李　潔， 胡　進， 馬力天，3， 葉　欣， 南巖東， 吳大方*

(1解放軍第451醫(yī)院內分泌科，西安　710054； 2解放軍68222部隊衛(wèi)生隊； 3第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院中醫(yī)科暨中西醫(yī)結合腫瘤科； 4第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科； *通訊作者， E-mail：wudafangll@sohu.com；△共同通訊作者，E-mail：nanyandong2008@163.com

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S100A6基因過表達慢病毒載體的構建、轉染及鑒定

李潔1， 胡進2， 馬力天2，3， 葉欣1， 南巖東4△， 吳大方1*

(1解放軍第451醫(yī)院內分泌科，西安710054；2解放軍68222部隊衛(wèi)生隊；3第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院中醫(yī)科暨中西醫(yī)結合腫瘤科；4第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科；*通訊作者， E-mail：wudafangll@sohu.com；△共同通訊作者，E-mail：nanyandong2008@163.com

摘要：目的構建S100A6基因重組慢病毒質粒，經293T細胞包裝為重組慢病毒顆粒，并感染A549細胞，實現在細胞中高效、穩(wěn)定表達。方法PCR擴增S100A6基因序列，將目的基因與酶切線性化載體pLenO-DCE定向連接，轉化E.Coli DH5α感受態(tài)細胞，對陽性重組子進行DNA測序及比對。將構建成功的目的質粒和輔助包裝質粒共轉染293T細胞生產病毒液，熒光顯微鏡觀察報告基因在293T細胞中的熒光表達，判斷重組慢病毒的感染效率。用得到的病毒液轉染人肺腺癌A549細胞，real-time PCR和Western blot檢測轉染A549細胞后S100A6蛋白和S100A6 mRNA的表達。結果測序提示重組慢病毒質粒構建成功；熒光顯微鏡觀察顯示在包裝細胞中獲得較高的轉染效率。real-time PCR檢測顯示A549細胞中有S100A6 mRNA表達；Western blot顯示S100A6蛋白在A549細胞中穩(wěn)定表達。結論成功構建S100A6基因慢病毒表達載體，并成功感染A549細胞，實現在細胞中高效、穩(wěn)定表達，為S100A6基因功能及特性的研究和探索提供了實驗基礎。

關鍵詞：慢病毒載體；A549細胞；S100A6基因

S100A6是S100蛋白家族中的一員，這些成員廣泛參與了細胞增殖、遷移、運動和細胞周期的調節(jié)等過程。S100A6可能參與了鈣離子的代謝，并作為鈣調蛋白的結合蛋白[1-4]。研究表明，S100A6蛋白的表達在一些腫瘤細胞中是上調的，比如胃癌[5,6]，甲狀腺癌[7]，肝癌[8]，乳腺癌[9]等。S100A6可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要角色，尤其是在腫瘤細胞向周圍組織浸潤的過程中[5,10]。本實驗將構建S100A6基因慢病毒載體，轉染目的細胞后表達S100A6，為下一步分子機制的研究提供實驗參考。

1材料與方法

1.1主要試劑與儀器

pLenO-DCE Vector(中國Invabio公司，cat.No.#26208-2)，DL2000 DNA ladder(日本Takara)，瓊脂糖(中國賽百盛公司)，BamHⅠ(Takara公司)，MscⅠ(美國NEB公司)，SmiⅠ(SwaⅠ)(Takara)，NucleoBond Xtra Midi Plus(德國MACHEREY-NAGEL公司)，AxyPrep質粒小量制備試劑盒(美國Axygen公司)，制備感受態(tài)試劑盒(加拿大BIOSCIENCES)，包裝細胞293T細胞株(中科院上海細胞所)，大腸埃希菌DH5α(美國Invitrogen公司)，胎牛血清(美國PAA公司)，胰蛋白酶，A549人肺腺癌細胞系由Griad通過肺癌組織移植培養(yǎng)建系。實時熒光定量PCR儀(德國Eppendorf公司)，熒光倒置顯微系統(德國Leica公司)，超高速離心機(美國Beckman公司)，測序儀(Invitrogen公司)，穩(wěn)壓DNA電泳儀(美國BioRad公司)，凝膠成像儀(博迅儀器公司)。

1.2PCR擴增S100A6

參考GenBank中S100A6的cDNA編碼序列(NM_014624)設計引物，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。S100A6上游引物序列：5′-ATGGCATGCCCCCTGGAT-3′；下游引物序列：5′-TCAGCCCTTGAGGGCTTC-3′。以含有S100A6基因的cDNA庫為模板，擴增S100A6基因序列。PCR反應參數：94 ℃預變性2 min、98 ℃變性10 s、58 ℃退火30 s、68 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)；68 ℃保溫5 min。瓊脂糖凝膠電泳鑒定并分離產物，DNA凝膠回收試劑盒回收并純化S100A6片段。

