韓麗珍，鄧兆輝，朱春艷，梁彩嬌，韋德萍

(貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

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茶樹(shù)根際促生菌的篩選與促生特性的研究

韓麗珍*，鄧兆輝，朱春艷，梁彩嬌，韋德萍

(貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

摘要：從貴州地區(qū)的茶樹(shù)根際土壤中分離篩選出6株根際促生菌,經(jīng)16S rRNA基因分子鑒定，它們分屬于假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)、芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)、束村氏菌屬(Tsukamurella sp.)、伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia sp.)和根瘤菌屬(Rhizobium sp.)中。促生特性的研究結(jié)果顯示，溶磷解鉀性能最優(yōu)的菌株為GD-3菌株，固氮效能最高的KKS-6-N1菌株，此外6個(gè)菌株具有溶磷解鉀固氮、產(chǎn)IAA、產(chǎn)NH3、產(chǎn)HCN能力、可分泌嗜鐵素及具有ACC脫氨酶活性等多種促生性能，可作為研制微生物肥料的優(yōu)良菌株資源。

關(guān)鍵詞：茶樹(shù)；根際促生菌；促生特性

植物根際促生菌(plant growth-promoting rhizobacteria, PGPR)是指定植于植物根部系統(tǒng)并能促進(jìn)植物生長(zhǎng)的細(xì)菌。其促生機(jī)制主要包括：(1)細(xì)菌通過(guò)固氮酶的作用固定空氣中的氮?dú)?，為植物提供氮素營(yíng)養(yǎng)；(2)分泌有機(jī)酸，加速土壤中無(wú)效磷及難溶性鉀的釋放，從而增加土壤中游離P、K離子的含量，為植物提供營(yíng)養(yǎng)；(3)分泌植物激素，如吲哚乙酸(IAA)、細(xì)胞分裂素、赤霉素等，以促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育；(4)分泌嗜鐵素，不僅可與植物根際病原菌爭(zhēng)奪有限的鐵，抑制病原微生物生長(zhǎng)繁殖而起生物防治作用；而且能與土壤中的Fe3+螯合形成復(fù)合體后被植物吸收，改善植物的鐵營(yíng)養(yǎng)[1-2]； (5)具有ACC(1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸)脫氨酶活性，通過(guò)將植物乙烯的合成前體ACC分解成丁酮酸和氨來(lái)降低乙烯水平，從而增加植物抗逆能力[3-5]；(6)通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)生態(tài)位，產(chǎn)生抗生素、氫氰酸(HCN)等物質(zhì)，對(duì)植物病原菌具有抑制作用；(7)誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性(ISR)等[6]。多年來(lái)，研究者在水稻、甘蔗、玉米、小麥、高粱等作物和一些牧草上分離獲得很多PGPR菌株，對(duì)其固氮、溶磷、產(chǎn)生植物激素和抑病機(jī)理、菌肥研制等方面進(jìn)行了有益的探索[7]，而在茶樹(shù)等經(jīng)濟(jì)林木中的研究鮮有報(bào)道[8]。

貴州作為茶葉大省之一，迄止2011年茶種植面積為24.5萬(wàn)hm2，位居全國(guó)第二位[9]。到2014年底，全省茶園面積已達(dá)44.1萬(wàn)hm2，連續(xù)兩年排名全國(guó)第一[10]。近年來(lái)，貴州茶園氮磷流失及土壤酸化、土壤普遍缺磷缺鉀狀況明顯，有效磷和有效鉀的含量處于缺乏或很缺乏的均占到40%以上[11-15]。土壤中氮磷鉀含量對(duì)茶樹(shù)生長(zhǎng)及茶葉的產(chǎn)量品質(zhì)均有較大影響。因此，本文擬從貴州茶園根際土壤中分離、篩選出具有促生性能的菌株進(jìn)行研究，研究結(jié)果不僅可豐富植物促生菌資源，且可為茶樹(shù)微生物菌肥的研制及提高茶葉品質(zhì)產(chǎn)量奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1土樣采集

3份土壤樣本來(lái)源于貴州省遵義市寬闊水自然保護(hù)區(qū)茶園(107°9′E，28°13′N(xiāo))，分別標(biāo)為KKS-6、KKS-7及HSD6，該茶園種植茶樹(shù)約20-30年茶齡；1份土壤樣本采集自貴州大學(xué)茶園(106°32′E，26°17′N(xiāo))，標(biāo)為GD，茶樹(shù)茶齡約10年。分別取茶樹(shù)根際土壤裝入標(biāo)本袋中、置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2培養(yǎng)基

