方　晨，張　釗，韋祥相，李賢梅，張小雪

(貴州大學 動物科學學院水產系，貴州 貴陽 550025)

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亮甲酚藍染色法評價斑馬魚卵母細胞體外成熟度的實驗研究

方晨，張釗，韋祥相，李賢梅，張小雪*

(貴州大學 動物科學學院水產系，貴州 貴陽 550025)

摘要：通過不同濃度亮甲酚藍(BCB)對斑馬魚卵母細胞進行染色，探討該方法用于判斷魚類卵母細胞成熟度的可行性，并利用該法對孕酮促斑馬魚卵母細胞體外成熟實驗中的卵母細胞成熟情況進行了判斷和分析。結果表明：(1)BCB染色法用于判斷魚類卵母細胞成熟度是可行的。(2)低濃度(1 nmol/L和10 nmol/L)孕酮處理6 h，對斑馬魚卵母細胞的成熟并無明顯促進作用，高濃度的孕酮(100 nmol/L和1000 nmol/L)不利于卵母細胞的成熟。(3)濃度為100 nmol/L的孕酮處理12 h，對卵母細胞成熟的促進作用顯著。

關鍵詞：亮甲酚藍(BCB)；斑馬魚；卵母細胞；孕酮

與傳統(tǒng)動物育種技術相比較，現代育種技術縮短了產生新品種的時間，對所要求的性狀具有明確的針對性，因此逐漸受到動物育種工作者的重視?，F代動物育種的生物技術包括胚胎工程技術、動物克隆技術、轉基因動物技術和電融合技術等，而在這些技術中常常需要成熟的卵母細胞用于實驗，為此卵母細胞體外成熟培養(yǎng)和成熟度的判斷已成為相關育種實驗中必須解決的問題之一，同時也是現代動物育種技術成功與否的重要前提。

目前，卵母細胞的體外培養(yǎng)技術研究多見于哺乳類，且技術相對成熟，如牛[1]、山羊[2]、豬[3]等，而關于水生脊椎動物魚類的卵細胞體外培養(yǎng)的研究還較少，僅見李書鴻等[4]對斑馬魚卵母細胞體外成熟條件進行的研究。

卵母細胞的成熟包括核成熟和細胞質成熟。對于卵母細胞成熟度的判斷，通常情況下是通過光學顯微鏡來觀察卵母細胞是否排除第一極體來作為核成熟的標準[5]，而在胞質成熟上，還沒有確切的評判標準。然而也有研究認為：線粒體重排和皮質顆粒遷移程度可作為卵母細胞質成熟的標志[6]。在傳統(tǒng)實驗中對魚類卵母細胞成熟度的判定往往是根據其形態(tài)學特征進行，如成熟的卵母細胞形態(tài)上表現為：生發(fā)泡破裂, 核仁消失, 紡錘體形成，染色質濃縮為染色體, 第一極體的排出等[7], 但是在實際應用過程中，該技術操作繁瑣，不易判斷卵母細胞的質量。

近年來，為了準確快速地判斷卵母細胞的成熟度，獲得高質量的實驗用卵母細胞，一種新的、無害方法——亮甲酚藍(BCB)染色法逐漸應用于多種動物卵母細胞的篩選[8]。亮甲酚藍(BCB)是一種生物染料，可被卵母細胞中的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶作用由藍色變?yōu)闊o色，故通過BCB染色可以篩選出已完成生長的即發(fā)育潛能較佳的卵母細胞。這一技術在小鼠、豬、牛、羊等多種哺乳動物的體外生殖技術上得到了成功應用[9-11]，而這一技術在魚類卵母細胞發(fā)育潛能篩選方面的應用，目前尚未見報道。本研究采用亮甲酚藍染色法，對經過孕酮誘導的卵母細胞的成熟度進行評估，目的是分析這種方法在判斷魚類卵母細胞成熟度的可行性以及該方法在孕酮促斑馬魚卵母細胞體外成熟實驗中的應用情況，為魚類的育種實驗提供參考依據。

