閔友江,姚海華,程立紅

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艾條懸灸腎俞、關元對腎陽虛大鼠垂體-腎上腺軸和垂體-甲狀腺軸的影響

閔友江,姚海華,程立紅

(江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院,南昌 330006)

目的 觀察艾條懸灸對腎陽虛大鼠垂體-腎上腺軸和垂體-甲狀腺軸的影響。方法 以氫化可的松肌肉注射制作皮質(zhì)酮腎陽虛動物模型,將大鼠隨機分成模型對照組、艾灸治療組,并設立空白對照組,艾灸治療組采用艾條懸灸腎俞、關元,每次每穴20 min,每日1次,共治療14次;治療結束后采用ELISA方法檢測各組大鼠血清CORT、ACTH、T3、T4、TSH的含量,采用RT-PCR方法檢測垂體ACTH、TSH mRNA的表達。結果 與模型對照組比較,艾灸治療組血清CORT無顯著性差異(＞0.05),血清ACTH、T4、TSH和垂體ACTH、TSH mRNA均具有顯著性差異(＜0.05),血清T3具有極顯著性差異(＜0.01);與空白對照組比較,艾灸治療組上述各指標均無顯著性差異(＞0.05)。結論 艾條懸灸腎俞、關元通過降低血清TSH的含量,下調(diào)垂體TSH mRNA的表達和升高血清ACTH、T3、T4的含量,上調(diào)垂體ACTH mRNA的表達對腎陽虛大鼠起治療作用。

艾條灸;腎陽虛;垂體-腎上腺軸;垂體-甲狀腺軸;大鼠

艾灸因具有溫經(jīng)散寒、溫腎助陽、升陽固脫等作用而廣泛應用于臨床,有報道顯示艾灸治療腎陽虛型女性性功能障礙和男子精子活力低下等疾病取得了良好療效[1-5]。為進一步研究艾灸治療腎陽虛證的機制,本實驗以氫化可的松肌肉注射制作皮質(zhì)酮腎陽虛模型大鼠為研究對象,觀察艾條懸灸腎俞、關元對腎陽虛模型大鼠血清CORT、ACTH、T3、T4、TSH含量和垂體ACTH、TSH mRNA表達的影響,現(xiàn)將研究內(nèi)容報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

24只SD雄性大鼠,體重(220±20)g,由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供,合格證號為SCXK (湘)2011-0003,清潔級,標準配方桿狀飼料喂養(yǎng),自由進水。所有大鼠適應性飼養(yǎng)3 d后開始實驗。

1.2 實驗器材

酶標儀(芬蘭Labsystems Multiskan MS公司);洗板機(芬蘭Thermo Labsystems公司);移液器(吉爾森P型移液器Pipetman);旋渦振蕩器(上海青浦瀘西儀器廠);低溫冷凍離心機[Sigma(3K15)公司];Real-time檢測儀[ABI(ABI-7300)公司];艾條(江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院特制,直徑4 mm,長度12 mm)。

1.3 實驗試劑

氫化可的松注射液(天津金耀氨基酸有限公司,規(guī)格含量為5 mL/25 mg,批準文號為國藥準字H12020886); CORT、ACTH和T3、T4、TSH酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(上海博谷生物科技有限公司);Trizol(Nvitrogen公司); SYBR Green PCR試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo公司); RNaseⅠ(Fermentas公司)。

1.4 造模

參照文獻[6]制作動物模型,每只大鼠按照0.03 mg/g·bw劑量肌注氫化可的松,每日1次,連續(xù)10 d。并采取自然光照、自由進食及飲水。模型成功判斷標準為造模的大鼠體重減輕、毛發(fā)失去光澤、弓背、扎堆、反應遲鈍、活動減少、陰囊皺縮、尿量明顯增多。

1.5 處理方法

在確認模型成功的基礎上,將模型大鼠按照信封隨機法分為兩組,每組8只,另外設立空白對照組8只。共3組。艾灸治療組穴位定位根據(jù)《實驗針灸學》[7]取關元、腎俞(雙);從第11天起開始艾灸治療。治療前預先剪去穴位處的毛發(fā),用江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院特制的艾條懸于關元、腎俞穴上,先回旋灸2 min預熱局部皮膚,再固定于上述穴位施行溫和灸,實施者將食指放于穴位附近,以有溫熱感為宜。艾條懸灸20 min,每日1次,7次為1個療程,療程間隔休息2 d,再進行第2個療程,共治療14次。模型對照組進行與艾灸治療組相同的固定?？瞻讓φ战M在其他兩組大鼠造模時根據(jù)體重注射相應劑量的生理鹽水,進行與艾灸治療組相同的固定。