解鉀菌篩選及活性測(cè)定選用亞歷山大硅酸鹽培養(yǎng)基[16]，固氮菌篩選及活性測(cè)定用Ashby無(wú)氮培養(yǎng)基[17]，解磷菌篩選培養(yǎng)基參考趙小蓉等的方法配制[18]，CAS培養(yǎng)基按照榮良燕等的方法配制[19]，DF培養(yǎng)基和ADF培養(yǎng)基參考陳倩等的方法配制[20]。

1.1.3主要試劑及儀器

化學(xué)藥品均為國(guó)產(chǎn)分析純，Premix rTaq購(gòu)自TaKaRa，細(xì)菌DNA提取試劑盒購(gòu)自O(shè)mega，16S rRNA基因擴(kuò)增引物由TaKaRa合成，主要儀器為T(mén)HZ-82A氣浴恒溫振蕩器(江蘇普天，中國(guó))、GelDoc XRS+凝膠成像儀(Bio-Rad，USA)、S1000快速梯度PCR儀(Bio-Rad，USA)、759紫外分光光度計(jì)(上海菁華，中國(guó))等。

1.2方法

1.2.1菌株的分離與篩選

準(zhǔn)確稱取土壤10.0 g，加入帶玻璃珠并裝有90 mL無(wú)菌水的250 mL三角瓶中振蕩10 min后靜置，取上清液1 mL依次通過(guò)10倍倍比稀釋、分別獲得終濃度為10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的土壤懸液。利用涂布法將以上各濃度的土壤懸液分別涂布于解鉀固體培養(yǎng)基、解磷固體培養(yǎng)基和Ashby無(wú)氮固體培養(yǎng)基上，挑出有透明圈的菌落及具不同菌落形態(tài)的菌落進(jìn)行純化并保存。將純化的初篩菌株接種到相應(yīng)的篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，分別測(cè)定水解圈(D)和菌落直徑(d)。

1.2.2菌株的16S rRNA基因擴(kuò)增及分子鑒定

采用細(xì)菌DNA抽提試劑盒提取菌株總DNA。以細(xì)菌總DNA為模板，利用原核生物16S rRNA基因通用引物27f(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)和1492r(5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。25 μL反應(yīng)體系包括DNA模板1 μL，PCR Premix rTaq 12.5 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 9.5 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃ 5 min預(yù)變性；94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸90 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送上海英駿生物工程有限公司測(cè)序。所得的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)和EzTaxon數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST分析對(duì)比，選擇同源性較高模式菌株的16S rRNA基因序列，采用MEGA6.0軟件，用鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)、置信度經(jīng)Bootstrap法1000次重復(fù)檢驗(yàn)。

1.2.3菌株促生特性的研究

1.2.3.1解鉀活性的測(cè)定

將待測(cè)菌液按5%接種量接入50 mL解鉀液體培養(yǎng)基中、以加入等量無(wú)菌水的解鉀培養(yǎng)液為對(duì)照組，30℃ 100 rpm搖床振蕩培養(yǎng)5 d，設(shè)置3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)液的處理采用過(guò)氧化氫灰化法，用原子吸收法測(cè)定對(duì)照組及處理組中的水溶性鉀含量[21]。

1.2.3.2解磷活性的測(cè)定

將待測(cè)菌株的活化菌懸液1 mL接種入解磷液體培養(yǎng)基中，對(duì)照接入1mL無(wú)菌解磷培養(yǎng)液，置于28℃ 150 rpm搖床振蕩培養(yǎng)7 d；培養(yǎng)液經(jīng)10000 rpm離心10 min，取上清液用鉬銻抗分光光度法測(cè)定水溶性磷含量[22]。

1.2.3.3固氮效能的測(cè)定

在含1%葡萄糖的Ashby無(wú)氮培養(yǎng)基中加入待測(cè)菌懸液(OD6001.0)1 mL，以加入1 mL無(wú)菌水的為對(duì)照，置于30℃ 150 rpm搖床振蕩培養(yǎng)8 d后取出測(cè)氮定糖，設(shè)置3個(gè)重復(fù)；定糖采用蒽酮光電比色法，定氮采用柰氏比色法，固氮效能的測(cè)定參考成澤艷的方法[23]。

