蔡傳斌，吳玉俊，曹　寧，龔　露，吳擁軍

(貴州大學(xué) 農(nóng)業(yè)生物工程研究院，生命科學(xué)學(xué)院，山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025)

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煙草多酚氧化酶基因的克隆與序列分析

蔡傳斌，吳玉俊，曹寧，龔露，吳擁軍*

(貴州大學(xué) 農(nóng)業(yè)生物工程研究院，生命科學(xué)學(xué)院，山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025)

摘要：多酚氧化酶(PPO)在高等植物中廣泛存在，其利用分子氧催化氧化酚類(lèi)物質(zhì)為醌，對(duì)植物的抗蟲(chóng)和抗病起著一定的作用，同時(shí)它介導(dǎo)的酶促反應(yīng)也是烤制中煙草褐變的主要原因。本文采用RT-PCR，成功地從野生煙草(Nicotiana tabacum)葉片中克隆出了PPO cDNA序列。序列分析表明，煙草PPO基因ORF長(zhǎng)為1773 bp，編碼590個(gè)氨基酸，基因登陸號(hào)為KC540916，煙草與其他物種PPO的核苷酸序列與氨基酸序列同源性達(dá)80%以上，并包含兩個(gè)高度保守的銅離子結(jié)合區(qū)域。煙草PPO基因的克隆為煙草的抗性研究和褐化反應(yīng)的控制研究提供了良好的理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：煙草；多酚氧化酶；基因克隆；序列分析

多酚氧化酶((Polyphenoloxidase，PPO)是一類(lèi)廣泛存在于自然界，由核基因編碼的金屬氧化酶[1]。多酚氧化酶的特征是能利用分子氧催化酚類(lèi)物質(zhì)成為對(duì)應(yīng)的醌，廣義上的多酚氧化酶包括單酚單氧化酶(酪氨酸酶tyrosinase,EC.1.14.18.1)、雙酚氧化酶(兒茶酚氧化酶catecholoxidse,EC.1.10.3.2)和漆酶(laccase,EC.1.10.3.1) 三大類(lèi)，現(xiàn)在研究中所提及的多酚氧化酶主要指兒茶酚氧化酶和漆酶的統(tǒng)稱(chēng)。

酚類(lèi)物質(zhì)作為煙草的一種次生代謝產(chǎn)物，是煙草重要的香氣和吃味前體物，對(duì)成品煙葉的質(zhì)量有著重要影響，是衡量煙草品質(zhì)的重要指標(biāo)。作為決定酚類(lèi)物質(zhì)去向的關(guān)鍵酶，在煙草的調(diào)制過(guò)程中，PPO介導(dǎo)棕色化反應(yīng)，將綠原酸、蕓香苷等酚類(lèi)物質(zhì)氧化為黑褐色的醌類(lèi)物質(zhì)，使煙葉從黃色轉(zhuǎn)變?yōu)椴煌潭鹊暮稚玔2]。Johnson等[3]研究表明，如果煙葉顏色完全變?yōu)楹稚?，多酚?lèi)物質(zhì)就會(huì)減少85%。不僅會(huì)降低煙葉內(nèi)致香物質(zhì)的含量，還會(huì)直接影響成品煙葉的外觀質(zhì)量，使煙葉品質(zhì)下降[4]。此外，PPO介導(dǎo)的棕色化反應(yīng)還會(huì)使葉片變薄變輕，彈性變差，燃燒力變?nèi)?，降低煙葉的可用性直到其失去使用價(jià)值[5]。但是PPO在高等植物的生長(zhǎng)過(guò)程卻起著重要的抗病保護(hù)作用。其保護(hù)機(jī)制主要包括：(1)PPO的產(chǎn)物醌具有毒性，可直接發(fā)揮抗病作用；(2)通過(guò)產(chǎn)物醌共價(jià)結(jié)合氨基酸對(duì)昆蟲(chóng)和病原體形成抗?fàn)I養(yǎng)機(jī)制[6]；(3) 產(chǎn)物醌的次生反應(yīng)生成的黑色素沉積形成痂，封閉受到感染的組織，防止感染擴(kuò)散[7]；(4)產(chǎn)物醌促使腺毛狀體分泌粘性物質(zhì)并聚集在表皮形成一道物理防御。

本文利用GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中NicotianabenthamianapolyphenoloxidasemRNA(Accession:HQ245096)序列設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，成功的從野生煙草葉片中克隆出了PPO基因，希望通過(guò)研究PPO的超標(biāo)達(dá)或反義抑制，達(dá)到提高煙草抗蟲(chóng)性和品質(zhì)的目的。

