魯蕓蕓　潘躍龍　曹騏　鄧先寬　張勁松

【摘 要】本文使用經(jīng)典的稀釋涂布平板培養(yǎng)法建立檢測(cè)淤泥和濃縮液等放射性樣品中是否有微生物生長(zhǎng)的方法，主要檢測(cè)其中的細(xì)菌和真菌總數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，淤泥樣品中細(xì)菌總數(shù)范圍為105～106個(gè)/g，真菌總數(shù)范圍為10～103個(gè)/g；濃縮液樣品中均未檢出細(xì)菌和真菌。該方法可用于快速檢測(cè)放射性樣品中的細(xì)菌和真菌總數(shù)，對(duì)放射性廢物后處理與處置方法的生物評(píng)價(jià)具有重要的參考意義。

【關(guān)鍵詞】細(xì)菌總數(shù)；真菌總數(shù)；平板涂布；生化培養(yǎng)

【Abstract】This paper uses the classic dilution coating and plating culture to establish the detection method of whether microbes grew in the radioactive samples， such as sludge and concentrate， etc. and mainly detect the total number of bacteria and fungus. The experimental results show that， in sludge samples， the total number of bacteria range from 105 to 106 cfu/g， and the total number of fungus range from 10 to 103 cfu/g； In concentrate samples， no detection of bacteria and fungus. This method can be used for rapid detection of the total number of bacteria and fungus in radioactive samples， it has important reference value to biological assessment of radioactive waste treatment and disposal methods.

【Key words】Total number of bacteria； Total number of fungus； Dilution coating； Plating culture

0 前言

微生物中存在著一類腐蝕性微生物，其生長(zhǎng)和活動(dòng)嚴(yán)重影響著廢棄物的長(zhǎng)期處置。美國(guó)愛達(dá)荷國(guó)家工程與環(huán)境實(shí)驗(yàn)室（INEL）對(duì)商用低放廢物處置場(chǎng)中有代表性的土壤進(jìn)行取樣分析中發(fā)現(xiàn)，環(huán)境中普遍存在著氧化硫硫桿菌，這類自養(yǎng)菌在強(qiáng)堿性水泥固化廢物體表面上能形成生物膜，在代謝活動(dòng)中不斷釋放硫酸，影響固化體性能。M.A.Idachaba等檢驗(yàn)得出，微生物在接近或在廢物固化體表面的微環(huán)境活動(dòng)時(shí)，能不斷產(chǎn)生溶解性有機(jī)或無機(jī)酸，從而形成微量酸的點(diǎn)源并由此引起固化體基質(zhì)溶解和污染物的釋放。可見，廢物固化體在考察其包容能力的同時(shí)還要考察其承受微生物降解的能力。

微生物在冷樣品中的檢驗(yàn)方法已日趨成熟，而在放射性領(lǐng)域的檢測(cè)方法與研究尚未見報(bào)道。廣核大亞灣核電站的放射性廢水回收系統(tǒng)（SRE）和核取樣系統(tǒng)（RPE）中沉積了大量帶放射性的淤泥、以及廢液處理系統(tǒng)（TUE）中帶放射性的濃縮液，從安全、環(huán)保的角度出發(fā)，采用水泥固化技術(shù)處理這些放射性廢物。為保證水泥固化體的穩(wěn)定性，需檢驗(yàn)其中的微生物，而細(xì)菌總數(shù)和真菌總數(shù)是衡量樣品中是否有微生物存在的一項(xiàng)重要指標(biāo)。微生物個(gè)體極小，肉眼無法觀察，需經(jīng)過單細(xì)胞的生長(zhǎng)和繁殖，才便于觀察。因此，本文擬使用經(jīng)典的稀釋涂布平板法（dilution plating procedure）檢測(cè)來自廣核放射性淤泥和濃縮液樣品中細(xì)菌和真菌的菌落總數(shù)。該方法具有簡(jiǎn)便、快速、均勻以及便于計(jì)數(shù)的特點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1.1 樣品的預(yù)處理

