張凱凱，孫圓圓，徐玲玲，馮旭東，關(guān)　萍

(貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 貴州 貴陽 550025)

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鎘脅迫對一年生黑麥草生理生化特性的影響

張凱凱，孫圓圓，徐玲玲，馮旭東，關(guān)萍*

(貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 貴州 貴陽 550025)

摘要：通過盆栽試驗，研究不同濃度鎘(0、50、100、200、300 mg/kg)脅迫對一年生黑麥草(Tagetespatula L.)成年植株葉綠素和丙二醛(MDA)含量及抗氧化酶(SOD、CAT、POD)活性的影響。結(jié)果表明：低濃度鎘(50mg/kg)脅迫葉綠素含量略有減少，但隨著脅迫濃度的升高，葉綠素含量與對照顯著減少；MDA含量隨著鎘脅迫濃度增加呈現(xiàn)先降后升的變化趨勢，300mg/kg時達(dá)到最高值；SOD、CAT、POD活性隨鎘濃度升高，均表現(xiàn)出先升后降的變化趨勢?？梢?，一年生黑麥草對重金屬鎘具有一定的耐受性，為植物重金屬修復(fù)方面提供參考。

關(guān)鍵詞：鎘；一年生黑麥草；葉綠素；MDA；抗氧化酶

土壤重金屬污染已成為當(dāng)今環(huán)境污染的嚴(yán)峻問題之一，土壤重金屬微量元素由于易移動、毒性大、難降解且能沿食物鏈富集，對環(huán)境和人類健康造成了嚴(yán)重危害。據(jù)報道，中國受污染的耕地面積達(dá)2000萬hm2，約占耕地總面積的1/5[1]，每年因土壤重金屬污染造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)到近200億元[2]。鎘(Cd)是當(dāng)今重金屬污染中面積最大且毒性最強金屬元素之一，具有較強的致癌、致畸和致突變的作用，鎘一旦進(jìn)入土壤便會長時間滯留在耕作層中，且極易被植物吸收并積累，目前我國鎘污染土地面積已達(dá)1萬hm2以上[3]。鎘不是植物生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)元素，低濃度的鎘會對植物起到促進(jìn)作用，當(dāng)鎘濃度超過植物耐受的最高濃度時，便會對植物產(chǎn)生毒害作用，使得植株體內(nèi)代謝紊亂及生長發(fā)育受到抑制，線粒體和葉綠體受到較大破壞，降低植物呼吸和光合作用效率[4]。同時高濃度鎘脅迫導(dǎo)致植物細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量自由基，打破植物自身自由基的產(chǎn)生與清除平衡，對植物一些關(guān)鍵酶系活性將產(chǎn)生嚴(yán)重影響[5-6]。

一年生黑麥草(LoliumperenneL.)屬一年生草本植株，它因適應(yīng)性廣、耐旱、耐寒、耐瘠、分蘗再生能力強、生長速度快及產(chǎn)量高等優(yōu)勢被作為高效牧草，在我國長江流域以南的地區(qū)均有大量種植。有報道稱黑麥草對Zn、Cd、Pb具有一定的富集能力[7-8]。多年生黑麥草對Cd具有較強的富集能力，具有植物修復(fù)的能力[9]。

本試驗以黑麥草對Cd具有較強的富集能力的特點，而選取黑麥草作為本次研究的對象，采用土培方法，研究不同質(zhì)量濃度鎘脅迫對一年生黑麥草成年植株生理生化特性(葉綠素含量、MDA含量、抗氧化酶活性)的影響，以期研究成年植株抗性機(jī)制、富集規(guī)律，為植物修復(fù)重金屬技術(shù)提供理論依據(jù)。