1.3重組慢病毒質粒pLenO-DCE-S100A6載體構建

使用SmiⅠ對pLenO-DCE載體進行酶切，使其線性化。反應體系為：SmiⅠ(10 U/μl)1.5 μl，10×H Buffer 4.0 μl，BSA 0.4 μl，Plasmid DNA(500 ng/μl)15.0 μl，dH2O 19.1 μl；反應條件：25 ℃，4 h。將酶切產物過柱純化，瓊脂糖凝膠電泳并分離產物。pLenO-DCE載體和S100A6基因酶切產物進行連接反應，連接反應體系：pLenO-DCE載體DNA 1 μl，S100A6基因DNA片段1 μl，10×T4噬菌體DNA連接酶緩沖液1 μl，T4噬菌體DNA連接酶1 μl，dH2O 7 μl；反應條件：16 ℃，12 h。

1.4重組子的篩選與鑒定

常規(guī)操作方法轉化E.ColiDH5α感受態(tài)細胞，根據Axygen質粒抽提試劑盒方法抽提質粒。PCR擴增重組質粒，反應條件：94 ℃預變性2 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退化30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸6 min。產物瓊脂糖凝膠電泳，篩選陽性克隆條帶。對陽性pLenO-DCE-S100A6重組體使用BamH Ⅰ單切鑒定，反應體系：BamH Ⅰ(10 U/μl)0.5 μl，MscⅠ 0.5 μl，10×Buffer 2.0 μl，BSA 0.2 μl，Plasmid DNA(500 ng/μl)8.0 μl，ddH2O 8.8 μl，總溶液20 μl；反應條件：37 ℃，4 h。對陽性重組子進行DNA測序及比對。

1.5慢病毒顆粒包裝和濃縮

該慢病毒載體系統包括：pRsv-EV、pMDlg-pRRE、pMD2G、Transfer Vector，其中綠色熒光蛋白(GFP)被表達在慢病毒表達質粒中，前3個為病毒包裝所必需。對這4種質粒載體進行高純度無內毒素的抽提。取對數生長期的293T細胞，胰酶消化后接種于10 cm細胞培養(yǎng)皿(每個平皿接種細胞約為2×106-2.5×106)，置于37 ℃，50 ml/L CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。當細胞密度達60%-70%時進行轉染，將各質粒和磷酸鈣的混合液轉移至含單層細胞的培養(yǎng)液中，混勻，培養(yǎng)6-8 h后棄去該培養(yǎng)液，加入PBS 15 ml，輕搖后棄去，重復3次。更換培養(yǎng)基，每瓶細胞中加入含10 %FBS的細胞培養(yǎng)液5 ml，培養(yǎng)48 h；收集轉染后72 h的293T細胞上清液，于4 ℃，4 000×g離心10 min，收集離心后的上清液，將上清液以0.45 μl濾器過濾；于40 ml超速離心管中，4 ℃，25 000 r/min離心2 h；而后以冰PBS液或DMEM重懸病毒沉淀，4 ℃溶解過夜。

1.6慢病毒的滴度測定

選用逐孔稀釋滴度測定法，首先293T細胞進行鋪板，使用96孔板，每個孔中加1×105個細胞，體積為100 μl。準備7-10個無菌EP管，在每個管中加入90 μl的新鮮培養(yǎng)基；向第一個管中加入待測定的病毒原液10 μl，混勻后，取10 μl加入到第二個管中。然后進行相同的操作直到最后一管；選取所需的細胞孔，吸去90 μl培養(yǎng)基并加入稀釋后的病毒溶液。培養(yǎng)24 h，加入新鮮培養(yǎng)基100 μl。繼續(xù)培養(yǎng)96 h，熒光顯微鏡觀察其生長狀況，取0.1 μl pLenO-DCE-S100A6慢病毒感染的293T細胞，應用流式細胞儀檢測陽性細胞比率，并計算病毒滴度。

1.7病毒感染人肺腺癌A549細胞

將人肺腺癌A549細胞培養(yǎng)于含100 g/L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，取對數生長的A549細胞接種于6孔板中，待細胞生長融合約60%進行轉染。共分為3組：空白對照組(NC組)、空質粒轉染(GFP組)轉染只攜帶GFP而不攜帶目的基因的空載質粒、目的基因質粒轉染組(pLenO-DCE-S100A6組)轉染攜帶目的基因及GFP的質粒。

