付　俊，羅艷云，繆時英，王琳芳

中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所　北京協(xié)和醫(yī)學院基礎學院　醫(yī)學分子生物學國家重點實驗室

生物化學與分子生物學系，北京 100005

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·論著·

小鼠睪丸中細胞連接相關蛋白質的分析

付俊，羅艷云，繆時英，王琳芳

中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所北京協(xié)和醫(yī)學院基礎學院醫(yī)學分子生物學國家重點實驗室

生物化學與分子生物學系，北京 100005

摘要：目的探討細胞連接相關蛋白在不同發(fā)育階段小鼠睪丸中的表達模式。方法Western blot檢測并分析1～6周齡小鼠睪丸、原代支持細胞以及小鼠精原細胞系GC1 spg、精母細胞系GC2 spg、間質細胞系TM3、支持細胞系TM4等4種生殖相關細胞系中細胞連接相關蛋白的表達水平。結果小鼠睪丸曲細精管中支持細胞間細胞連接相關膜蛋白連接黏附分子A、緊密連接蛋白Occludin和Claudin，以及支持細胞-生精細胞間細胞連接相關膜蛋白連接黏附分子C、連接蛋白Nectin- 3和鈣黏附蛋白E的表達表現(xiàn)出明顯的階段特異性。而參與細胞連接的調節(jié)蛋白緊密連接蛋白ZO- 1、ZO- 2、Afadin、β鏈蛋白和CD2相關蛋白在睪丸的不同發(fā)育階段以及生殖細胞系中表達無差異。結論小鼠睪丸曲細精管中支持細胞間以及支持細胞-生精細胞間細胞連接相關的膜蛋白多表現(xiàn)出明顯的階段特異性。而參與細胞連接的調節(jié)蛋白在睪丸的不同發(fā)育階段中表達無差異。

關鍵詞：血睪屏障；支持細胞間連接；支持細胞-生精細胞間連接；膜蛋白；調節(jié)蛋白

ActaAcadMedSin，2016,38(2)：205-209

在小鼠睪丸曲細精管中，支持細胞為包括精原細胞、精母細胞和精子細胞在內(nèi)的生精細胞提供營養(yǎng)并精細調控著各級生精細胞的發(fā)育，相鄰的支持細胞通過建立血睪屏障形成免疫屏障，將機體的免疫系統(tǒng)和精子抗原分隔開，避免發(fā)生自身免疫性疾病同時保證精子發(fā)生所需的微環(huán)境。在特定的時間，支持細胞間的血睪屏障打開，由精原細胞分化而來的早期精母細胞從近基底的小室越過血睪屏障遷移至近管腔的小室，精母細胞在靠近管腔的小室發(fā)生減數(shù)分裂并進一步發(fā)育為成熟的精子[1]。支持細胞間建立的血睪屏障由緊密連接和包括基底外質特化的錨定連接等多種細胞連接組成，支持細胞-生精細胞間形成頂部外質特化的錨定連接[2]。當睪丸先天發(fā)育受損或受到外界環(huán)境刺激，支持細胞間或者支持細胞-生精細胞間連接的相關蛋白質可能發(fā)生改變。參與支持細胞間細胞連接蛋白質早已被學者廣泛研究，比如膜蛋白連接黏附分子A、緊密連接蛋白Occludin和Claudin等；支持細胞和精子細胞間的細胞連接分子包括膜蛋白連接黏附分子C、連接蛋白Nectin- 3和鈣黏附蛋白E等。膜蛋白鈣黏附蛋白N同時參與到兩種細胞連接中。膜內(nèi)調節(jié)蛋白緊密連接蛋白(zonula occludens，ZO)- 1、ZO- 2、Afadin、β鏈蛋白和CD2相關蛋白(CD2-associated protein，CD2AP)與膜蛋白相互作用廣泛的調節(jié)多種細胞連接[3]。本研究擬在小鼠睪丸中分析上述多種細胞連接相關蛋白質的表達規(guī)律。

材料和方法

材料C57健康雄性小鼠購自維通利華公司。兔抗緊密連接蛋白ZO- 2、CD2相關蛋白、Afadin、鈣黏附蛋白E和β鏈蛋白抗體購自CST公司。兔抗緊密連接蛋白ZO- 1、連接黏附分子A、緊密連接蛋白Occludin抗體，膠原酶Ⅰ，透明質酸酶購自Invitrogen公司。羊抗連接蛋白Nectin- 3抗體和兔抗鈣黏附蛋白N抗體購自Santa Cruz公司。兔抗連接黏附分子C、緊密連接蛋白Claudin 1和Claudin 11抗體購自Abgent公司。兔抗微管蛋白Tubulin抗體購自Bioworld公司。小鼠精原細胞系GC1 spg、精母細胞系GC2 spg、間質細胞系TM3、支持細胞系TM4購自美國模式菌種收集中心，由實驗室保存。