1.6 指標檢測及方法

1.6.1 標本采集

治療結束第2天處死大鼠。抽取動脈血,離心,取上清液,分裝,﹣20℃冰箱保存?zhèn)溆谩囝^,咬骨鉗去顱骨,分離垂體組織,液氮中速凍,﹣80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 血清CORT、ACTH和T3、T4、TSH含量的檢測

采用ELISA方法,按照試劑盒說明書進行操作。

1.6.3 垂體ACTH和TSH mRNA表達的檢測

采用RT-PCR方法。組織總RNA的抽提按Trizol說明書操作?？俁NA中DNA的消除、反轉(zhuǎn)錄、Real-time PCR擴增、相對mRNA表達水平的計算等操作及方法參考文獻[8]。引物的合成與純化均由上海捷瑞生物科技有限公司提供。ACTH上游引物序列為5'-GCAAAGAACGAAGTCCGTGA-3',下游引物序列為5'-GATGGTGCTTGCTGTTGACC-3'。TSH上游引物序列為5'-AGTGGCTATACGGAGCCAGA-3',下游引物序列為5'-TGTTAGTGTGGTGTGAGCCC-3'。GAPDH上游引物序列為5’-GCAAGTTCAACGGCACAG-3’,下游引物為5’-GCCAGTAGACTCCACGACAT-3’。

1.7 統(tǒng)計學方法

所有實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析,以＜0.05作為差異有統(tǒng)計意義。組間比較采用單因素方差分析,方差齊采用多重比較,方差不齊采用’3多重比較。

2 結果

2.1 一般情況觀察

造模大鼠體重減輕,毛發(fā)失去光澤,弓背,扎堆,反應遲鈍,活動減少,陰囊皺縮,尿量明顯增多;經(jīng)艾灸治療后,大鼠食欲增加,體重加重,活動增加,毛發(fā)漸有光澤,而模型對照組大鼠體重未見顯著變化,毛發(fā)欠光澤,仍弓背、反應遲鈍、活動減少,喜扎堆,陰囊皺縮,尿量較多。

2.2 各組血清CORT、ACTH含量和垂體ACTH mRNA表達的變化

空白對照組與模型對照組之間比較,血清CORT無顯著性差異(＞0.05),血清ACTH和垂體ACTH mRNA均具有極顯著性差異(＜0.01);艾灸治療組與模型對照組比較,血清CORT無顯著性差異(＞0.05),血清ACTH和垂體ACTH mRNA均具有顯著性差異(＜0.05);艾灸治療組與空白對照組比較,上述各指標均無顯著性差異(＞0.05)。統(tǒng)計結果見表1。

表1 各組大鼠血清CORT、ACTH含量和垂體ACTH mRNA表達的比較 (±s)

表1 各組大鼠血清CORT、ACTH含量和垂體ACTH mRNA表達的比較 (±s)

組別n血清CORT(nmol/L)血清ACTH(pg/mL)垂體ACTH mRNA 模型對照組8108.40±13.4020.93±1.172.78±0.50 艾灸治療組8108.05±14.5122.38±2.412)3.17±0.302) 空白對照組8111.10±20.4025.25±2.531)3.74±0.381) F―0.0946.41511.504 P―0.9110.010 0.000

注:與模型對照組比較1)＜0.01,2)＜0.05

2.3 各組血清T3、T4、TSH含量和垂體TSH mRNA表達的變化

空白對照組與模型對照組之間比較,血清T3、T4、TSH和垂體TSH mRNA均具有極顯著性差異(＜0.01)。艾灸治療組與模型對照組比較血清T3均具有極顯著性差異(＜0.01),血清T4、TSH和垂體TSH mRNA均具有顯著性差異(＜0.05);艾灸治療組與空白對照組比較,上述各指標均無顯著性差異(＞0.05)。統(tǒng)計結果見表2。

表2 各組大鼠血清T3、T4、TSH含量和垂體TSH mRNA表達的比較 (±s)

表2 各組大鼠血清T3、T4、TSH含量和垂體TSH mRNA表達的比較 (±s)

組別n血清T3(ng/mL)血清T4(nmol/mL)血清TSH(pg/mL)垂體TSH mRNA 模型對照組8161.12±32.22122.56±18.3383.49±6.965.43±1.34 艾灸治療組8197.43±17.861)157.30±22.732)72.04±11.882)3.68±1.292) 空白對照組8211.66±18.901)178.13±12.631)64.10±6.851)2.62±1.231) F―9.50618.6789.6479.736 P―0.001 0.0000.0010.001

