李丹丹　湯響林　譚洪玲　梁乾德　王宇光　馬增春　肖成榮　高月

[摘要]該研究采用磁懸浮3維（3D）培養(yǎng)技術(shù)建立了3D HepG2細(xì)胞評(píng)價(jià)模型，并應(yīng)用此模型對(duì)典型的肝毒性藥物進(jìn)行了簡(jiǎn)單評(píng)價(jià)。HepG2細(xì)胞形成穩(wěn)定3D結(jié)構(gòu)后，采用免疫組化技術(shù)檢測(cè)了HepG2細(xì)胞在2D，3D培養(yǎng)條件下的糖原儲(chǔ)存能力，并應(yīng)用RTPCR技術(shù)對(duì)比研究了HepG2細(xì)胞在2D，3D不同培養(yǎng)條件下Ⅰ相、Ⅱ相藥物代謝酶、藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體、核受體及肝細(xì)胞特異標(biāo)志性分子白蛋白（ALB）等相關(guān)基因的mRNA 表達(dá)水平。免疫組化結(jié)果顯示，HepG2細(xì)胞在3D培養(yǎng)條件下具有豐富的糖原儲(chǔ)存能力，此特性與人肝組織相類似。此外，在3D培養(yǎng)條件下，HepG2細(xì)胞絕大部分藥物代謝酶、轉(zhuǎn)運(yùn)體、核受體及ALB的mRNA表達(dá)水平與2D相比均有不同程度的上調(diào)。在藥物肝毒性評(píng)價(jià)方面，該實(shí)驗(yàn)選用了典型的肝毒性藥物對(duì)乙酰氨基酚（APAP）和近年來(lái)肝毒性報(bào)道較多的中藥何首烏Polygonum multiflorum Thunb及補(bǔ)骨脂Psoraleae corylifolia L進(jìn)行單劑量和重復(fù)劑量（7 d）給藥實(shí)驗(yàn)；在重復(fù)劑量給藥實(shí)驗(yàn)中，3D HepG2細(xì)胞表現(xiàn)出更高的敏感性。應(yīng)用磁懸浮3D培養(yǎng)技術(shù)建立的3D HepG2細(xì)胞模型無(wú)論在形態(tài)上還是功能上都更接近于人的肝組織，是較好的3D肝毒性評(píng)價(jià)模型。

[關(guān)鍵詞]3D培養(yǎng)；肝毒性；評(píng)價(jià)模型

[Abstract]3D in vitro toxicity testing model was developed by magnetic levitation method for culture of the human hepatoma cell line HepG2 and applied to evaluate the drug hepatotoxicity After formation of stable 3D structure for HepG2 cells， their glycogen storage capacity under 2D and 3D culture conditions were detected by immunohistochemistry technology， and the mRNA expression levels of phase Ⅰ and Ⅱ drug metabolism enzymes， drug transporters， nuclear receptors and liverspecific marker albumin（ALB） were compared between 2D and 3D culture conditions by using RTPCR method Immunohistochemistry results showed that HepG2 cells had abundant glycogen storage capacity under 3D culture conditions， which was similar to human liver tissues The mRNA expression levels of major drug metabolism enzymes， drug transporters， nuclear receptors and ALB in HepG2 cells under 3D culture conditions were upregulated as compared with 2D culture conditions For drug hepatotoxicity evaluation， the typical hepatotoxic drug acetaminophen（APAP）， and most reported drugs Polygonum multiflorum Thunb（Chinese name Heshouwu） and Psoraleae corylifolia L（Chinese name Buguzhi） were selected for single dose and repeated dose（7 d） exposure In the repeated dose exposure test， 3D HepG2 cells showed higher sensitivity This established 3D HepG2 cells model with magnetic levitation 3D culture techniques was more close to the human liver tissues both in morphology and functions， so it was a better 3D hepatotoxicity evaluation model