1.2.3.4產(chǎn)IAA能力的測(cè)定

以Salkowski法測(cè)定產(chǎn)吲哚乙酸的能力。將待測(cè)菌株接種于含有100 mg/L色氧酸(過(guò)濾除菌)的LB液體培養(yǎng)基中, 30℃ 180 rpm搖床培養(yǎng)1 d。取50 μL菌懸液滴于白色陶瓷板上，加入等量 Salkowski比色液；以加入50 mg/L吲哚乙酸的比色液作為陽(yáng)性對(duì)照。白色陶瓷板于室溫下避光放置30 min后觀察，顏色變紅者表明菌株可分泌IAA[24]。

1.2.3.5產(chǎn)NH3能力的測(cè)定

將菌株接到含10 mL蛋白胨水(10 g/L)試管中、28°C培養(yǎng)3 d后，每管加入0.5 mL Nessler's試劑，顏色由褐色轉(zhuǎn)為黃色則表明有NH3產(chǎn)生[25]。

1.2.3.6產(chǎn)HCN能力的測(cè)定

在NB培養(yǎng)基中添加4.4 g/L甘氨酸，將細(xì)菌劃線接種于該平板上，另將浸過(guò)2%碳酸鈉、0.5% 2,4,6-三硝基苯酚的Whatman 1號(hào)濾紙置于培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)4 d，濾紙顏色由橘黃色轉(zhuǎn)為紅色則表明有HCN產(chǎn)生[25]。

1.2.3.7產(chǎn)嗜鐵素能力的定性測(cè)定

利用CAS法測(cè)定產(chǎn)嗜鐵素能力。將CAS培養(yǎng)基劃分成若干等分,接種待測(cè)菌株(10 μL 106CFU/mL)，28°C培養(yǎng)2 - 3 d，如菌株周邊有黃綠色暈圈產(chǎn)生，即表明該菌株具產(chǎn)嗜鐵素能力[19,26]。

1.2.3.8ACC脫氨酶活性的定性測(cè)定

將待測(cè)菌株接入5 mL無(wú)氮液體培養(yǎng)基中，30℃ 200 rpm 振蕩培養(yǎng)1 d；吸取0.1 mL培養(yǎng)液接種至5 mL DF培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)1 d；按2%接種量轉(zhuǎn)接入5 mL ADF培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)2 d。能以ACC為唯一氮源生長(zhǎng)的菌株為 ACC 脫氨酶陽(yáng)性菌株[17]。

1.3數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用Excel 2010 和SPSS 軟件，多重比較采用LSD法。

2結(jié)果與分析

2.1菌株的分離篩選

4份茶園根際土樣經(jīng)選擇性培養(yǎng)基篩選后，在Ashby無(wú)氮培養(yǎng)基上獲得菌落形態(tài)明顯不同的2個(gè)菌株KKS-6-N1和KKS-7-N7。在解鉀培養(yǎng)基上獲得12個(gè)菌株(表1)，水解圈直徑/菌落直徑之比值2.0的為菌株GD-3和GD-12。在解磷培養(yǎng)基上獲得7個(gè)菌株(表2)，水解圈直徑/菌落直徑比值接近2.0的有KKS-6-P9和KKS-7-P10。將初篩獲得的6個(gè)菌株分別置于其余兩種選擇培養(yǎng)基上，發(fā)現(xiàn)菌株GD-3及KKS-7-N7還可以在解磷培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，且D/d比值為2.86和4.57；菌株GD-12、KKS-6-P9和KKS-7-P10還可在無(wú)氮培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。因而，確定GD-3、GD-12、KKS-6-N1、KKS-7-N7、KKS-6-P9和KKS-7-P10共6個(gè)菌株進(jìn)行促生特性的研究。

表1　茶樹(shù)根際土壤解鉀菌的初篩特性

表2　茶樹(shù)根際土壤解磷菌的初篩特性

2.2菌株的分子鑒定

根據(jù)擴(kuò)增的1.5 Kb片段長(zhǎng)度的菌株16S rRNA基因核苷酸序列，與相近屬種模式菌株的16S rRNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖1)，可初步鑒定KKS-6-N1為根瘤菌屬(Rhizobiumsp.)，菌株KKS-7-N7及GD-3為假單胞菌屬(Pseudomonassp.)，GD-12為芽孢桿菌屬(Bacillussp.)，KKS-6-P9為束村氏屬(Tsukamurellasp.)，KKS-7-P10為伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderiasp.)。