小鼠睪丸的分離將小鼠斷頸處死，打開腹腔，取下睪丸，用磷酸緩沖液洗1次，迅速放入凍存管并置于液氮。

小鼠睪丸支持細胞的分離新鮮的3周齡小鼠睪丸，剝?nèi)グ啄び诹姿峋彌_液中洗2遍，膠原酶Ⅰ中消化2次。DMEM/F12完全培養(yǎng)基終止消化。加入磷酸緩沖液，自然沉降后去上清，重復2～3遍。沉淀轉移至細胞培養(yǎng)皿，剪碎組織，加入透明質酸酶消化。800×g 離心5 min，去上清，細胞沉淀用DMEM/F12培養(yǎng)基重懸接種至細胞培養(yǎng)皿中，于37℃孵箱中培養(yǎng)，24 h后換液。換液24 h后低滲處理[4]。

Western blot檢測樣品中蛋白質的表達樣品電泳后轉PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，洗膜后封入酶標二抗孵育1～2 h，洗膜并顯色。

結果

小鼠睪丸中細胞連接相關膜蛋白的表達在1～6周小鼠睪丸中，支持細胞間細胞連接相關膜蛋白的表達模式多有不同(圖1A)。連接黏附分子A在小鼠幼年期睪丸中表達量較高，2周齡時達到峰值。緊密連接蛋白Occludin與連接黏附分子A明顯不同，小鼠幼年期睪丸中基本不表達，至4周齡睪丸開始表達并逐漸增加。緊密連接蛋白Claudin 1和Claudin 11主要在1～2周齡小鼠睪丸中表達。Claudin 1在1周齡睪丸中最多，而Claudin 11在2周齡時大量表達。鈣黏附蛋白N在1～6周齡小鼠睪丸中均有表達，1周齡時表達量略多。支持細胞-生精細胞間細胞連接相關蛋白質的表達模式也有特異性(圖1A)。連接黏附分子C從2周齡小鼠睪丸中開始表達，并隨周齡逐漸增加。連接蛋白Nectin- 3在幼年期睪丸中基本不表達，4周齡中開始明顯表達并隨睪丸發(fā)育增加。鈣黏附蛋白E在幼年期小鼠睪丸中表達較多，3周齡后表達逐漸減少。

小鼠睪丸中細胞連接相關調節(jié)蛋白的表達在1～6周齡小鼠睪丸細胞連接相關調節(jié)蛋白中，緊密連接蛋白ZO- 1和ZO- 2在各周齡表達比較均等，Afadin在2～4周齡小鼠睪丸中表達輕微增加，β鏈蛋白和CD2相關蛋白在1～3周齡小鼠睪丸中表達輕微增加(圖1B)。

小鼠睪丸原代支持細胞中細胞連接相關蛋白質的表達從3周齡小鼠睪丸中分離原代支持細胞，并用特定的marker SOX9確定。在原代支持細胞中，檢測到支持細胞間細胞連接相關的膜蛋白包括連接黏附分子A、緊密連接蛋白Claudin 11和鈣黏附蛋白N以及調節(jié)蛋白包括緊密連接蛋白ZO- 1、ZO- 2、Afadin、β鏈蛋白、CD2相關蛋白均有表達，其中連接黏附分子A、緊密連接蛋白Claudin 11和β鏈蛋白表達量較大，而膜蛋白包括緊密連接蛋白Occludin和Claudin 1未檢測到表達(圖2A、2B)。在原代支持細胞中，支持細胞-生精細胞間細胞連接相關的膜蛋白只有鈣黏附蛋白E表達，連接黏附分子C和連接蛋白Nectin- 3無表達(圖2A、2B)。

JAM：連接黏附分子；ZO：緊密連接蛋白；CD2AP：CD2相關蛋白；Mr：相對分子質量；1～6：1～6周小鼠睪丸JAM：junctional adhesion molecule；ZO：zonula occludens；CD2AP：CD2-associated protein；Mr：relative molecular mass；1- 6：1- 6-week mouse testes

A.細胞連接相關膜蛋白的表達；B. 細胞連接相關調節(jié)蛋白的表達

A. expressions of membrane proteins associated with cell junctions；B. expressions of adaptor proteins associated with cell junctions

圖 11～6周小鼠睪丸中細胞連接相關蛋白質的表達

Fig 1Expressions of proteins associated with cell junctions in 1- 6-week mouse testes