[Key words]3D culture； hepatotoxicity； evaluation model

doi：10.4268/cjcmm20160725

近年來(lái)，中藥在用于治療各種疾病并取得確切療效的同時(shí)，其所致毒性和不良反應(yīng)事件亦頻繁發(fā)生，而肝臟作為藥物代謝的主要器官無(wú)疑是受藥物損傷最嚴(yán)重的靶器官[1]。因此，中藥的毒性研究，尤其是肝毒性研究受到廣泛關(guān)注，尋找能夠準(zhǔn)確、快速、靈敏反映藥物肝毒性的技術(shù)與模型已成為當(dāng)前中藥安全性評(píng)價(jià)亟待解決的重大問(wèn)題。

傳統(tǒng)2D培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞無(wú)極化形態(tài)，低表達(dá)藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)體，這也常被認(rèn)為是限制其毒性預(yù)測(cè)能力的關(guān)鍵因素之一[2]。本研究采用由美國(guó)Nano3D Biosciences公司研發(fā)的磁懸浮3D培養(yǎng)技術(shù)，通過(guò)優(yōu)化3D HepG2細(xì)胞單個(gè)球體的細(xì)胞數(shù)量、培養(yǎng)基體積及培養(yǎng)時(shí)間所建立的3D細(xì)胞模型，在保持肝細(xì)胞形態(tài)和功能上具有明顯的優(yōu)勢(shì)，可應(yīng)用于藥物安全性評(píng)價(jià)和高通量篩選。

1材料與方法

11藥物、試劑與儀器對(duì)乙酰氨基酚（日本TCI公司，CAS：103902）；生首烏（北京同仁堂，批號(hào)20120707）；補(bǔ)骨脂（北京同仁堂，批號(hào)20131008）；DMEM，PBS，胰酶（美國(guó)GIBCO公司）；胎牛血清（天津康源生物技術(shù)有限公司）；Trizol（美國(guó)Sigma公司）；引物合成（北京博邁德科技發(fā)展有限公司）；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，RTPCR試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；CellTiterGlo熒光細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Promega公司）；多聚甲醛（廣東西隴化工股份有限公司）；糖原 PAS染色液試劑盒（上海瑞谷生物科技有限公司）；NanoShuttleTMPL磁納米粒、96孔磁鐵驅(qū)動(dòng)（美國(guó)Nano3D公司）； T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶、96孔普通培養(yǎng)板、96孔超低吸附培養(yǎng)板（美國(guó)Corning公司）；CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）；超微量分光光度計(jì)（美國(guó)GE公司）；StepOnePlus RTPCR System（美國(guó)Applied Biosystem公司）。

12藥物制備精密稱取生首烏（PM）適量，加10倍蒸餾水浸泡30 min后，煎煮2次，每次2 h；合并2次濾液并過(guò)濾，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后，冷凍干燥成粉末。用培養(yǎng)基稀釋所得粉末配成質(zhì)量濃度為60 g·L-1的母液，過(guò)濾除菌，稀釋至各給藥濃度。

精密稱取補(bǔ)骨脂（PC）適量，加10倍蒸餾水浸泡30 min后，煎煮2次，每次30 min；合并2次濾液，過(guò)濾、濃縮后，冷凍干燥成粉末。用培養(yǎng)基稀釋所得粉末配成質(zhì)量濃度為60 g·L-1的母液，過(guò)濾除菌，稀釋至各給藥濃度。

精密稱取對(duì)乙酰氨基酚（APAP）適量，加入培養(yǎng)基配成濃度為30 μmol·L-1的母液，過(guò)濾除菌，用培養(yǎng)基稀釋至各給藥濃度。