1材料與方法

1.1藥品與試劑

17α-羥基孕酮(aladdin-e，上海)，膠原酶Ⅱ型(Solarbio，北京)，臺盼藍(genview，北京)，亮甲酚藍(源葉生物，上海)，青鏈酶素(Solarbio，北京)，二甲基亞砜(DMSO)( aladdin-e，上海)，DMEM培養(yǎng)液(Hyclone，美國)，氯化鈉等化學試劑為分析純試劑。

1.2主要儀器

解剖鏡(Olympus， SZ61型)，顯微鏡(Olympus， CH20型) ，超凈工作臺(蘇州凈化，SW-CJ-ID型)等。

1.3實驗材料

1.3.1 實驗用斑馬魚

實驗用斑馬魚購買于貴陽花鳥市場。飼養(yǎng)于實驗室養(yǎng)殖箱內，水源為曝氣24 h以上的自來水, 水溫(26±2)℃，自然光照飼養(yǎng)。每天早晚投喂飼料各一次。每天早上吸污并換水1/4，飼養(yǎng)一段時間后，視殘餌及水質而調整換水頻率。挑選腹腔飽滿，卵巢發(fā)育比較好的魚體用于實驗。

1.3.2 主要溶液配制

膠原酶消化溶液：準確稱量0.015 g膠原酶溶入1 mlDMEM培養(yǎng)液中配成15%的母液存放在-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。實驗用時把母液稀釋50倍配成0.3%的膠原酶溶液用于分解組織。

孕酮母液：準確稱量0.33 g羥基孕酮溶于10 ml二甲基亞砜中，配成0.1 mol/L的儲存液于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

臺盼藍溶液：準確稱量0.4 g臺盼蘭溶于10 ml 0.85%生理鹽水中配成4%母液存放在4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩嶒灂r用生理鹽水把母液稀釋10倍配成0.4%臺盼藍溶液用于細胞染色。

亮甲酚藍溶液：準確稱量0.166 g亮甲酚藍溶于10 ml0.85%生理鹽水水，配成0.05 mol/ L的母液于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。實驗時用生理鹽水稀釋成20 μmol/ L的濃度用于細胞染色。

1.4實驗方法

1.4.1卵母細胞獲取

從養(yǎng)殖箱中挑選腹腔飽滿的斑馬魚用于實驗。魚體秤重(1.25±0.18) g，稱重后把魚體放在解刨盤中，將左體壁全部剪去，用解剖鑷取出2側的卵巢，卵巢稱重(0.26 ±0.04)g。

卵巢稱重后放入青鏈霉素中涮洗1-2次，取出后放在載玻片上用解剖刀切割成大小相同的小段(每小段30-50個卵母細胞左右)，然后放入膠原酶溶液中在20℃環(huán)境下酶解20 min左右，用生理鹽水涮洗卵母細胞3-4次以除去剩余的膠原酶后，置DMEM培養(yǎng)液中室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2亮甲酚藍染色條件的篩選

設置10 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L、40 μmol/L、50 μmol/L、和60 μmol/L六個亮甲酚藍染色濃度，和六個染色時間(30 min，60 min，90 min，120 min，150 min)，用亮甲酚藍對斑馬魚卵母細胞進行染色，結合卵母細胞的顯微測量，比較染色效果, 挑選效果最佳的染色組合用于后續(xù)實驗。

1.4.3孕酮濃度和作用時間梯度的設置

取適量孕酮母液溶于二甲基亞砜(DMSO)中制成，用DMEM培養(yǎng)液稀釋成1 nmol/L，10 nmol/L，100 nmol/L和1000 nmol/L 4個濃度，以0 nmol/L作為對照組。將前述準備好的斑馬魚卵母細胞置不同濃度的孕酮溶液中于20℃溫度下培養(yǎng)。每次實驗要保證每種濃度有2份卵母細胞(一份用于臺盼蘭染色，一份用于亮甲酚藍染色)，培養(yǎng)時間分別為6 h，12 h，24 h。

1.4.4臺盼藍染色

經過不同時間孕酮培養(yǎng)后，取出一份用生理鹽水涮洗細胞3-4次后，加入臺盼藍溶液常溫下染色5 min，解剖鏡和顯微鏡觀察、拍照，并計算細胞的存活率。

1.4.5亮甲酚藍染色

經過不同時間孕酮培養(yǎng)后，取出另一份用生理鹽水涮洗細胞3-4次后，加入亮甲酚藍20℃溫度下染色150 min(避光)，用解剖鏡和顯微鏡觀察、拍照，并計算細胞的成熟率。