圖1　茶樹(shù)根際促生菌的16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 1　Phylogenetic tree based on the 16S rRNA sequences

2.3菌株促生特性的研究

2.3.1菌株的解鉀解磷活性及固氮效能

待測(cè)的6株菌株中，僅有GD-3和GD-12具有解鉀性能，接種GD-3與GD-12菌株的處理組中，水溶性鉀含量分別為3.970.52 mg/L、3.900.10 mg/L，而對(duì)照組僅為1.270.22 mg/L， 處理組水溶性鉀含量超過(guò)對(duì)照組的3倍以上。

除GD-12和KKS-6-N1菌株不能在解磷培養(yǎng)基上生長(zhǎng)外，將其余4個(gè)菌株置于解磷液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，測(cè)定發(fā)酵液中的有效磷含量(表3)，結(jié)果表明，處理組的水溶性磷含量均顯著高于對(duì)照組，且4個(gè)菌株之間并無(wú)顯著差異。

以往研究多采用乙炔還原法測(cè)定固氮酶活性來(lái)間接反映固氮菌的固氮作用，但其受環(huán)境因子、反應(yīng)容器體積及溫育時(shí)間、采樣方法、儀器及操作誤差等因素的影響[27]。固氮效能是指固氮菌每消耗1 g糖從空氣中固定氮素的毫克數(shù)[16]。本研究對(duì)6株待測(cè)固氮菌株進(jìn)行了固氮效能測(cè)定(圖2)，結(jié)果顯示KKS-6-N1固氮效能最高，高達(dá)12.51±0.34毫克氮/克糖；其余4株菌固氮效能均接近或高于5毫克氮/克糖。

圖2　6株茶樹(shù)根際促生菌的固氮效能

菌株GD-3KKS-7-N7KKS-6-P9KKS-7-P10對(duì)照組有效磷含量(mg/L)99.67±13.15b97.47±4.21b79.67±5.99b84.88±12.84b17.89±9.15a

注：表中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤。小寫(xiě)拉丁字母表示顯著水平α=0.05時(shí)多重比較(LSD法)結(jié)果。

2.3.2其他促生性能的定性測(cè)定

篩選獲得的6個(gè)菌株進(jìn)行了產(chǎn)IAA、產(chǎn)HCN、產(chǎn)NH3及分泌嗜鐵素的能力，是否具有ACC脫氨酶活性等涉及促生機(jī)理的定性研究。結(jié)果表明，僅KKS-7-N7具有產(chǎn)IAA能力；GD-12、KKS-6-P9和KKS-6-N1具有產(chǎn)HCN能力，而菌株KKS-7-N7由于培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生綠色色素而無(wú)法準(zhǔn)確判定。6株菌都具有產(chǎn)NH3的能力。除了GD-12外，GD-3、KKS-6-N1、KKS-7-N7、KKS-6-P9和KKS-7-P10等5個(gè)菌株具有分泌嗜鐵素的能力。除了KKS-6-N1和KKS-7-N7菌株外，其余4個(gè)菌株均具有ACC脫氨酶活性。

3結(jié)論與討論

本文從4份貴州地區(qū)茶園根際土壤中分離篩選到6個(gè)菌株，其中除菌株KKS-6-P9屬于放線菌門(mén)(Actinobacteria)、束村氏菌科(Tsukamurellaceae)、束村氏菌屬外，其余5個(gè)菌株均為細(xì)菌菌株，它們分屬于假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、伯克霍爾德氏菌屬和根瘤菌屬中，體現(xiàn)出根際促生菌的多樣性。

孫建光等[17]報(bào)道，類芽孢桿菌和芽孢桿菌為小麥、水稻、玉米、白菜及芹菜等作物根際及土壤中的固氮菌優(yōu)勢(shì)種群，部分菌株具有ACC脫氨酶活性，少數(shù)菌株具有抗病潛能。除GD-3外，本文篩選到的5個(gè)菌株均具有一定的固氮能力，且大多有ACC脫氨酶活性和產(chǎn)NH3能力；固氮效能最高的是根瘤菌屬KKS-6-N1菌株。已有研究表明，根瘤菌也可不形成根瘤而作為非豆科植物根際有益菌，促進(jìn)植物生長(zhǎng)[28]。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者分離的解鉀菌呈現(xiàn)多樣性，包括芽孢桿菌屬[29]、固氮菌屬(Azotobactersp.)、微桿菌屬(Microbacteriumsp.)、中華根瘤菌屬(Sinorhizobiumsp.)、根瘤菌屬(Rhizobiumsp.)、慢生根瘤菌屬(Mesorhizobiumsp.)、屈撓桿菌屬(Flexibactersp.)和假單胞菌屬等[30]。羅華元等人[31]篩選獲得34株具有解鉀能力的菌株，發(fā)酵液的水溶性鉀含量在0.4-10.6 mg/L之間。本研究中，解鉀菌GD-3與GD-12分屬于假單胞菌屬和芽孢桿菌屬，培養(yǎng)液中的水溶性鉀含量約4 mg/L，居于中等水平；2個(gè)菌株還具有ACC脫氨酶活性及其他促生潛能。