1.1供試材料

本研究于2014年3月-2014年6月在貴州大學(xué)生物技術(shù)實驗室進(jìn)行。供試一年生黑麥草(TagetespatulaL.)種子購自丹農(nóng)國際種子公司；供試土壤為購買的有機(jī)質(zhì)營養(yǎng)土；脅迫試劑所用氯化鎘(CdCl22.5H2O)為分析純；澆灌水為去離子水；儀器包括：光照培養(yǎng)箱、紫外分光光度計、冰凍高速離心機(jī)、電子天平等。

1.2植物培養(yǎng)與處理方法

取顆粒飽滿、大小均勻的一年生黑麥草種子，用75%的酒精消毒3-5 min，后用去離子水沖洗數(shù)次，蒸餾水侵泡種子24 h。選取直徑為9 cm的培養(yǎng)皿，將雙層定性濾紙放入皿底作發(fā)芽床，每皿放入50粒種子，加入適量的蒸餾水于25℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天加適量蒸餾水補充蒸發(fā)水分。待幼苗長到約7-10 cm時，選取植株長勢均勻苗為實驗材料，移入裝有500 g營養(yǎng)土的花盆中，每盆3株。將氯化鎘(CdCl22.5H2O)配制為0(CK)、50、100、200、300 mg/kg5個不同濃度，每個濃度取20ml噴曬于盆栽土壤中，各處理設(shè)3次重復(fù)，共15盆，自然條件下培養(yǎng)。實驗期間不給植株施加任何肥料，并采用稱重澆水的方法，保持土壤濕度。待植株盆栽時間60 d后，各濃度每個重復(fù)中分別取一個樣，測定不同生理指標(biāo)，后取3個重復(fù)值的平均值，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的分析。

1.3生理生化指標(biāo)的測定

葉綠素用95%的酒精溶液提取，并用分光光度法測定其含量、MDA含量采用硫代巴比妥酸法測定[10]、SOD活性采用氮藍(lán)四唑(NBT)光化還原法測定[11]、POD活性采用愈創(chuàng)木酚法測定[12]、CAT活性測定采用紫外分光光度法[13]。

1.4數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel2007軟件進(jìn)行處理，并采用SPSS(19.0)統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2結(jié)果與分析

2.1Cd脅迫對一年生黑麥草葉綠素含量的影響

如圖1所示，在Cd脅迫下，一年生黑麥草葉綠素含量隨Cd脅迫濃度的升高總體呈現(xiàn)下降趨勢，在Cd脅迫濃度為200 mg/kg時，葉綠素含量達(dá)到最低值7.77 mg/gFw。與對照相比，在50～300 mg/kg鎘脅迫下的葉綠素含量分別下降了1.16%、21.3%、35.9%、34.9%。在各濃度脅迫下的葉綠素含量均低于對照，且各脅迫濃度間的含量差異性顯著(P<0.05 )。綜上所述，Cd脅迫對一年生黑麥草葉綠素的合成具有抑制作用，與孫圓圓研究的幼苗植株相比較，Cd對成年一年生黑麥草抑制作用更為明顯，表明長時間的脅迫使得植株毒害加劇。

2.2Cd脅迫對一年生黑麥草MDA含量的影響

如圖1所示，隨Cd脅迫濃度增加，一年生黑麥草MDA含量呈現(xiàn)先降后升的趨勢，并在50 mg/kgCd脅迫下，MDA含量出現(xiàn)最低值4.4 nmol/gFw，比對照減少了12%；300 mg/kg Cd脅迫下，MDA含量最高5.5 nmol/gFw，比對照升高了9.1%；在50～300 mg/kg Cd脅迫下，一年生黑麥草的MDA含量逐漸升高，但與對照并無顯著差異(P>0.05)。由此表明一年生黑麥草植株在長期Cd脅迫下，膜脂過氧化程度隨脅迫濃度增加而加劇。