1.8real-time PCR檢測A549細胞S100A6 mRNA表達

篩選后的細胞加入1 ml TRIzol，按照Trizol說明書提取RNA，測定總RNA的純度，將RNA逆轉錄為cDNA，以適量cDNA為模板，在TaqDNA聚合酶催化PCR擴增。S100A6上游引物：5′-ATGGCATGCCCCCTGGAT-3′，下游引物為：5′-TGAGGGCTTCATTGTAGATC-3′；β-actin上游引物為：5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′，下游引物為：5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3′。擴增條件為：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)35次，72 ℃保溫10 min，Bio-Rad CFX Manager 2.0軟件分析實驗數據。

1.9Western blot檢測A549細胞S100A6蛋白表達

以細胞裂解液裂解篩選后的細胞，提取細胞總蛋白，測定蛋白的濃度，灌制12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠，常規(guī)電泳，轉膜，封閉，一抗(博士德，PB0716)(1∶200)，4 ℃孵育過夜，二抗(1∶2 000)，室溫孵育2 h，化學熒光發(fā)光法顯色。

1.10統計學分析

應用SPSS13.0軟件進行統計學分析，不同組間S100A6相對表達量采用Studentt檢驗分析，以P<0.05表示差異具有統計學意義。

2結果

2.1PCR擴增S100A6基因

PCR成功擴增出S100A6序列DNA片段，電泳可見大小約250 bp的特異性條帶(見圖1)。

圖1　PCR擴增S100A6基因產物凝膠電泳結果Figure 1　Gel electrophoresis of the PCR product

2.2重組質粒pLenO-DCE-S100A6 PCR擴增鑒定

pLenO-DCE-S100A6重組質粒PCR擴增，得到大小約270 bp陽性克隆(見圖2)。

1，2，4-6，8.pLenO-DCE-S100A6；3.陰性對照(ddH2O)； 7.空載體對照(pLenO-DCE)；9.陽性對照(GAPDH)；M.Marker圖2　pLenO-DCE-S100A6重組質粒PCR擴增產物凝膠電泳分析Figure 2　Gel electrophoresis analysis of the PCR products of recombinant plasmid

2.3pLenO-DCE-S100A6陽性克隆測序

pLenO-DCE-S100A6的陽性克隆由南京金斯瑞生物科技有限公司測序，測序結果與克隆模板序列比對完全一致(圖3)。

2.4慢病毒制備及滴度測定

pLenO-DCE-S100A6共轉染293T細胞后24 h，熒光顯微鏡觀察示細胞發(fā)出綠色熒光，48 h細胞內綠色激發(fā)熒光表達明顯增強。取0.1 μl pLenO-DCE-S100A6慢病毒感染的293T細胞，應用流式細胞儀檢測陽性細胞比率，計算得出病毒滴度為2.1×109TU/ml。

2.5A549細胞轉染后S100A6 mRNA表達

real-time PCR檢測顯示，pLenO-DCE-S100A6組較NC組和GFP組具有更高的S100A6 mRNA的表達；pLenO-DCE-S100A6組與NC組和GFP組之間差異均有統計學意義(P<0.01)，而NC組和GFP組之間差異無統計學意義(P>0.05)。

圖3　pLenO-DCE-S100A6陽性克隆測序結果(第1-100堿基序列)Figure 3　The pLenO-DCE-S100A6 sequencing of the positive clones (bases sequence from 1 to 100)

圖4　pLenO-DCE-S100A6慢病毒感染的293T細胞熒光表達檢測 (×100)Figure 4　GFP expression in 293T cells 24 h and 48 h after infection (fluorescent microscope×100)

與NC組比較，*P<0.01；與GFP組比較，#P<0.01圖5　A549細胞轉染后S100A6 mRNA表達結果Figure 5　The mRNA expression of S100A6 gene in A549 cells

2.6A549細胞轉染后S100A6蛋白表達

Western blot檢測結果顯示pLenO-DCE-S100A6組較NC組和GFP組具有更高的S100A6 蛋白表達(見圖6)。

3討論

S100A6為S100蛋白家族成員之一，可能參與了鈣離子的代謝[11]，并與細胞周期、細胞分化、增殖等活動相關[9,12]。S100A6在多種腫瘤細胞中表達異常，可以通過影響鈣離子和一些信號通路如Wnt/β-Catenin等來調控腫瘤細胞[9]。

圖6　A549細胞轉染后S100A6蛋白表達結果Figure 6　The protein expression of S100A6 gene in A549 cells by Western blot