注:與模型對照組比較1)＜0.01,2)＜0.05

3 討論

臨床長期大量使用腎上腺皮質(zhì)激素治療的患者停藥后表現(xiàn)為腎上腺皮質(zhì)功能低下,出現(xiàn)腎陽虛一系列癥狀。沈自尹院士[9]幾十年來的研究證實腎陽虛證的物質(zhì)基礎在于下丘腦-垂體-靶腺軸的功能低下。下丘腦分泌激素(CRH、ACTH)作用于腺垂體,通過腺垂體調(diào)控靶腺(腎上腺、甲狀腺)CORT和T3、T4的分泌,這些靶腺分泌的激素又可反饋作用于其上級中樞,調(diào)節(jié)上級激素(ACTH、TSH)的釋放。近年來,有多位研究者[10-14]采用氫化可的松制作皮質(zhì)酮腎陽虛證動物模型,并采用中藥復方(如右歸丸、腎氣丸)或單體(如淫羊藿總黃酮、山茱萸提取物等)來治療腎陽虛大鼠,研究發(fā)現(xiàn)這些中藥復方或單體均能使低下的下丘腦-垂體-靶腺軸功能有一定程度的恢復。蔣淑君等[10]發(fā)現(xiàn)大劑量的山茱萸提取物能使腎陽虛大鼠含量低下的下丘腦CRH升高;陳津巖等[11]研究證實服用右歸丸后腎陽虛大鼠含量低下的ACTH和CORT顯著上升,下丘腦CRH含量也有所上升;許蘭芝等[13]發(fā)現(xiàn)淫羊藿總黃酮能使皮質(zhì)酮腎陽虛大鼠血清中低下的T4、T3含量顯著升高;馬娜等[14]采用右歸丸治療腎陽虛大鼠,發(fā)現(xiàn)右歸丸組各期的垂體-甲狀腺軸激素水平較模型組均有明顯升高,且都有統(tǒng)計學差異。也有研究者[15]發(fā)現(xiàn)艾灸腎俞、關元能明顯升高腎陽虛大鼠血清中低下的CORT、ACTH含量。

腎陽虛證模型是中醫(yī)虛證實驗研究中運用得最多且比較成功的動物模型之一。該動物模型是依據(jù)臨床腎陽虛患者腎上腺皮質(zhì)功能低下而設計的。按照陳英華等[16]提出的評價腎陽虛動物模型從一般狀態(tài)與實驗檢測、客觀指標、藥物反證幾個方面進行評價的科學設想,本課題前期研究[6,8,17]采用氫化可的松肌肉注射制作腎陽虛證實驗動物模型,通過對大鼠進行一般情況觀察、右歸丸治療反證,模型組血清CRH、T3、T4、血清睪酮、垂體ACTH水平及其mRNA的表達分別明顯低于正常對照組和右歸丸治療組,表明模型是成功的。

本實驗研究中,除血清CORT外,模型對照組中大鼠血清ACTH、T3、T4、TSH的含量和垂體ACTH、TSH mRNA的表達較正常大鼠發(fā)生異常,配合對大鼠一般情況的觀察,間接表明模型是成功的;經(jīng)艾條懸灸腎俞、關元穴后,艾灸組大鼠血清T3的含量較模型組有極顯著的升高(＜0.01),血清ACTH、T4的含量和垂體ACTH mRNA的表達都有顯著的升高(＜0.05),而血清TSH的含量和垂體TSH mRNA的表達則較模型組有顯著下降(＜0.05)。中醫(yī)學認為,艾灸具有溫經(jīng)散寒、溫腎助陽、升陽固脫作用;腎俞以補陽為主[18-19],關元以補氣為主[20-21],二穴相伍,同走下焦,培補元氣,補腎溫陽之功更佳[15]。腎俞穴屬膀胱經(jīng),是腎的背俞穴;而膀胱與腎相表里。穴名釋義曰:腎俞,應腎,是腎氣轉(zhuǎn)輸,輸注之穴,是治腎重要腧穴,故名腎俞?！夺t(yī)宗金鑒》:“腎俞,主治下元諸虛,精冷無子……”關元穴屬任脈,是小腸的募穴,足三陰經(jīng)、任脈交會穴。穴在臍下3寸,為人身元陰元陽關藏之地,故名關元;是治療諸虛百損之常用穴[22-23],腎虛所致男科病、婦科病之要穴?！侗怡o心書》記載:“每夏秋之交,即灼關元千炷,久久不畏寒暑……令人長生不老?！爆F(xiàn)代醫(yī)學研究表明,腎俞穴區(qū)的組織受第1～3腰神經(jīng)節(jié)段支配,第1～3腰神經(jīng)前支參與腰叢的組成,從腰叢發(fā)出髂腹股溝神經(jīng)和生殖股神經(jīng)支配生殖器;腎俞穴所在的腰部4對腰神經(jīng)節(jié)連成腰交感干,腰交感干通過交通支與腰神經(jīng)相連并隨腰神經(jīng)分布;腰交感干通過腰內(nèi)臟神經(jīng)與腹盆部的臟器如腎、腎上腺、內(nèi)生殖器等聯(lián)系。這可能就是經(jīng)穴-臟腑相關學說和背俞穴治療相應臟腑疾病的物質(zhì)基礎之一。關元穴淺層主要有十二胸神經(jīng)前支的前皮支和腹壁淺動、靜脈的分支或?qū)僦?深層有十二胸神經(jīng)前支的分支;通過交通支,腰交感干神經(jīng)節(jié)與相應的脊神經(jīng)相連;其中,內(nèi)臟小神經(jīng),由穿過第10～12胸交感干神經(jīng)節(jié)的節(jié)前纖維組成,下行穿過膈腳,主要終于主動脈腎節(jié)(屬于內(nèi)臟神經(jīng)叢中的腹腔叢);由腹腔節(jié)、主動脈腎節(jié)等發(fā)出的節(jié)后纖維,分布至肝、脾、腎等實質(zhì)性臟器和結腸左曲以上的消化管。周金山等[24]采用HRP神經(jīng)束路追蹤技術研究發(fā)現(xiàn)關元和子宮的傳入神經(jīng)在腰3到骶5之間的脊神經(jīng)節(jié)內(nèi)有匯聚與重疊。趙琛等[25]研究發(fā)現(xiàn)溫和灸腎俞穴、關元穴能明顯改善腎陽虛老年人腰膝酸軟、畏寒肢冷、夜尿頻等癥狀,并能顯著降低外周血單個核細胞Rb蛋白陽性表達率。趙偉康等[26]研究發(fā)現(xiàn)艾灸關元穴能明顯提高老年大鼠降低的大腦皮層NE、下丘腦TRH,血清T4和脾臟IL-2活性,降低老年大鼠升高的血清TRH,由此認為艾灸關元穴能不同程度調(diào)整神經(jīng)內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng),從而達到補腎固本,延緩衰老作用。任大蔚等[15]篩選腎俞、足三里、關元3個穴位兩兩組合的最佳配伍時以血清CORT、ACTH為觀測指標,發(fā)現(xiàn)溫和灸腎俞、關元治療腎陽虛大鼠的療效要好于灸腎俞、足三里與灸關元、足三里。