1.5統(tǒng)計分析

所有實驗重復3次以上，所得的實驗結果均采用Excel和SPSS 17.0進行分析，多組樣本均數比較采用單因素方差分析，實驗數據均以平均值±標準差表示。

2結果

2.1最佳亮甲酚藍染色條件

通過染色效果比較，并結合顯微測量結果進行分析，篩選出亮甲酚藍濃度在20 μmol/L、染色時間為150 min的染色效果最佳。(圖1)

圖1　亮甲酚藍染色的斑馬魚卵母細胞(10×10)Fig.1　Zebrafish oocytes stained by BCB

2.2孕酮處理后卵母細胞的存活率

臺盼藍染色鑒別細胞存活率(見圖2和表1)。

從表1可以看出，斑馬魚卵母細胞在不同濃度和不同時間孕酮處理后，存活率有一定波動，孕酮濃度10 nmol/L和100 nmol/L分別處理6 h和12 h后斑馬魚卵母細胞的存活率有一定的增加，但總體來說孕酮對卵母細胞的存活率影響不大。

圖2　臺盼藍染色的卵母細胞(10×10)Fig.2　Zebrafish oocytes stained by Trypan blue

孕酮濃度(nmol/L)孕酮處理時間(h)61224078.57±2.5377.98±1.3478.24±1.31178.95±5.2475.18±5.1881.00±1.001092.68±2.6488.60±1.1088.91±0.6710090.63±3.2782.98±0.6284.46±1.25100078.26±4.8378.93±6.7982.35±2.91

2.5孕酮處理后卵母細胞的成熟情況

從表2可以看出：孕酮濃度在1 nmol/L、處理6 h，孕酮對卵母細胞的成熟有一定的促進作用，但與對照組比較，差異不顯著性(p=0.403)；孕酮濃度在100 nmol/L、處理12 h，孕酮對卵母細胞成熟的促進作用顯著(p=0.008)。而100 nmol/L和1000 nmol/L孕酮濃度處理6 h，斑馬魚卵母細胞的成熟率反而下降明顯。在孕酮處理12 h和24 h，實驗組(除孕酮濃度在100 nmol/L、處理12 h)和對照組卵母細胞成熟率明顯低于各組孕酮處理6 h的成熟率，差異都顯著(p<0.05)。

表2　不同濃度孕酮處理不同時間后斑馬魚卵

注：a表示與對照組差異不顯著，b表示與對照組差異顯著，c表示與對照組差異極顯著，下同。

從表3可以看出：孕酮處理6 h，濃度在1-1000 nmol/L區(qū)間斑馬魚卵母細胞半成熟的比率隨孕酮處理濃度的增加而增加，在100 nmol/L和1000 nmol/L劑量組半成熟的卵母細胞比率分別達47.92%和56.48%左右，與對照組相比差異顯著(p<0.05)。而處理12 h和24 h，隨著孕酮濃度的增加，斑馬魚卵母細胞的半成熟率變化不明顯，各實驗組與對照組相比差異不顯著(p>0.05)。

表3　 不同濃度孕酮處理不同時間后斑馬魚卵母細胞的

3討論

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)是與卵母細胞能量代謝相關的一種酶，隨著卵母細胞的生長發(fā)育，其含量也在不斷變化。該酶在生長期的卵母細胞內活性很高，但在已完成生長的卵母細胞中活性下降。在本實驗中，亮甲酚藍對不同成熟度卵母細胞的染色，是隨著卵母細胞成熟度的加大而逐漸變深，呈現一個漸進的過程，而不是突變的一個過程。因此，我們以染色最深、且觀察不到細胞核的卵母細胞判為成熟卵細胞，而把呈較淺藍色的卵母細胞判為半成熟卵母細胞。這種判斷與卵母細胞的成熟過程相符，因為在卵母細胞的成熟過程中，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的活性呈現的是逐漸降低的過程，而不是表現為突然消失的現象。同時，實驗中我們通過測量染色后的卵母細胞的卵泡直徑，通過直徑大小來判斷卵母細胞的成熟情況[12]，發(fā)現與BCB染色后的判斷基本吻合。因此，BCB染色法對判斷魚類卵母細胞成熟度是可行的。