由于放射性樣品較多，劑量較大，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)工作量大，而實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地有限，故采取分批取樣的方式。取樣工具均用滅菌處理過的試管、不銹鋼勺或移液管等，操作人員均戴上一次性醫(yī)用無菌手套和口罩，避免引入雜菌污染。分批采集新鮮的淤泥樣品適量（約1g）、濃縮液樣品1mL分別于6個(gè)滅菌的試管中，制作均勻的樣品懸液作為供試液：即分別加入無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至10mL，塞上滅菌塞子，在漩渦混合器上振蕩約10min，使淤泥均勻地分散在溶液中而成。分析樣品的詳細(xì)信息見表1：

1.2 培養(yǎng)基的制作

篩選適宜細(xì)菌生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，其配方為：蛋白胨10.0g，牛肉膏5.0g，NaCl 5.0g，瓊脂20.0g，蒸餾水1000mL；篩選適宜各類真菌生長(zhǎng)的改良馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基，其配方為：蛋白胨5.0g，葡萄糖10.0g，磷酸二氫鉀 1.0g，硫酸鎂0.5g，瓊脂18g，蒸餾水1000mL，1%孟加拉紅水溶液3.3mL。培養(yǎng)基經(jīng)高壓蒸汽滅菌后，加入1%鏈霉素液3mL（30μg/mL）。

細(xì)菌培養(yǎng)基和真菌固體培養(yǎng)基經(jīng)高壓蒸汽滅菌20min后，冷卻至50℃左右倒入培養(yǎng)皿，靜置冷卻成為平板，備用。

1.3 十倍稀釋法操作

將1.1步驟中的供試液靜置10min自然沉降，吸取1mL上清液至另一支無菌試管，并加無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至10mL，混勻，即稀釋10-1倍。如此連續(xù)稀釋，制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6等系列稀釋菌液。

1.4 平板涂布法操作

按濃度從低到高進(jìn)行涂布，分別吸取10-6的稀釋菌液0.2mL，加入到已編號(hào)的三個(gè)營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板和三個(gè)馬丁氏瓊脂平板上，用L型玻棒均勻涂布，靜置5～10min使稀釋菌液充分被平板吸收。然后依次進(jìn)行10-5、10-4、10-3、10-2、10-1的涂布實(shí)驗(yàn)。

陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)：細(xì)菌和真菌實(shí)驗(yàn)分別做2個(gè)平行空白對(duì)照，吸取0.2mL無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至平板，用L型玻棒涂布均勻，同理靜置。

1.5 恒溫生化培養(yǎng)

將1.4步驟涂布完成的營(yíng)養(yǎng)瓊脂固體平板倒置于恒溫細(xì)菌培養(yǎng)箱，在32℃條件下培養(yǎng)3天；同理將改良馬丁瓊脂固體平板倒置于恒溫真菌培養(yǎng)箱，在25℃條件下培養(yǎng)5天。

1.6 觀察及計(jì)數(shù)

待平板上菌落長(zhǎng)出后，先用肉眼觀察細(xì)菌和真菌菌落形態(tài)，拍照。然后點(diǎn)數(shù)菌落數(shù)，然后持放大鏡檢查有無遺漏，各平板計(jì)數(shù)后，求出同一稀釋級(jí)各平板生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)。

1.7 計(jì)算方法

2 結(jié)果和討論

2.1 稀釋涂布實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 細(xì)菌菌落的形態(tài)觀察

1）細(xì)菌稀釋度平行實(shí)驗(yàn)

各樣品的細(xì)菌菌落生長(zhǎng)狀態(tài)如圖1所示：陰性空白對(duì)照的兩個(gè)平板均未有雜菌生長(zhǎng)，故營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板正常，未被雜菌污染。SRE201BA、SRE001BA、SRE002BA和RPE003PS在低稀釋級(jí)涂布的3個(gè)平行平板生長(zhǎng)的菌落較多，但細(xì)菌總數(shù)隨著稀釋級(jí)的增高而相應(yīng)減少，在高稀釋級(jí)均無細(xì)菌生長(zhǎng)。9TUE001EU和L9TUE001EU中各平行稀釋級(jí)中均無細(xì)菌生長(zhǎng)。