目前已報(bào)道的解磷菌包括細(xì)菌、真菌和放線菌，其中細(xì)菌最多，約20個(gè)屬，真菌約5個(gè)屬，放線菌中以鏈霉菌(Streptomycesspp.)居多[32-33]。本研究篩選到一株解磷菌株KKS-6-P9，屬于放線菌門(mén)、束村氏菌屬，該菌還具有產(chǎn)HCN、產(chǎn)NH3、產(chǎn)嗜鐵素及具ACC脫氨酶活性，這是首次發(fā)現(xiàn)該屬的菌株具有促生潛能。楊艷華等人[34]從茶樹(shù)根際篩選獲得23株解無(wú)機(jī)磷細(xì)菌，集中在Burkholderiasp.，Paenibacilluspolymyxa，Enterobactersp.和Bacillussp.，最大的解磷活性高達(dá)100 μg/mL。本文篩選的6株茶樹(shù)根際細(xì)菌中，有4株具有解磷特性，它們分屬于假單胞菌屬、伯克霍爾德氏菌屬和束村氏菌屬，這也與Bruto等[35]報(bào)道的大多數(shù)根際促生菌具解磷特性相符。

綜上所述，本研究從茶樹(shù)根際篩選到5株細(xì)菌菌株及1株放線菌，溶磷解鉀性能最優(yōu)的菌株為GD-3(Pseudomonassp.)，固氮性能最優(yōu)的菌株是KKS-6-N1(Rhizobiumsp.)，具有解鉀固氮性能的菌株為GD-12(Bacillussp.)，具有解磷固氮性能的菌株為KKS-6-P9(Tsukamurellasp.)、KKS-7-P10(Burkholderiasp.)和KKS-7-N7(Pseudomonassp.)；且多個(gè)菌株具有產(chǎn)NH3、產(chǎn)HCN、產(chǎn)IAA、產(chǎn)嗜鐵素及ACC脫氨酶的能力。以上篩選菌株均有多種促生特性，應(yīng)該具有一定的田間應(yīng)用潛力，促生機(jī)理的進(jìn)一步深入研究將為微生物菌肥的研制提供參考依據(jù)。

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Identification and Characterization of Plant Growth-promoting Rhizobacteria Isolated from Rhizosphere soils of Tea Trees

HANLi-zhen*,DENGZhao-hui,ZHUChun-yan,LIANGCai-jiao,WEIDe-ping

(CollegeofLifeSciences,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China)

Abstract:Based on sequence conservation of 16S rRNA, six strains of plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR), which isolated from rhizosphere soils of Guizhou tea trees, were identified as Pseudomonas sp., Bacillus sp., Tsukamurella sp., Burkholderia sp. and Rhizobium sp. GD-3 showed the most efficiency in phosphatesolubilization and potassium decomposition, and KKS-6-N1 had the most efficiency in nitrogen fixing. In addition, other growth-promoting characteristics, e.g. nitrogen fixation,IAA, NH3, HCNproduction,siderophore secretion and 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC) deaminase activity, were also investigated in these six strains, justifying their potentials for development ofbiological fertilizer as microbial resources in the future.

Keywords:Tea trees; Plant growth-promoting rhizobacteria; Growth-promoting characteristics

文章編號(hào)：1008-0457(2016)01-0051-06國(guó)際DOI編碼：15958/j.cnki.sdnyswxb.2016.01.011

中圖分類號(hào)：Q938.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

*通訊作者：韓麗珍，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要研究方向：環(huán)境微生物及微生物生態(tài)學(xué)；E-mail：hanlizhen11@163.com。

基金項(xiàng)目：貴州省大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目“貴州省茶樹(shù)根際促生菌的促生機(jī)理研究”(201510657041)。

收稿日期：2016-1-30；修回日期：2015-2-2