卵母細胞體外成熟(IVM)是指從卵巢中獲取未成熟卵，經過適宜的體外培養(yǎng)條件，卵母細胞發(fā)育成熟并具有受精和胚胎發(fā)育能力。影響卵母細胞體外成熟的因素有很多，比如采集方法，卵泡大小及卵母細胞形態(tài)，培養(yǎng)的溫度、時間、氣相環(huán)境、培養(yǎng)液及其 pH 值、激素等等。已有研究證明外源雌激素可以促進動物性腺發(fā)育[13]，但是外源激素的量和作用時間對于處于不同發(fā)育時期的卵母細胞的作用差異十分明顯。如本實驗結果所表現的情況：用孕酮培養(yǎng)6 h后，加入低濃度孕酮(孕酮濃度1 nmol/L和10 nmol/L)卵母細胞的成熟率和對照組相比變化不大，推測低濃度孕酮對斑馬魚卵母細胞的成熟并無明顯促進作用；但隨著孕酮濃度持續(xù)增加(孕酮濃度100 nmol/L和1000 nmol/L)，卵母細胞的成熟率和對照組相比反而有所下降且差異顯著，推測是高濃度的孕酮不利于卵母細胞的成熟。孕酮培養(yǎng)12 h和24 h后，對照組和大部分實驗組的卵母細胞成熟率與6 h相比，均下降明顯且差異極顯著，推測是培養(yǎng)時間過長，培養(yǎng)的環(huán)境發(fā)生了變化導致卵母細胞成熟率下降，具體原因有待進一步的研究。

上述研究表明，用亮甲酚藍染色來判斷魚類卵母細胞的成熟度，相對于其他的判斷方法，有便捷且能保持卵母細胞存活等優(yōu)勢，因此，可作為魚類卵母細胞現代育種技術的輔助手段。關于魚類卵母細胞體外成熟過程中孕酮的最佳用量和處理時間，估計與處理前卵母細胞的成熟度以及培養(yǎng)后期的環(huán)境有密切關系，如何根據體外成熟培養(yǎng)前卵母細胞的成熟情況進行外源激素孕酮的濃度調整，還有待進一步研究。

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An experimental study on the evaluation of thematurity of zebrafish oocytesin vitro using brilliant cresyl blue staining

FANGChen,ZHANGZhao,WEIXiang-xiang,LIXian-mei,ZHANGXiao-xue*

(AnimalScienceCollege,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China)

Abstract:The feasibility of the brilliant cresyl blue (BCB) staining method to determine the maturity of zebrafish oocytes in vitro was investigated by staining the zebrafish oocytes in different concentrations of BCB. The method was also used to determine and analyse the maturity of zebrafish oocytes in vitro promoted by progesterone. The results showed: (1)it is indeed feasible to employ BCB staining method to determine the maturity of the oocytes; (2)treatment in the low concentrations of progesterone (1nmol/L and 10nmol/L) for 6 hours had no significant effect on the maturation of zebrafish oocytes while the high concentrations of progesterone (100nmol/L and 1000nmol/L) were not suitable for the oocytes to mature; (3)the treatment in the concentration of 100nmol/L progesterone for 12 hours had significant effect in promoting the maturity of the oocytes.

Keywords:Brilliant cresyl blue (BCB); Zebrafish; Oocytes; Progesterone.

文章編號：1008-0457(2016)01-0009-05國際DOI編碼：15958/j.cnki.sdnyswxb.2016.01.003

中圖分類號:S917.4

文獻標識碼：A

*通訊作者：張小雪(1962-)，女，教授，主要研究方向：水產動物繁殖與發(fā)育生物學；E-mail：zhangxx508@163.com。

基金項目：貴州省優(yōu)秀科技教育人才省長專項資金[黔省專合字(2009)102號]；貴州大學引進人才科研項目[貴大人基合字(2007)003]。

收稿日期：2015-12-07；修回日期：2016-01-11