133D HepG2細(xì)胞培養(yǎng)人肝癌HepG2細(xì)胞購(gòu)自北京協(xié)和細(xì)胞庫(kù)，生長(zhǎng)于含10%胎牛血清的DMEM中，于37 ℃恒溫、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%匯合時(shí)加入NanoShuttleTMPL磁納米粒37 ℃孵育過(guò)夜，使細(xì)胞磁化。次日將HepG2細(xì)胞接種于超低吸附的96孔板中，每孔約1×104個(gè)細(xì)胞，在96孔板頂部放置磁鐵驅(qū)動(dòng)，使細(xì)胞被吸引和聚集。HepG2細(xì)胞可在15 min內(nèi)聚集成細(xì)胞團(tuán)形成3D結(jié)構(gòu)，此時(shí)可移去磁鐵驅(qū)動(dòng)。磁懸浮3D培養(yǎng)技術(shù)的具體操作流程見圖1[3]。

14細(xì)胞免疫組化3D HepG2細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，吸棄培養(yǎng)液并用PBS輕輕漂洗2次，用4%多聚甲醛室溫固定20 min后進(jìn)行糖原 PAS染色，具體操作步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

15RNA提取和RTPCR分析Trizol法抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)條件：25 ℃ 10 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。RTPCR所用引物序列見表1，反應(yīng)程序：94 ℃ 30 s，94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用Livak（2-ΔΔCt）法進(jìn)行相對(duì)基因表達(dá)分析。

16藥物細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)2D與3D HepG2細(xì)胞分別接種于普通與超低吸附的96孔板中，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行細(xì)胞毒性測(cè)試。給藥24 h后，采用CellTiterGlo熒光細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活性。此外，還對(duì)3D HepG2細(xì)胞進(jìn)行了重復(fù)給藥毒性實(shí)驗(yàn)，每隔24 h給藥1次，重復(fù)給藥1周。

17統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，使用SPSS 180軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，采用單因素方差分析，P<005為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

213D HepG2細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能接種于超低吸附96孔板中的HepG2細(xì)胞，在放置磁鐵驅(qū)動(dòng)15 min后即可形成緊密連接的3D球體結(jié)構(gòu)，球體直徑為1～2 mm，可持續(xù)培養(yǎng)1周以上。2D，3D HepG2細(xì)胞形態(tài)見圖2。

222D與3D HepG2 細(xì)胞基因表達(dá)比較RTPCR結(jié)果顯示，HepG2細(xì)胞在3D培養(yǎng)條件下絕大多數(shù)藥物代謝酶、藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體及核受體的基因表達(dá)水平與2D相比均有不同程度的上調(diào)，見圖4。其中I相藥物代謝酶CYP3A4基因表達(dá)水平上升最為明顯，約為2D培養(yǎng)時(shí)的59倍。藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體BSEP和MRP2是肝細(xì)胞毛細(xì)膽囊膜上主要的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在內(nèi)外源物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)方面發(fā)揮重要作用，它們?cè)?D培養(yǎng)時(shí)基因表達(dá)量分別上升34，28倍。核受體中PXR上升最為顯著，約為2D培養(yǎng)時(shí)的25倍。此外，肝細(xì)胞特異標(biāo)志性分子白蛋白（ALB）在3D培養(yǎng)時(shí)基因表達(dá)量上升了35倍。

232D，3D HepG2細(xì)胞毒性研究通過(guò)比較2D，3D HepG2細(xì)胞單劑量和重復(fù)劑量給藥細(xì)胞毒性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)3D培養(yǎng)條件下的細(xì)胞對(duì)藥物的反應(yīng)更為敏感，見圖5。當(dāng)給以細(xì)胞單劑量、低濃度的APAP（009～188 μmol·L-1），PM（018～375 g·L-1）或PC（018～375 g·L-1）時(shí)，3D HepG2細(xì)胞球體的疏松程度、細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞活力均發(fā)生明顯改變，而2D HepG2細(xì)胞并無(wú)此類明顯變化；當(dāng)給予3D HepG2細(xì)胞重復(fù)劑量（7 d）APAP或PM時(shí)，細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性明顯增強(qiáng)：APAP重復(fù)劑量給藥時(shí)的IC50 076 μmol·L-1顯著小于單劑量給藥時(shí)的541 μmol·L-1，PM重復(fù)劑量給藥時(shí)的IC50 286 g·L-1顯著小于單劑量給藥時(shí)的1160 g·L-1， PC重復(fù)劑量給藥時(shí)的IC50 369 g·L-1顯著小于單劑量給藥時(shí)的1471 g·L-1。