2）細(xì)菌菌落的形態(tài)特征（圖2）

從圖2可知，細(xì)菌菌落形態(tài)各異，并帶有不同的顏色，說明淤泥中有多種類的細(xì)菌生存，并產(chǎn)生相應(yīng)的抗異性及適應(yīng)了淤泥的放射性環(huán)境。細(xì)菌菌落的形狀有圓形、不規(guī)則和點(diǎn)狀等；細(xì)菌的高度從側(cè)面觀察為隆起、突起以及平面狀；細(xì)菌菌落的邊緣形狀為波形、絲狀、卷曲狀、光滑。SRE001BA和SRE002BA的細(xì)菌菌落相似，菌落較大，菌落顏色有淡紅色、黃色、淡黃色和白色，而RPE003PS的菌落較小，菌落顏色有淡紅色、黃色和淡黃色。

2.1.2 真菌菌落的形態(tài)觀察

1）真菌稀釋度平行實(shí)驗(yàn)

在稀釋涂布實(shí)驗(yàn)中，6個(gè)樣品菌懸液的每個(gè)稀釋度作3個(gè)平行樣，并作兩個(gè)陰性空白對(duì)照。在25℃恒溫條件下培養(yǎng)5天后，真菌菌落生長(zhǎng)狀態(tài)如圖3所示：

從圖3可以觀察到，陰性空白對(duì)照的兩個(gè)平板均未有雜菌生長(zhǎng)，故改良馬丁氏瓊脂平板正常，未被雜菌污染。各樣品中檢出的真菌數(shù)量均較少，其中SRE001BA和SRE002BA平板生長(zhǎng)的菌落稍微比SRE201BA和RPE003PS多， 在稀釋級(jí)10-2以后均無真菌生長(zhǎng)。9TUE001EU和L9TUE001EU中各平行稀釋級(jí)中均無真菌生長(zhǎng)。

2）真菌菌落的特征（圖4）

從圖4可以看出，樣品中的真菌菌落形態(tài)各異，基本以霉菌為主，有菌落中心帶有粉色、墨綠色，淺綠色等不同的顏色，說明樣品中也有少量種類不一的真菌存在，并產(chǎn)生相應(yīng)的抗異性并適應(yīng)了淤泥和蒸殘液的放射性環(huán)境。真菌菌落的形狀有絨毛狀、規(guī)則發(fā)射葉狀等；真菌的高度從側(cè)面觀察為隆起、突起和褶皺狀；真菌菌落的邊緣形狀有波形、絲狀。

2.2 稀釋度選擇及菌落報(bào)告方式

根據(jù)6個(gè)樣品的細(xì)菌和真菌的稀釋度平行實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)生長(zhǎng)出的菌落，選擇細(xì)菌平均菌落數(shù)在30～300，真菌平均菌落數(shù)在30～100之間進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)結(jié)果如表2、表3所示：

從表2可知，淤泥樣品中均含有大量的細(xì)菌，SRE001BA、SRE002BA和RPE003PS的細(xì)菌總數(shù)均在106個(gè)/g的數(shù)量級(jí)范圍內(nèi)。9TUE001EU和L9TUE001EU均未檢出細(xì)菌；從表3可知，淤泥樣品中真菌含量較少，SRE201BA、SRE001BA和SRE002BA的真菌總數(shù)均在103的數(shù)量級(jí)范圍內(nèi)。9TUE001EU和L9TUE001EU均未檢出真菌。

3 結(jié)論

采用經(jīng)典的稀釋涂布平板培養(yǎng)法檢測(cè)來自于廣核淤泥和濃縮液等6個(gè)放射性樣品中是否有微生物生長(zhǎng)，主要以考察其中的細(xì)菌和真菌總數(shù)的方式進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，淤泥樣品中有大量的細(xì)菌和少量真菌存在，而濃縮液樣品中均無細(xì)菌和真菌生存。

該方法可用于快速檢測(cè)放射性樣品中的細(xì)菌和真菌總數(shù)，為后期在放射性廢物的固化處理中驗(yàn)證微生物活動(dòng)對(duì)廢物固化體完整性的影響提供實(shí)質(zhì)性的參考依據(jù)，對(duì)放射性廢物后處理與處置方法的生物評(píng)價(jià)具有重要的意義。

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[責(zé)任編輯：楊玉潔]