本實驗研究中,血清CORT在各組大鼠中無顯著性差異,原因可能與造模肌注氫化可的松的時間有關,有人認為糖皮質(zhì)激素短期應用造成腎陰虛,長期應用則造成腎陽虛[27-28];也可能與糖皮質(zhì)激素撤退以后,動物受抑制的下丘腦-垂體-腎上腺軸功能恢復速度與時間有關[29],在激素撤退早期屬于腎陽虛,后期可能屬于陰陽兩虛。具體或更深層次的原因有待進一步研究。

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The Effect of Suspended Moxa Stick Moxibustion on Points Shenshu(BL23) and Guanyuan(CV4) on the Pituitary-adrenal Axis and the Pituitary-thyroid Axis in Rats with Kidney Yang Deficiency

330006,

Objective To investigate the effect of suspended moxa stick moxibustion on points Shenshu(BL23) and Guanyuan(CV4) on the pituitary-adrenal axis and the pituitary-thyroid axis in rats with kidney yang deficiency. Method A rat model of corticosterone kidney yang deficiency was made by intramuscular injection of hydrocortisone. The rats were randomized into model control and moxibustion treatment groups. A blank control group was set up. The moxibustion treatment group received suspended moxa stick moxibustion on points Shenshu and Guanyuan 20 min once daily, for a total of 14 times. After the completion of treatment, serum CORT, ACTH, T3, T4 and TSH contents were measured by ELISA and pituitary expressions of ACTH and TSH mRNA were determined by RT-PCR. Result There was no significant difference in serum CORT (＞0.05), there were significant differences in serum ACTH, T4 and TSH and pituitary ACTH and TSH mRNA (＜0.05) and there was a very significant difference in serum T3 (＜0.01) between the moxibustion treatment and model control groups. There were no significant differences in the above indicators between the moxibustion treatment and blank control groups (＞0.05). Conclusion Suspended moxa stick moxibustion on points Shenshu and Guanyuan produces a therapeutic effect on rat kidney yang deficiency by decreasing serum TSH content, down-regulating pituitary TSH mRNA expression, increasing serum ACTH, T3 and T4 contents and up-regulating pituitary ACTH mRNA expression.

Moxa stick moxibustion; Kidney yang deficiency; Pituitary-adrenal axis; Pituitary-thyroid axis; Rats

1005-0957(2016)12-1469-04

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2016.12.1469

江西省教育廳科技項目(GJJ10559)

閔友江(1975 - ),男,副教授,博士

程立紅(1957 - ),女,教授,研究方向為刺灸方法與臨床研究

2016-04-20