化療是治療腫瘤的重要手段，其主要作用在于抑制原發(fā)病灶的復燃和癌癥的轉移。然而，由于多重耐藥(multiple drug resistance，MDR)的產生，使化療效果大打折扣，達不到預期的效果。因此深入研究腫瘤細胞耐藥的機制十分重要。有研究表明[13]，S100A6與腫瘤細胞的耐藥性有關，在胃癌細胞中，S100A6的低表達會使胃癌細胞的耐藥性上升。S100A6與腫瘤細胞耐藥性的關系極為復雜，與Ca2+關系較為密切[14]，低表達的S100A6蛋白會增加細胞內游離Ca2+，解除對MDR1的抑制，MDR1基因能編碼一種膜轉運蛋白—P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)，該蛋白具有泵的作用，可以將細胞內的藥物泵出到細胞外，是MDR發(fā)生的重要機制[15]。

經典的Wnt信號通路與腫瘤的發(fā)生有密切聯系[16]，異常激活的Wnt信號通路導致beta-Catenin在細胞質內大量聚集，并進入細胞核，啟動下游靶基因的轉錄，促進細胞增殖，誘導腫瘤的發(fā)生。S100A6與Wnt信號通路有著密切的聯系，在多種腫瘤細胞中，高表達的S100A6和beta-Catenin常同時存在[17]，S100A6可以直接與beta-Catenin相互作用，抑制beta-Catenin降解，這可能是導致beta-Catenin在細胞質內大量聚集的原因之一[18]。此外，S100A6在鈣周期素結合蛋白(CacyBP/SIP)核轉位的調節(jié)中起重要作用[19]，CacyBP/SIP的核轉位可促進腫瘤細胞增殖[20]，高表達的S100A6可以與CacyBP/SIP結合，調節(jié)CacyBP/SIP的核轉位，進而在腫瘤的發(fā)展中發(fā)揮重要作用[21]。

慢病毒作為載體可提高轉染效率，可以實現穩(wěn)定轉染。本實驗通過基因釣取方法從基因文庫中獲取S100A6基因，成功構建S100A6基因慢病毒載體，并成功地轉染了A549細胞，為后續(xù)分子生物學研究提供參考。

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Construction, transfection and identification of S100A6-gene-overexpressed lentivirus vector

LI Jie1, HU Jin2, MA Litian2，3, YE Xin1, NAN Yandong4△, WU Dafang1*

(1DepartmentofEndocrinology, 451thHospitalofPeople’sLiberationArmy,Xi’an710054,China;2MedicalCropsof68222ofPLA;3DepartmentIntegratedTraditionalandWesternMedicineofOncology,TangduHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity;4DepartmentofRespiratoryDiseaseandCriticalCareUnit,TangduHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity:*Correspondingauthor,E-mail:wudafangll@sohu.com；△Co-correspondingauthor,E-mail:nanyandong2008@163.com)

Abstract：ObjectiveTo construct the S100A6-gene-overexpressed lentivirus vector and investigate the expression of S100A6 in human lung adenocarcinoma cell line A549 after transfection. MethodsThe sequence of S100A6 was amplified by PCR，and then subcloned into pLenO-DCE vector with infusion technique to generate pLenO-DCE-S100A6. The PCR products of recombinant plasmid were analyzed by gel electrophoresis and the positive clones were confirmed by sequencing. After the cotransfection of pLenO-DCE-S100A6, green fluorescent protein(GFP) expression was observed to evaluate the gene delivery efficiency in 293T cells. Finally, the virus produced by 293T cells was transfected into A549 cells. S100A6 protein and mRNA expression in A549 cells was detected by Western blot and real-time PCR. ResultsDNA sequencing confirmed that the recombinant lentivirus plasmid was successfully constructed.Recombinant lentiviruses were successfully produced in 293T cells. The expression of S100A6 and S100A6 mRNA were successfully detected in A549 cells.ConclusionThe recombinant lentivirus plasmid is successfully constructed and S100A6 is expressed in A549 cells stably，which establishes the basis on the further molecular function study of S100A6.

Key words:lentiviral vector;A549 cell;S100A6 gene

[收稿日期：2015-09-21]

作者簡介：李潔，女，1978-09生，碩士，主治醫(yī)師.

中圖分類號：Q78

文獻標志碼：A

文章編號：1007-6611(2016)02-0127-05

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.02.006

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81001040);第四軍醫(yī)大學優(yōu)秀文職人員基金資助項目(2011-01);第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院后備人才基金資助項目(5033)