劉貴賢， 張明生， 李小蘭， 胡珊珊，韋紅邊，高曉峰

(貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 貴州 貴陽(yáng) 550025；山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴州 貴陽(yáng) 550025)

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適于懸浮培養(yǎng)的半夏疏松愈傷組織誘導(dǎo)及增殖技術(shù)

劉貴賢， 張明生*， 李小蘭， 胡珊珊，韋紅邊，高曉峰

(貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 貴州 貴陽(yáng) 550025；山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴州 貴陽(yáng) 550025)

摘要：用半夏葉片或葉柄作外植體，通過(guò)調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的種類、濃度及培養(yǎng)條件，以獲得適于懸浮培養(yǎng)的半夏疏松愈傷組織。結(jié)果表明，添加2,4-D較NAA誘導(dǎo)的愈傷組織疏松，將葉片接種于MS + 2,4-D 1.0 mg/L + 6-BA 1.5 mg/L + 蔗糖30 g/L + 瓊脂6 g/L或葉柄接種于MS + 2,4-D 1.0 mg/L + 6-BA 1.0 mg/L + 蔗糖30 g/L+瓊脂6 g/L上誘導(dǎo)出的愈傷組織長(zhǎng)勢(shì)較好且疏松，誘導(dǎo)率分別達(dá)到100%和95.6%，愈傷組織鮮重分別為0.932 g和0.622 g。將上述愈傷組織以MS + 2,4-D 2.0 mg/L + 6-BA 1.0 mg/L + 蔗糖30 g/L + 瓊脂6 g/L培養(yǎng)基連續(xù)繼代3次，便獲得適于建立細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系的疏松愈傷組織，從而為半夏人工種子生產(chǎn)必須的同步化高質(zhì)量人工種胚的培養(yǎng)提供可靠材料。

關(guān)鍵詞：半夏；愈傷組織；懸浮培養(yǎng)；植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)

半夏為天南星科多年生草本植物，是我國(guó)傳統(tǒng)重要中藥材之一。具有燥熱化痰、降逆止嘔等功效[1]。最新研究發(fā)現(xiàn)，半夏對(duì)于抗生育、降血脂以及冠心病的治療等均具有一定的療效[2-3]。由于近年來(lái)對(duì)野生半夏的掠奪性挖采以及環(huán)境因素的變化，致使其自然資源銳減，市場(chǎng)供需矛盾突出。人工種植是解決半夏市場(chǎng)需求的主要途徑，但長(zhǎng)期采用塊莖繁殖導(dǎo)致病害嚴(yán)重[4]、種質(zhì)退化[5-7]、產(chǎn)量下降[8-9]等一系列問(wèn)題。利用組織培養(yǎng)的方法培育半夏種苗、獲取無(wú)病毒植株、篩選優(yōu)良種質(zhì)等已有不少研究[10-13]。同時(shí)，半夏人工種子技術(shù)已成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)[14-19]，但半夏人工種子生產(chǎn)中人工種胚同步化及其分散的關(guān)鍵技術(shù)至今依然未能突破，其根本原因在于半夏疏松愈傷組織誘導(dǎo)較難，以至難以通過(guò)懸浮培養(yǎng)獲得單細(xì)胞或微細(xì)胞團(tuán)，故不能實(shí)現(xiàn)人工種胚的同步化，更談不上人工種子的產(chǎn)業(yè)化。本研究通過(guò)對(duì)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的種類、濃度及培養(yǎng)條件的篩選，建立了易于分散、增殖快速的半夏疏松愈傷組織培養(yǎng)體系，為獲得均一分散、高度同步化的半夏人工種胚提供優(yōu)質(zhì)材料，從而為實(shí)現(xiàn)半夏人工種子規(guī)?；a(chǎn)提供了可靠的技術(shù)保障，為半夏藥材產(chǎn)業(yè)化發(fā)展奠定了良好的基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