3討論

肝臟是藥物代謝的主體，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞或肝細(xì)胞都含有多數(shù)藥物代謝所需的酶和轉(zhuǎn)運(yùn)體，這些酶和轉(zhuǎn)運(yùn)體在藥物代謝和毒性方面發(fā)揮著重要作用[2]。傳統(tǒng)2D培養(yǎng)的細(xì)胞呈平面生長(zhǎng)，缺少細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與胞外基質(zhì)間的接觸，細(xì)胞極化現(xiàn)象消失，低表達(dá)藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)體，這些都大大限制了其在藥物安全性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用[2，4]。多種3D模型表明，細(xì)胞在3D培養(yǎng)條件下能較好的維持其極化狀態(tài)和保持肝組織特有的功能[58]。由美國(guó)Nano3D Biosciences公司研發(fā)的磁懸浮3D培養(yǎng)技術(shù)是近年來(lái)新興的一種3D培養(yǎng)技術(shù)，其主要原理是向2D 培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入由金納米顆粒、氧化鐵和細(xì)胞粘附多肽組成的磁性納米顆粒使細(xì)胞磁化，通過(guò)外加磁場(chǎng)使細(xì)胞聚集成團(tuán)后移除磁場(chǎng)，細(xì)胞便可在3D空間生長(zhǎng)并分泌細(xì)胞外基質(zhì)[9]。

本研究采用磁懸浮3D培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)的人肝癌HepG2細(xì)胞與常規(guī)2D培養(yǎng)相比，不僅高表達(dá)絕大多數(shù)Ⅰ相、Ⅱ相藥物代謝酶、藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體、核受體及肝細(xì)胞特異的標(biāo)志性分子ALB，還具有豐富的糖原儲(chǔ)存功能，與多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的3D肝細(xì)胞模型的特性相類似[58]。此外，因其能持續(xù)培養(yǎng)7 d以上，還可進(jìn)行重復(fù)給藥實(shí)驗(yàn)。在重復(fù)給藥實(shí)驗(yàn)中，3D HepG2細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性顯著提高。

中藥具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的復(fù)雜作用特征，且臨床病人服藥周期從幾周到幾個(gè)月不等。常規(guī)2D培養(yǎng)的細(xì)胞僅能進(jìn)行單次給藥毒性實(shí)驗(yàn)，難以評(píng)估藥物長(zhǎng)期作用時(shí)的毒性大?。欢捎么艖腋?D培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞可持續(xù)培養(yǎng)一周以上，進(jìn)行多劑量重復(fù)給藥實(shí)驗(yàn)，用于模擬藥物長(zhǎng)期低劑量使用時(shí)對(duì)人體肝細(xì)胞損傷的影響，與2D 細(xì)胞模型相比更符合中藥臨床的實(shí)際用藥情況。

目前大多數(shù)3D細(xì)胞培養(yǎng)方法都要用到基質(zhì)膠、聚合物支架等生物材料，這些方法往往費(fèi)用昂貴，且3D細(xì)胞從培養(yǎng)到成型耗時(shí)近一個(gè)月，不利于大規(guī)模藥物的快速篩選與毒性評(píng)價(jià)。磁懸浮3D培養(yǎng)技術(shù)與常規(guī)3D培養(yǎng)技術(shù)相比，3D細(xì)胞成型快（僅需1 d），操作簡(jiǎn)便，費(fèi)用低廉，且細(xì)胞幾小時(shí)之內(nèi)就能形成緊密連接并自行分泌細(xì)胞外基質(zhì)，是理想的藥物毒性評(píng)價(jià)及高通量篩選模型。

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[責(zé)任編輯曹陽(yáng)陽(yáng)]