1材料與方法

1.1材料與試劑

野生型煙草(Nicotiana tabacum)幼苗新鮮葉片組織。RNA提取試劑盒購(gòu)于北京天根生化科技有限公司；PrimeScriptTMOneStepRT-PCRKitVer.2、rTaq酶、dNTPs、10×PCRBuffer、T4DNA連接酶、DNAMaker、pGEM-T載體購(gòu)于寶生物工程大連有限公司；E.Z.N.A.TMGelExtractionKit、E.Z.N.A.TMPlasmidMiniKitI購(gòu)于美國(guó)Omega公司。

C1000TMThermalCyclerPCR儀、UniversalHoodII凝膠成像分析儀：Bio-Rad公司；1-15SartotiusSigma離心機(jī)：美國(guó)Sigma公司；DYY-7C電泳儀：北京市六一儀器廠。

1.2引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中NicotianabenthamianapolyphenoloxidasemRNA(Accession:HQ245096)序列，應(yīng)用DNAstar軟件設(shè)計(jì)特異性引物，上游引物序列：5’-ATGGCTTCTTCTTCTACGTTACC3’，下游引物序列為：5’-TTAACAATCGACAAGCTTAATCTC-3’，由寶生物工程大連有限公司合成，預(yù)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度在1800bp左右。

1.3總RNA提取

取新鮮的煙草葉片100mg，液氮迅速研磨，利用北京天根生化科技有限公司RNA提取試劑盒提取總RNA，于-80℃保存。將提取的總RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，選擇質(zhì)量較高，結(jié)構(gòu)完整的RNA為模板進(jìn)行目的基因的反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增。

1.4RT-PCR擴(kuò)增目的片斷

以煙草總RNA為模板，采用PrimeScriptTMOneStepRT-PCRKitVer.2試劑盒一步法直接擴(kuò)增目的片段，RT-PRC體系為50μl，10mM上下游引物各2μl，2×1StepBuffer25μl，PrimeScript1StepEnzymeMix2μl，RNA模板小于1μg；反應(yīng)程序?yàn)?0℃反轉(zhuǎn)錄30min，95℃ 預(yù)變性2min；然后95℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸90s，循環(huán)30次；最后72℃延伸10min。

1.5PPO基因的克隆與測(cè)序

回收純化RP-PRC產(chǎn)物，連接到pGEM-T載體，轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞。進(jìn)行菌落PCR與質(zhì)粒PCR驗(yàn)證后，選取陽(yáng)性菌液于寶生物工程大連有限公司測(cè)序。

1.6煙草PPO序列分析

利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)PPO基因的核苷酸序列和氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，利用DNAStar7.1、MEGA5、ClustalX1.81軟件分析氨基酸保守結(jié)構(gòu)域并繪制遺傳進(jìn)化樹(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1煙草PPO基因的RT-PCR擴(kuò)增

RT-PCR產(chǎn)物通過(guò)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，染色后經(jīng)UniversalHoodⅡ凝膠成像分析儀分析記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果如圖1所示，RT-PCR擴(kuò)增了出一條符合大小約1800bp的預(yù)期片斷。

2.2質(zhì)粒的重組與轉(zhuǎn)化

重組子菌落PCR與質(zhì)粒PCR驗(yàn)證結(jié)果如圖2所示，菌落PCR在約1800bp處出現(xiàn)特異性條帶，與RT-PCR擴(kuò)增目的DNA片斷條帶大小相符，即獲得了陽(yáng)性重組菌落。將陽(yáng)性重組菌落接種到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，進(jìn)行質(zhì)粒PCR驗(yàn)證，質(zhì)粒PCR獲得一條大小在1800bp左右的條帶，與RT-PCR和菌落PCR結(jié)果一致，證明目的基因已連接到pGEM-T質(zhì)粒上并已轉(zhuǎn)化成功。將提取的質(zhì)粒送往生物公司測(cè)序。

圖1　煙草PPO基因的RT-PCR擴(kuò)增

圖2　菌落PCR與質(zhì)粒PCR鑒定

2.3煙草PPO基因的同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析

測(cè)序結(jié)果表明，煙草PPO基因的大小為1773 bp，堿基組成：A 27.58%、G 21.94%、T 27.41%、C 23.07%，(G+C)%為45.01%，開(kāi)放閱讀框1773 bp，共編碼590個(gè)氨基酸，起始密碼子和終止密碼子分別位于序列兩端。將基因序列提交至美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center of Bio-technology Information，NCBI)，獲得登錄號(hào)KC540916。