小鼠生殖細胞系中細胞連接相關蛋白質的表達在小鼠生殖細胞系GC1、GC2、TM3和TM4中，膜蛋白包括鈣黏附蛋白N以及調節(jié)蛋白緊密連接蛋白ZO- 1、ZO- 2、Afadin、β鏈蛋白和CD2相關蛋白在4種細胞系中均有表達，連接黏附分子A在GC1細胞系中有表達，支持細胞間膜蛋白包括緊密連接蛋白Occludin、Claudin 1和Claudin 11在4種細胞系中無表達(圖2C、2D)。支持細胞-生精細胞間細胞連接相關的膜蛋白連接黏附分子C、連接蛋白Nectin- 3和鈣黏附蛋白E在4種細胞系中無表達 (圖2C、2D)。

討論

小鼠出生后，睪丸需進一步發(fā)育并成熟，16 d時小鼠睪丸支持細胞間出現(xiàn)與血睪屏障有關的細胞連接復合物，至20 d左右支持細胞間血睪屏障形成[3]，血睪屏障成熟后睪丸中生精細胞才能發(fā)生減數(shù)分裂，大量的生精細胞不斷增加使睪丸中支持細胞的比例隨睪丸發(fā)育而降低，因此3周齡是分離原代支持細胞的最佳周齡。有研究顯示小鼠1周齡睪丸中支持細胞比例占到3/4，2周齡時下降至37%，3周齡下降至28%，成年后僅有3%[5]。因此，在不同發(fā)育階段的小鼠睪丸樣品中，部分細胞連接相關蛋白可能因睪丸發(fā)育中支持細胞的比例降低而相對減少。本研究主要探討參與支持細胞間細胞連接的膜蛋白包括連接黏附分子A、緊密連接蛋白Occludin、Claudin 1、Claudin 11和鈣黏附分子N，參與支持細胞-生精細胞間細胞連接的膜蛋白包括連接黏附分子C，連接蛋白Nectin- 3和鈣黏附蛋白E，膜內(nèi)調節(jié)蛋白包括緊密連接蛋白ZO- 1、ZO- 2、Afadin、β鏈蛋白和CD2相關蛋白在小鼠睪丸不同發(fā)育階段的表達模式。

緊密連接蛋白Occludin是第1個被發(fā)現(xiàn)存在于緊密連接處的膜蛋白，有4個跨膜結構，臨近細胞的細胞連接處，兩個細胞的Occludin的胞外環(huán)區(qū)相互結合形成復合物[6]。Occludin敲除小鼠不育，但幼年期睪丸未發(fā)現(xiàn)異常[7]。雖然4周齡后小鼠睪丸中支持細胞的比例不斷降低，但本研究顯示Occludin主要在4周齡以后的小鼠睪丸中表達，表明其主要發(fā)揮作用于成熟后的支持細胞的細胞連接中，這與Occludin敲除小鼠幼年期睪丸發(fā)育正常呼應。

Tes- 3：3周齡睪丸；Tes- 5：5周齡睪丸；SC：原代支持細胞；GC1：精原細胞系GC1 spg；GC2：精母細胞系GC2 spd；TM3：間質細胞系；TM4：支持細胞系

Tes- 3：3-week testes；Tes- 5：5-week testes；SC：primary sertoli cells；GC1：spermatogonia cell line GC1 spg；GC2：spermatocyte cell line GC2 spg；TM3：leydig cell line；TM4：sertoli cell line

A、C.細胞連接相關膜蛋白的表達；B、D.細胞連接相關調節(jié)蛋白的表達

A，C. expressions of membrane proteins associated with cell junctions；B，D. expressions of adaptor proteins associated with cell junctions

圖 2原代小鼠睪丸支持細胞和生殖相關細胞系中細胞連接相關蛋白質的表達

Fig 2Expressions of proteins associated with cell junctions in primary sertoli cells and in reproductive related cell lines

膜蛋白連接黏附分子JAM胞外區(qū)含有兩個免疫球蛋白樣的環(huán)，定位于上皮細胞或者內(nèi)皮細胞間的緊密連接處[8]。緊密連接蛋白Claudin有4個跨膜結構，其表達和定位受包括激素和炎癥因子等很多因素的調節(jié)[6]。Claudin 11敲除小鼠睪丸支持細胞間的緊密連接消失并且小鼠不育[6]。在血睪屏障處，連接黏附分子A或者Claudin均與調節(jié)蛋白緊密連接蛋白ZO- 1和ZO- 2相互作用并被后兩者調節(jié)[3]。本研究顯示連接黏附分子A、緊密連接蛋白Claudin 1和Claudin 11在幼年期睪丸即血睪屏障建立早期表達量較高，提示三者在血睪屏障的建立中發(fā)揮重要功能。在原代分離的支持細胞中，連接黏附分子A和Claudin 11的表達量顯著高于小鼠睪丸，可能因二者高表達于睪丸支持細胞中，在支持細胞被分離純化后，連接黏附分子A和緊密連接蛋白Claudin 11兩個蛋白也相對被富集。