半夏Pinelliaternate(Thunb.) Breit.由貴州省赫章縣半夏藥材基地提供。

1.2研究方法

外植體處理：將半夏塊莖去皮后流水沖洗2 h，經(jīng)75%的酒精消毒45 s，無(wú)菌水沖洗3～5次，再用0.1%升汞消毒8 min，無(wú)菌水沖洗3～5次，無(wú)菌濾紙吸干表面水分，接種于添加6-BA 1.0 mg/L和IBA 0.1 mg/L的MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)無(wú)菌苗。選擇苗齡15 d的健壯幼苗，分別切取葉片(0.5 cm × 0.5 cm)、葉柄頂端或葉柄基部(0.5 cm)作為外植體，備用。

愈傷組織誘導(dǎo)：分別以葉片、葉柄頂端或葉柄基部作為外植體，接種于添加不同種類及濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的MS培養(yǎng)基上(表1)。其中，DB代表2,4-D與6-BA組合，NB代表NAA和6-BA組合。每個(gè)處理接種5瓶，每瓶接種3個(gè)外植體，重復(fù)3次。定期統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率及鮮重，同時(shí)考查愈傷組織的質(zhì)地。同時(shí)，接種后每隔3 d隨機(jī)抽5瓶稱量愈傷組織鮮重，以時(shí)間為橫坐標(biāo)、愈傷組織鮮重為縱坐標(biāo)，制作愈傷組織生長(zhǎng)曲線。

愈傷組織增殖：選取初代培養(yǎng)中相對(duì)疏松的愈傷組織進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)。以誘導(dǎo)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，調(diào)整2,4-D和6-BA兩因素水平(表2)，共6個(gè)處理，每個(gè)處理5瓶，每瓶接種1 g愈傷組織，重復(fù)3次，30 d后稱量愈傷組織鮮重。

培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基pH 5.8，培養(yǎng)溫度為(25±1)℃，光照強(qiáng)度1500～2000 lx，光照時(shí)間12 h/d。

數(shù)據(jù)處理：運(yùn)用DPS v 7.05和SPSS 20.0對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2結(jié)果與分析

2.1植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)半夏愈傷組織誘導(dǎo)的影響

不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)半夏愈傷組織的誘導(dǎo)率影響不大，但對(duì)愈傷組織鮮重及質(zhì)地卻有顯著影響(表1和圖1)。外植體接種7 d后，開始出現(xiàn)灰白色愈傷組織，繼續(xù)培養(yǎng)，觀察到DB組合誘導(dǎo)的愈傷組織逐漸轉(zhuǎn)為黃色或淡黃色，質(zhì)地較為疏松，無(wú)明顯分化現(xiàn)象；而NB組合誘導(dǎo)的愈傷組織逐漸轉(zhuǎn)為淡綠色進(jìn)而變?yōu)榫G色，質(zhì)地緊密，并出現(xiàn)分化現(xiàn)象。DB組合誘導(dǎo)的愈傷組織增殖速率稍慢于NB組合，但其所誘導(dǎo)的愈傷組織疏松程度均高于NB組合，且較適合于后續(xù)繼代培養(yǎng)，故DB組合誘導(dǎo)產(chǎn)生的疏松愈傷組織可作為懸浮培養(yǎng)獲得同步化高質(zhì)量人工種胚的材料；而NB組合所誘導(dǎo)的愈傷組織質(zhì)地緊密、呈綠色，更適于分化形成無(wú)菌苗。從表1可以看出，DB組合中的處理4和處理7的愈傷組織鮮重分別達(dá)到0.622 g和0.932 g，明顯高于其余處理。就誘導(dǎo)率而言，DB組合除葉柄基部外，其余均達(dá)到100%；從形成愈傷組織的量上看，葉柄頂端最差(圖1 A～C)，葉柄基部較好(圖1 D～F)，葉片形成愈傷組織最多(圖1 G～I(xiàn))，極差分析(表1)也證明了這一結(jié)果。在NB組合中，葉柄頂端形成愈傷組織有根的分化(圖1 J)，葉柄基部和葉片形成的愈傷組織有芽的分化(圖1 K和圖1 L)，且三者均形成質(zhì)地緊密的愈傷組織。