將克隆得到的基因序列和推測(cè)的蛋白質(zhì)序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性分析，結(jié)果表明與NicotianabenthamianaPPO核苷酸序列高度同源，達(dá)到99%以上。在茄科植物中進(jìn)行同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與茄子(Solanummelongena)、番茄(Solanumlycopersicum)同源性最高，都達(dá)到81%以上，與其它科的物種比對(duì)時(shí)，發(fā)現(xiàn)與柿同源性達(dá)81%，與紫花苜蓿(Medicagotruncatula)同源性達(dá)75%，與橄欖(Oleaeuropaea)的同源性達(dá)74%；氨基酸序列與茄子、番茄、馬鈴薯(Solanumtuberosum)和柿同源性都在80%以上；結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，煙草PPO基因含有3段保守結(jié)構(gòu)域，包括漆酶中心結(jié)構(gòu)域(211氨基酸殘基)，多酚氧化酶中間域(71氨基酸殘基)和一個(gè)高度保守的C末端模體(PPO1_KFDV，132氨基酸殘基)。

利用PROSITE數(shù)據(jù)庫(kù)將克隆得到的序列進(jìn)行蛋白質(zhì)活性位點(diǎn)分析，發(fā)現(xiàn)煙草PPO基因存在著CuA和CuB，氨基酸序列為[HfswlFFpFHRwyLyfyE]和[DPlFYshHanvD]。在與其他物種的PPO進(jìn)行多序列比對(duì)時(shí)(圖3)發(fā)現(xiàn)，CuA與CuB高度同源，其中作為Cu配體的組氨酸高度保守，并且在CuA與CuB的前后出現(xiàn)了一段較為保守的氨基酸序列，推測(cè)可能是對(duì)CuA與CuB的三維結(jié)構(gòu)的形成起著維持和支撐的作用。

圖3　煙草與其他物種的氨基酸多序列比對(duì)

利用MegAlign軟件對(duì)煙草(Nicotianatabacum)、茄子(Solanummelongena)、西紅柿(L.esculentum，Solanumlycopersicum)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)、柿(Diospyroskaki)、橄欖(Oleaeuropaea)、棉花(Gossypiumhirsutum)、紫花苜蓿(Medicagosativa)、歐洲大葉楊(Populustrichocarpa)、蠶豆(V.faba)和克萊門(mén)柚(Citrusclementina)的PPO氨基酸序列進(jìn)行多序列同源比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖4)，結(jié)果表明PPO基因不同的科、屬之間呈現(xiàn)高度的保守性， 發(fā)育樹(shù)基本上與生物物種進(jìn)化樹(shù)一致。此外，分析發(fā)現(xiàn)柿PPO氨基酸序列與茄科植物高度同源，推測(cè)兩者可能存在相似的進(jìn)化機(jī)制。

圖4　煙草多酚氧化酶基因氨基酸序列進(jìn)化樹(shù)

2.4煙草PPO三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

使用SWISS-MODEL[8]對(duì)煙草PPO氨基酸序列進(jìn)行蛋白質(zhì)三維建模(圖5)，對(duì)比其數(shù)據(jù)庫(kù)中的模型發(fā)現(xiàn)，煙草PPO與Polyphenol oxidase模型和Catechol oxidase模型同源性最高，分別達(dá)到51.64%和52.37%。煙草PPO的三維模型顯示，CuA和CuB均處于蛋白分子的中心α-螺旋堆疊區(qū)域，作為Cu配體的兩個(gè)組氨酸殘基在空間上緊密相連。

圖5　煙草PPO蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)

3結(jié)論與討論

大多數(shù)植物PPO有多個(gè)編碼基因，如番茄就存在5個(gè)PPO編碼基因[9]，呈現(xiàn)出家族性。而Maria Helena[10]發(fā)現(xiàn)煙草的花PPO基因只在花的發(fā)育過(guò)程中特異性表達(dá)，在其他組織中不會(huì)表達(dá)。將克隆得到的煙草葉片PPO基因比對(duì)花PPO基因，發(fā)現(xiàn)其同源性在99%以上，煙草中的PPO基因是否也呈現(xiàn)出相似的家族性還待進(jìn)一步研究證明。