鈣黏附蛋白N主要定位于支持細胞間的細胞連接處，在一些特定時期還定位于支持細胞-生精細胞間的細胞連接處，而鈣黏附蛋白E大量定位于生精細胞中[7]。鈣黏附蛋白-鏈蛋白復合物對于鈣黏附蛋白Cadherin介導的細胞黏附是必需的。在睪丸中，鏈蛋白定位于支持細胞間的血睪屏障處以及支持細胞與精原細胞或者精母細胞的細胞連接處[6]。CD2相關蛋白在睪丸曲細精管支持細胞間的細胞連接處與鈣黏附蛋白N、β鏈蛋白和緊密連接蛋白ZO- 1等相互作用。CD2相關蛋白敲除小鼠血睪屏障被破壞，并導致精子發(fā)生障礙[9]。β鏈蛋白和CD2相關蛋白在1～3周齡小鼠睪丸中表達量相對于后期略高，可能因睪丸發(fā)育過程中支持細胞的比例逐漸降低有關。

連接黏附分子C表達于發(fā)育中的圓形和長形精子中，定位于支持細胞-精子細胞的細胞連接處。在連接黏附分子C敲除小鼠中，成熟的精子細胞消失，表明其在精子發(fā)生中有必要的功能[8，10]。與連接黏附分子C類似，連接蛋白Nectin- 3表達于長形精子中，定位于支持細胞- 生精細胞的細胞連接處[7]。Nectin- 3敲除小鼠中精子細胞的極性缺失[8]。Afadin與Nectin在胞內(nèi)形成復合物，并調節(jié)其功能。在支持細胞-生精細胞間細胞連接中Afadin與Nectin- 3相互作用[11]。本研究顯示隨著睪丸發(fā)育，連接黏附分子C和Nectin- 3依次開始表達。連接黏附分子C和Nectin- 3主要由支持細胞-精子細胞連接處的生精細胞表達，因此在分離的原代睪丸支持細胞中未檢測到表達。

本研究顯示參與細胞連接的調節(jié)蛋白在睪丸的不同發(fā)育階段以及生殖細胞系中表達基本均衡。而不論是支持細胞間還是支持細胞-生精細胞間細胞連接相關的膜蛋白多表現(xiàn)出明顯的階段特異性，并且這些膜蛋白在生殖細胞系中基本不表達，提示這些膜蛋白的表達受到精細的調控，同時需要睪丸微環(huán)境的調節(jié)。細胞連接相關蛋白多與器官發(fā)育和生育力密切相關[12]，本研究結果為深入了解精子發(fā)生過程中細胞連接相關蛋白的作用提供了重要信息。

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Expression Patterns of the Proteins Associated with Cell Junctions in Mouse Testes

FU Jun，LUO Yan-yun，MIAO Shi-ying，WANG Lin-fang

State Key Laboratory of Medical Molecular Biology，Department of Biochemistry and Molecular Biology，Institute of Basic Medical Sciences Chinese Academy of Medical Sciences & School of Basic Medicine Peking Union Medical College，Beijing 100005，China Corresponding author：WANG Lin-fangTel：010- 69156418，E-mail：wang.linfang@imicams.ac.cn

ABSTRACT：ObjectiveTo study on the expression patterns of proteins associated with cell junctions in the developing mouse testes. MethodThe expression levels of reproductive related cell lines spermatogonia cell line GC1 spg，spermatocyte cell line GC2 spg，leydig cell line TM3，and sertoli cell line TM4, primary sertoli cells,and 1- 6-week mouse testes were analyzed using Western blot. ResultsThe sertoli cell junction-associated membrane proteins adhesion molecule A，Occludin and Claudin，and the sertoli-germ cell junction-associated membrane proteins junctional adhesion molecule C，Nectin- 3，and E-cadherin were stage-specific in the seminiferous tubules in the mouse testes. The adaptor proteins associated with cell juctions zonula occludens- 1，zonula occludens- 2，Afadin，β-catenin，and CD2-associated protein were not stage-specific in the seminiferous tubules in the mouse testes. ConclusionsIn the seminiferous tubules in the mouse testes，the membrane proteins associated with cell junctions are stage-specific. However，the expressions of adaptor proteins associated with cell junctions do not obviously change.

Key words：blood-testis barrier；sertoli cell junctions；sertoli-germ cell junctions；membrane proteins；adaptor proteins

(收稿日期：2015- 09- 15)

DOI：10.3881/j.issn.1000- 503X.2016.02.014

中圖分類號:Q249

文獻標志碼:A

文章編號：1000- 503X(2016)02- 0205- 05

通信作者：王琳芳電話：010- 69156418，電子郵件：wang.linfang@imicams.ac.cn

基金項目：國家自然科學基金青年科學基金(31401273)和國家重大科學研究計劃(2012CB944902)Supported by Grand for the Youth from National Natural Science Foundation of China(31401273)and the National Important Research Plan of China(2012CB944902)