圖1　不同濃度Cd脅迫對一年生黑麥

2.3Cd脅迫對一年生黑麥草SOD活性的影響

如圖2所示，不同Cd濃度脅迫下，一年生黑麥草SOD活性變化較大，大致呈現(xiàn)先升后降趨勢，其中200 mg/kg處略有升高。在50 mg/kgCd濃度脅迫下，SOD活性達(dá)到最大值，說明在低濃度重金屬脅迫下，一年生黑麥草表現(xiàn)出一定耐性，但隨脅迫濃度的不斷升高，植株細(xì)胞內(nèi)自由基濃度升高，打破植株自身平衡，從而SOD活性降低，在300 mg/kg處活性最低(84.03 U/gFw)，但與對照差異不顯著(P>0.05)，可能由于在該脅迫濃度下一年生黑麥草保持較高的耐性。

圖2　不同濃度Cd脅迫對一年生黑麥草SOD活性的影響

2.4Cd脅迫對一年生黑麥草CAT活性的影響

如圖3所示，在0～300 mg/kg Cd脅迫下，一年生黑麥草CAT活性表現(xiàn)出先升后降最后略有升高的變化趨勢，并在200 mg/kg Cd脅迫下達(dá)到最低值(2.77U/g Fw)， 在200～300 mg/kg Cd脅迫下分別

圖3　不同濃度Cd脅迫對一年生黑麥草CAT活性的影響

較對照顯著降低了25.1%和24.7%(P<0.05)。由該結(jié)果可知，一年生黑麥草對低濃度Cd脅迫具有一定的耐受性，通過增強自身的過氧化氫酶活性，從而很好的保護(hù)植株免受重金屬的毒害；但當(dāng)脅迫濃度達(dá)到一定值時，最終將打破植株自身的平衡作用機(jī)制，植物本身的應(yīng)激系統(tǒng)下降，使其適應(yīng)逆境能力降低，從而不斷加強對植物傷害，甚至死亡。

2.5Cd脅迫對一年生黑麥草POD活性的影響

如圖4所示，POD活性隨Cd脅迫濃度增加表現(xiàn)先生后降再升高的趨勢，在低濃度50 mg/kgCd脅迫下，POD活性達(dá)到最高值(28.9 U/gFw)，較對照增加了13.3%；隨后便逐漸降低，在200 mg/kg處達(dá)到最低值(21.8 U/gFw)，較對照減少了12.9%，然后在300 mg/kg出又略有上升，但上升與降低較對照并不顯著。過氧化物酶(POD)的主要作用是清除氧代謝中產(chǎn)生的H2O2以及由此產(chǎn)生的有機(jī)過氧化物，因此，POD 在生物體內(nèi)的抗氧化代謝中起重要作用。由實驗結(jié)果表明，一年生黑麥草在低濃度Cd脅迫下表現(xiàn)出耐性，通過提高自身的POD活性以清除體內(nèi)過多的過氧化物，從而免受侵害。