A～C: 葉柄頂端形成的愈傷組織(A: 2,4-D 1.0 mg/L + 6-BA 0.5 mg/L; B: 2,4-D 1.5 mg/L +6-BA 1.0 mg/L; C: 2,4-D 2.0 mg/L + 6-BA 1.5 mg/L; ); D～F: 葉柄基部形成的愈傷組織(D: 2,4-D 1.0 mg/L + 6-BA 1.0 mg/L; E: 2,4-D 1.5 mg/L + 6-BA 1.5 mg/L;F: 2,4-D 2.0 mg/L + 6-BA 0.5 mg/L; )；G～I(xiàn): 葉片形成的愈傷組織(G: 2,4-D 1.0 mg/L + 6-BA 1.5 mg/L; H: 2,4-D 1.5 mg/L + 6-BA 0.5 mg/L; I: 2,4-D 2.0 mg/L + 6-BA 1.5 mg/L;)；J～L: NB組合處理(J:葉柄頂端形成的愈傷組織；K:葉柄基部形成的愈傷組織；L:葉片形成的愈傷組織)?；九囵B(yǎng)基均為MS+ 蔗糖 30 g/L + 瓊脂 6 g/L.

圖1不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的效果

Fig.1Induction effects of different plant

growth regulators oncallus

2.2愈傷組織繼代培養(yǎng)時(shí)間的確定

以生長(zhǎng)健壯、幼嫩的半夏葉片作外植體，切成0.5 cm × 0.5 cm的小塊接種于MS + 2,4-D 1.0 mg/L + 6-BA 1.5 mg/L + 蔗糖30 g/L + 瓊脂6 g/L培養(yǎng)基上，定期觀測(cè)愈傷組織的誘導(dǎo)和生長(zhǎng)情況。從圖2可以看出，半夏葉片愈傷組織鮮重的增長(zhǎng)表現(xiàn)出慢-快-慢的變化，呈S型曲線。前18 d愈傷組織鮮重增長(zhǎng)緩慢，第18～36 d時(shí)增長(zhǎng)快速，36 d后增長(zhǎng)逐漸減慢。由于第27～30 d時(shí)愈傷組織增殖最快、疏松程度最高，故此階段為愈傷組織繼代培養(yǎng)的最佳時(shí)間。

圖2　半夏愈傷組織初代培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線Fig.2　Growth curve of callus primary culture

2.3半夏疏松愈傷組織增殖的條件及懸浮培養(yǎng)取材時(shí)間的確定

不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)半夏愈傷組織的增殖率、分化程度及質(zhì)地均有不同程度的影響。從表2可以看出，處理4增殖率(以鮮重表示)極顯著高于處理1、2、3、5，呈黃色疏松狀；處理6次之，呈淡黃色疏松狀。隨著繼代次數(shù)的增加，處理4愈傷組織逐漸表現(xiàn)出分化現(xiàn)象，而處理6愈傷組織的疏松程度逐漸增大。處理6愈傷組織連續(xù)繼代3次后變?yōu)樵鲋硺O快、顏色淡黃、光澤度好、質(zhì)地十分疏松的團(tuán)塊，易于分散為幾個(gè)細(xì)胞聚集的小顆粒，這是作為懸浮培養(yǎng)獲得同步化高質(zhì)量人工種胚的好材料。

表1　植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)半夏愈傷組織誘導(dǎo)的影響

續(xù)表1

處理號(hào)AB1C1B2C2愈傷組織誘導(dǎo)率(%)愈傷組織鮮重(g)愈傷組織質(zhì)地及顏色外植體2,4-D(mg/L)6-BA(mg/L)NAA(mg/L)6-BA(mg/L)DB組合NB組合DB組合NB組合DB組合NB組合K20.44570.28380.3903K30.49840.32010.5038R0.2580.29690.2133

