNA為模板進行擴增的結(jié)果；3和4：以CTAB法所提取的DNA為模板進行擴增的結(jié)果

1 and 2: The fragments amplified with DNA extracted with SDS method; 3 and 4: The fragments amplified with DNA extracted with CTAB method

圖2利用Xgwm205引物對不同提取方法

所提取DNA進行擴增的結(jié)果

Fig.2PCR amplification with Xgwm205 primer from

DNA extracted with different methods

A圖中1～5表示模板DNA濃度分別為1.6、2.4、3.2、4.0和4.8 ng·μL-1；B圖中1～5表示引物濃度分別為50、70、100、200和500 nmol·L-1；C圖中1～5表示dNTPs濃度分別為50、100、200、300和500 μmol·L-1；D圖中1～5表示Taq酶用量分別為0.5、1.0、1.5、2.0和3.0 U；圖A～D擴增所使用引物分別是Xgwm212、Xgwm212、Xgwm114和Xgwm114

1-5 in Fig.A repesented template DNA concentration as 1.6, 2.4, 3.2, 4.0 and 4.8 ng·μL-1, respectively; 1-5 in Fig.B repesented primer concentration as 50, 70, 100, 200 and 500 nmol·L-1, respectively; 1-5 in Fig.C repesented dNTPs concentration as 50, 100, 200, 300 and 500 μmol·L-1, respectively; 1-5 in Fig.D repesentedTaqenzyme concentration as 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 and 3.0 U, respectively; The primers was Xgwm212 for Fig.A and B, and Xgwm114 for Fig.C and D, respectively

圖3不同濃度或用量梯度的模板DNA(A)、引物(B)、dNTPs(C)和Taq酶(D)SSR擴增結(jié)果

Fig.3SSR amplification results with different concentrations or usage

of template DNA(A), primer(B), dNTPs(C) andTaqenzyme(D)

3討 論

SSR分析對模板DNA質(zhì)量要求較高，高質(zhì)量DNA是試驗結(jié)果可靠并具有良好重復性的保證。本研究的結(jié)果表明，CTAB法提取的DNA純度高，SSR擴增效果好；SDS法步驟較簡單，但DNA純度低，擴增效果差。魏琦超等[16]利用CTAB法提取小麥干種子總DNA，試驗結(jié)果也證明該法獲得的DNA純度較好，完全能夠滿足分子標記等分子生物學實驗；旦 巴等[17]比較了CTAB法和SDS法提取西藏黃籽油菜干種子DNA，結(jié)果也表明CTAB法提取的DNA純度更高、質(zhì)量更好，更適用于SSR分析。另外，在PCR反應(yīng)中，蛋白質(zhì)、鹽類、多糖及RNA干擾引物與模板結(jié)合，影響擴增效果。

模板濃度是SSR分析的一個制約因子，其濃度過低，沒有擴增產(chǎn)物，但模板濃度在相當大的范圍內(nèi)不會影響SSR分析結(jié)果。引物濃度高，每次復性模板可被飽和結(jié)合，從本研究電泳圖譜看帶型豐富，但以加入適量為好。此外，本研究結(jié)果表明，dNTPs濃度和Taq酶用量對擴增產(chǎn)物影響不明顯。當然，出于經(jīng)濟考慮，Taq酶以適量為好。

PCR中的諸多因素都會對其結(jié)果產(chǎn)生影響，所以在操作過程中應(yīng)該嚴格控制試驗條件，包括反應(yīng)體系、試劑型號、試劑來源和反應(yīng)程序等，保證其一致性，也是試驗成功不可忽略的因素。

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Comparison of DNA Extraction Methods from Wheat Grain and the Optimization of SSR System

DING Haiyan，DING Chen

(Daqing Normal University，Daqing, Heilongjiang 163712,China)

Abstract:In order to obtain high quality DNA for SSR analysis and to establish a stable SSR technology system，DNA extraction and optimal conditions of SSR procedure were studied by using single dry grain of wheat as experimental material.The definition of DNA band and RNA residual band extracted with CTAB and SDS methods were compared.The effects of DNA concentration, primer concentration, dNTPs concentration and Taq enzyme concentration on the results of SSR were investigated.The results showed that the effective amplification products could be obtained with the DNA templates extracted from dry grain with CTAB buffer.SSR optimal reaction system was: 4.0-4.8 ng·μL-1of template, 1 U of Taq emzyme, 50-200 nmol·L-1of primer, and 50-500 μmol·L-1of dNTPs.

Key words:Wheat; Grain; CTAB method; SDS method; SSR

中圖分類號：S512.1；S330

文獻標識碼：A

文章編號：1009-1041(2016)03-0287-05

基金項目：黑龍江省教育廳科學技術(shù)研究項目(12513004)；大慶師范學院科學研究基金項目(12ZR04)；大慶市科技局科技計劃項目(szdfy-2015-65)

收稿日期：2015-09-25修回日期：2015-12-18

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-03-01

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20160301.1338.010.html

第一作者E-mail：dinghaiyan2004@126.com