圖4　不同濃度Cd脅迫對一年生黑麥草POD活性的影響

3討論

當(dāng)植物受到重金屬脅迫時會出現(xiàn)生長緩慢、植株矮小、產(chǎn)量降低、根系伸長受到抑制的現(xiàn)象，嚴(yán)重時甚至?xí)劳鯷14-15]。葉綠素是植物光合作用的主要色素，其含量的高低在一定程度上反映了植物光合作用的強弱[16]，研究[17]發(fā)現(xiàn)，重金屬脅迫對葉綠素合酶起到抑制作用，降低葉綠素的合成，從而抑制光合作用的進(jìn)行。本試驗中，一年生黑麥草葉綠素含量隨鎘脅迫濃度的增加而逐漸降低，說明植株受重金屬鎘脅迫，葉綠素的合成受到影響，黑麥草光合作用將受到抑制，進(jìn)而對植株的生長產(chǎn)生破壞性影響。研究[18]表明，高濃度的Cd處理抑制了煙草葉綠素的合成，使葉綠素含量降低，煙草葉綠素含量和光合強度隨Cd含量的上升而逐漸下降。植物細(xì)胞膜系統(tǒng)是植物與外界環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)運輸機(jī)信息傳遞的通道和屏障，其功能的穩(wěn)定對植物的正常生理代謝起到重要重用[19]。在高濃度重金屬脅迫下，細(xì)胞內(nèi)的大量自由基對植物細(xì)胞膜透性產(chǎn)生嚴(yán)重破壞，MDA的積累反映了細(xì)胞膜脂過氧化程度。在本實驗中，MDA含量先降后升，表明植物在低濃度鎘脅迫下，體內(nèi)的活性氧能夠被清除，但當(dāng)脅迫進(jìn)一步提高時，過多的活性氧將導(dǎo)致膜脂過氧化，從而使得MDA含量上升。結(jié)合葉綠素含量逐漸降低的變化趨勢，可以推測MDA在植物體內(nèi)的大量積累，將嚴(yán)重影響葉綠素的合成。方學(xué)智等人[20]研究表明，重金屬對植物的傷害與自由基的產(chǎn)生有關(guān)，植物通過抗氧化酶系統(tǒng)(SOD、CAT、POD)來減輕自由基對其自身的毒害。SOD是活性氧清除系統(tǒng)中重要的防御酶，起核心作用，CAT及POD共同催化H2O2和過氧化物生成水和氧分子。本研究中，SOD、CAT、POD活性均在低濃度鎘脅迫下表現(xiàn)為升高，證明了植物在低濃度脅迫時，產(chǎn)生了應(yīng)激反應(yīng)，3種抗氧化酶活性都有所提高；而隨鎘濃度的升高，增多的活性氧使得多種功能膜及酶系統(tǒng)遭到不同程度破壞，從而導(dǎo)致3種抗氧化酶活性的降低。隨著植物Cd含量的大量積累，葉綠素合成減少、MDA含量的增加、抗氧化酶活性的降低，黑麥草植株綜合抗逆境能力降低，植株通常表現(xiàn)出生長緩慢、植株矮小、不育甚至死亡等。本試驗從不同濃度鎘脅迫下，對一年生黑麥草成年植株的生理生化特性變化做了初步探討，對一年生黑麥草的鎘抗性機(jī)理及富集規(guī)律有了一定了解。

參考文獻(xiàn)

[1]張堯, 田正貴, 曹翠玲. 黑麥草幼苗對鎘耐性能力及吸收積累和細(xì)胞分部特點研究[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報, 2010, 29(11): 2080-2086.

[2]肖智, 劉志偉, 畢華. 土壤重金屬污染研究述評[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 38(33): 18812-18815.

[3]孫圓圓, 張光蘭, 楊文杰. 鎘脅迫對一年生黑麥草種子及幼苗初期生理生化特性的影響[J]. 種子, 2014, 33(8): 25-29.

[4]Bidar G, Garcon C, Pruvot C. Behavior ofTrifoliumrepensandLoliumperennegrowing in a heavy metal contaminated field: Plant metal concentration and phytotoxicity[J].EnvironmentalPollution, 2007(147): 546-553.

[5]江巧君, 周琴, 韓亮亮. 有機(jī)肥對鎘脅迫下不同基因型水稻抗氧化系統(tǒng)和光合特性的影響[C]. 第五屆全國農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)術(shù)研討會論文集, 2013(4): 18-26.

[6]Talanova V V, Titov A F, Boeva N P. Effect of increasing concentrations of heavy metals on the growth ofbarleyandwheatseedling[J].RussianJournalofPlantPhysiology, 2001, 48(1): 119-123.

[7]姚婧, 王友保, 李文良. 黑麥草對土壤中Pb的富積作用及耐受性研究[J]. 水土保持通報, 2008, 28(2): 17-21.

[8]李文一, 徐衛(wèi)紅, 胡小鳳. Zn脅迫對黑麥草幼苗生長、生理生化及Zn吸收的影響[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報, 2007, 23(5): 190-194.