漆酶家族通常存在兩個(gè)Cu結(jié)合的保守區(qū)域(CuA和CuB)，CuA含有兩個(gè)保守的組氨酸殘基，定位在N末端，CuB含有一個(gè)保守的組氨酸殘基，是漆酶的活性中心位點(diǎn)[11]。這種Cu結(jié)合區(qū)域在節(jié)肢動(dòng)物與軟體動(dòng)物的血藍(lán)蛋白中也同樣存在，并被證明是分子氧的轉(zhuǎn)運(yùn)載體[12-13]。一般來(lái)說(shuō)高等植物的PPO都含有CuA和CuB，部分植物除這兩個(gè)Cu結(jié)合域之外還含有CuC[14]，CuA、CuB和CuC作為PPO的活性區(qū)域在不同的物種間都保持著高度的保守性，但在煙草和茄科的大部分植物的PPO中并未發(fā)現(xiàn)CuC，推測(cè)可能是在進(jìn)化過(guò)程中舍棄了該域。

PPO在植物的生長(zhǎng)過(guò)程中起到的抗性防御作用現(xiàn)在已被大多數(shù)研究者所肯定，其介導(dǎo)的褐化反應(yīng)是高等植物重要的非特異性免疫防線之一，但是在一些經(jīng)濟(jì)作物中卻影響著產(chǎn)品的質(zhì)量。在煙草中，PPO對(duì)煙草的烤制以及卷煙工業(yè)中的加工甚至貯藏都有著重要的影響[15]?，F(xiàn)階段主要是通過(guò)控制PPO的活性來(lái)抑制煙草烤制過(guò)程中的棕色反應(yīng)。包括調(diào)節(jié)溫度、pH、添加化學(xué)抑制劑等，但是這些手段不僅提高成本，而且對(duì)煙草質(zhì)量造成一定影響，目前較為成功的是利用煙垛密封降氧抑制酶促棕色化反應(yīng)的發(fā)生[16]，但是這對(duì)現(xiàn)有的煙草烤制工藝是一個(gè)重大挑戰(zhàn)。煙草PPO基因的克隆為煙草的抗性研究和褐化反應(yīng)的控制研究提供了良好的理論基礎(chǔ)。通過(guò)轉(zhuǎn)基因的形式來(lái)調(diào)節(jié)煙草葉片PPO抑制和表達(dá)，實(shí)現(xiàn)煙草抗性和質(zhì)量的統(tǒng)一還待進(jìn)一步研究。

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Cloning and Sequence Analysis of Polyphenol Oxidase Gene fromNicotianatabacum

CAI Chuan-bin, WU Yu-jun, CAO Ning, GONG Lu, WU Yong-jun*

(Key Laboratory of Plant Resource Conservation and Germplasm Innovation in Mountainous Region (Ministry of Education), Institute of Agro-bioengineering， College of Life Science, Guizhou University, Guiyang, Guizhou 550025, China)

Abstract：Polyphenol oxidases(PPO), catalyzing the oxygen-dependent oxidation ofphenols to quinines,areubiquitous among higher plantspecies, and assumedto beinvolved in plant defense against pests and pathogens.It had been proved to be the primary response for the deleterious browning of flue-cured tobacco. Nicotiana tabacum PPO gene had been successfully cloned by RT-PCR methodology. Sequence analysis indicated that the lengthof open reading frameof Nicotiana tabacum PPOgene was 1773bp, encoding 590 amino acids, which achieved the GenBankaccession numberNo.KC540916. Being blasted with NCBI Database, the PPO gene identities between Nicotiana tabacum and the relatives were higher than 80% both in nucleotide and amino sequences. Two copper-binding conserved domains were predicted. The cloning and sequence analysis of Nicotiana tabacum PPO gene could bring new clues for further explorations of tobacco plant-pest interactions and browning reaction.

Keywords:Nicotiana tabacum; Polyphenol Oxidase; Cloning; Sequence analysis

文章編號(hào)：1008-0457(2016)01-0057-05國(guó)際DOI編碼：15958/j.cnki.sdnyswxb.2016.01.012

中圖分類(lèi)號(hào)：Q751

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

*通訊作者：吳擁軍(1971-)，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要研究方向：植物分子生物學(xué)研究；E-mall:wyjbio@163.com。

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金“轉(zhuǎn)CHIFN-y煙草抗蟲(chóng)機(jī)制”(31071755/C1408)；煙草行業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題計(jì)劃“Ch1FN-y調(diào)控?zé)煵菹倜l(fā)育機(jī)制研究”(中煙辦[2014])。

收稿日期：2016-01-18；修回日期：2016-02-05