注：表中不同小寫字母表示有顯著差異(P<0.05)。

表2　不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)半夏愈傷組織增殖的影響

注：表中不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)；“+”號(hào)數(shù)目表明愈傷組織分化程度。

3結(jié)論與討論

人工種子技術(shù)的出現(xiàn)為半夏規(guī)模化生產(chǎn)和種質(zhì)提純復(fù)壯帶來(lái)了希望，而人工種胚同步化培養(yǎng)是該項(xiàng)技術(shù)的核心，也是關(guān)系到人工種子規(guī)?；a(chǎn)能否實(shí)現(xiàn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。但迄今為止，半夏人工種胚同步化技術(shù)問(wèn)題仍未能解決，原因在于半夏愈傷組織質(zhì)地較為致密，很難通過(guò)液體懸浮培養(yǎng)得以均一分散，致使愈傷組織分化產(chǎn)生的小塊莖(人工種胚)緊緊連接在一起，制作人工種子時(shí)須通過(guò)手工剝離而難以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化高效生產(chǎn)。

本研究以半夏葉片或葉柄作外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，再通過(guò)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)配比及篩選愈傷組織繼代的適宜時(shí)期以獲得易于分散的疏松愈傷組織，最后在對(duì)疏松愈傷組織增殖速率和均一分散程度考查的基礎(chǔ)上確定懸浮培養(yǎng)的取材時(shí)間，從而為成功建立半夏同步化高質(zhì)量人工種胚培養(yǎng)技術(shù)必不可少的懸浮細(xì)胞系提供了保障，為實(shí)現(xiàn)半夏人工種子產(chǎn)業(yè)化奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

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Induction andmultiplication of loose callus ofPinelliaternata[Alismatales: Araceae} suitable for suspension culture

LIUGui-xian,ZHANGMing-sheng*,LIXiao-lan,HUShan-shan,WEIHong-bian,GAOXiao-feng

(CollegeofLifeSciencesGuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China;KeyLaboratoryofPlantResourcesConservationandGermplasmInnovationinMountainousRegion(MinistryofEducation),Guiyang,Guizhou550025,China)

Abstract:Using Pinellia ternata leaf or petiole as explants to obtain loose callus suitable for suspension culture by adjusting the concentrations of different plant growth regulators and the culture conditions. The results showed that the callus was looser in the media containing 2,4-D than that containing NAA. The induced callus grew better and looser when leaves were inoculated on the medium made of MS + 2,4-D 1.0 mg/L + 6-BA 1.5 mg/L + sucrose 30 g/L + agar 6 g/L, or petioles were inoculated on the medium consisted of MS + 2,4-D 1.0 mg/L + 6-BA 1.0 mg/L + sucrose 30 g/L-1+ agar 6 g/L. The induction rates were 100% and 95.6%, respectively, and the callus fresh weights were 0.932 g and 0.622 g, respectively. After these calluses were continuously cultured three more times in the medium of MS + 2,4-D 2.0 mg/L + 6-BA 1.0 mg/L + sucrose 30 g/L + agar 6 g/L, the loose calluses were suitable for establishing cell suspension culture system. These loose calluses become the reliable materials for the necessary synchronization of artificial seeds for high quality production of artificial embryo culture of Pinellia ternata.

Key words:Pinellia ternata; callus; suspension culture; plant growth regulator

文章編號(hào)：1008-0457(2016)01-0082-04國(guó)際DOI編碼：15958/j.cnki.sdnyswxb.2016.01.018

中圖分類號(hào)：Q945.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

*通訊作者：張明生，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向：植物生理生化與生物技術(shù)研究；E-mail: mszhang@guz.edu.cn。

基金項(xiàng)目：貴州省高層次創(chuàng)新型人才培養(yǎng)計(jì)劃(黔科合人才[2015]4031號(hào))；貴州省中藥現(xiàn)代化科技產(chǎn)業(yè)研究開發(fā)專項(xiàng)項(xiàng)目(黔科合中藥字[2011]5065號(hào))。

收稿日期：2015-12-12；修回日期：2016-01-25