[9]李慧芳, 袁慶華, 趙桂琴. 鎘脅迫對多年生黑麥草種質(zhì)幼苗生長的影響[J]. 草業(yè)科學(xué), 2014, 31(5): 898-904.

[10]李合生. 植物生理生化實驗原理和技術(shù)[M]. 北京: 高等教育出版社, 2000.

[11]張立軍, 樊金娟. 植物生理學(xué)實驗教程[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社, 2007.

[12]張志良, 翟偉清, 李小芳. 植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)(第4版)[M]. 北京: 高等教育出版社, 2009．

[13]楊蘭芳, 龐靜, 彭小蘭. 紫外分光光度法測定植物過氧化氫酶活性[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技, 2009, 20: 364-366.

[14]文曉慧. 重金屬脅迫對植物的毒害作用[J]. 農(nóng)業(yè)災(zāi)害研究, 2012, 2(11-12): 20-21,27.

[15]FAN Hong-li, ZHOU Wei. Screening of Amaranth Cultivars (AmaranthusmangostanusL.) for Cadmium Hyperaccumulation[J].ScienceDirect, 2009, 8(3): 342-351.

[16]吳月燕, 陳賽, 張燕忠. 重金屬脅迫對5個常綠闊葉樹種生理生化特性的影響[J]. 2009, 23(5): 843-852.

[17]任安芝, 高玉葆, 劉爽. 鉻、鎘、鉛脅迫對青菜葉片幾種生理生化指標(biāo)的影響[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報, 2000, 6(2): 112 -116.

[18]劉春生, 史衍璽, 馬麗. 過量銅對蘋果樹生長及代謝的影響[J]. 植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報, 2000, 6(4): 451-456．

[19]楊世勇, 王方, 謝建春. 重金屬對植物的毒害及植物的耐性機(jī)制[J]. 安徽師范大學(xué)學(xué)報, 2004, 27(1): 70-74.

[20]方學(xué)智, 朱祝軍, 孫光聞. 不同濃度Cd 對小白菜生長及抗氧化系統(tǒng)的影響[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報, 2004, 23(5) : 877-880.

Effects of cadmium stress on physiological and biochemical characteristics inTagetespatulaL. [Asterales: Asteraceae]

ZHANGKai-kai,SUNYuan-yuan,XULing-ling,FENGXu-dong,GUANPing*

(CollegeofLifeSciences,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China)

Abstract:The effect of different concentrations of cadmium (Cd) (0, 50, 100, 200, 300 mg/kg) on the contents of chlorophyll and MDA and the activity of the antioxidant enzymes (SOD, CAT and POD) of the mature plant of Tagetespatula was studied through pot experiment. The results showed that the content of chlorophyll only slightly decreased at low concentration (50mg/kg) of Cd, however, with the concentration of Cd increasing, the content of chlorophyll significantly decreased.The content of MDA first decreased then increased to the maximum of 300mg/kg.With the concentration of Cd increasing, the contents of SOD, CAT and POD first increased then decreased.It is concluded that Tagetespatula has certain tolerance to Cd stress. The study provides the basis to explain plant recovery from heavy metal pollution.

Key word:Cadmium; TagetespatulaL; Chlorophyll; MDA; antioxidant enzymes

文章編號：1008-0457(2016)01-0086-04國際DOI編碼：15958/j.cnki.sdnyswxb.2016.01.019

中圖分類號：Q945.78

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

基金項目：貴州省社會發(fā)展攻關(guān)課題“鎘富集植物的篩選及修復(fù)技術(shù)研究”[黔科合SY自(2013)3137號]。通訊作者：關(guān)萍，女，博士，教授，主要研究方向：植物學(xué)、分子生物學(xué)及植物生物技術(shù)； E-mail:guanp@163.com。

收稿日期：2016-01-04；修回日期：2016-02-05