馬　歡，唐　禹，楊遠(yuǎn)友，劉　寧，廖家莉，楊吉軍

(四川大學(xué) 原子核科學(xué)技術(shù)研究所 輻射物理及技術(shù)教育部重點實驗室，四川 成都　610064)

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131I標(biāo)記新型小分子肽VP2

馬歡，唐禹，楊遠(yuǎn)友，劉寧，廖家莉，楊吉軍

(四川大學(xué) 原子核科學(xué)技術(shù)研究所 輻射物理及技術(shù)教育部重點實驗室，四川 成都610064)

摘要：本文通過雙功能偶聯(lián)劑5-(三正丁基錫)-3-吡啶甲酸-N-琥珀酰亞胺酯(SPC)將(131)I標(biāo)記到小分子融合多肽VP2上，研究了(131)I標(biāo)記多肽VP2的體內(nèi)外穩(wěn)定性及在正常小鼠體內(nèi)的代謝與分布。結(jié)果表明，該標(biāo)記藥物室溫下放置48 h后放化純度仍可達(dá)97%，其在小鼠體內(nèi)可通過胃腸道快速代謝，在甲狀腺的攝取較低。用間接標(biāo)記法得到的(131)I-SPC-VP2在體內(nèi)外有良好的穩(wěn)定性。

關(guān)鍵詞：(131)I；VP2；標(biāo)記藥物；小分子肽；生物分布

血管活性腸肽受體VIPRs是血管活性腸肽和垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽的功能性受體，在人類腫瘤及轉(zhuǎn)移部位高度表達(dá)[1]。一般說來，VIPRs包含VPAC1、VPAC2和PAC1，而其中VPAC1受體可通過反式激活表皮生長因子受體和表達(dá)血管內(nèi)皮生長因子來調(diào)節(jié)腫瘤血管生成[2-3]。研究表明，VPAC1在惡性上皮腫瘤中高度表達(dá)，如結(jié)腸癌、直腸癌、肺癌和乳腺癌[4-5]，因此，該受體被視為是腫瘤診斷和治療的一個理想靶點。近期第三軍醫(yī)大核醫(yī)學(xué)科用噬菌體展示技術(shù)發(fā)現(xiàn)了對VPAC1受體有良好親和力的多肽VP2，作為一種新型小分子肽，VP2載體被證實具有諸多優(yōu)點，例如對VPAC1受體和幾個結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系有高度特異性和親和力[6]；相對分子質(zhì)量小，在腫瘤組織中有較強的穿透力；生物半衰期短，清除快；較低的免疫原性等特性。為211At等核素的體內(nèi)放射治療提供了一個極有希望的靶向載體?；?31I及其同位素的優(yōu)良性質(zhì)，用放射性碘標(biāo)記的VP2多肽有希望成為早期結(jié)腸癌、直腸癌及其他癌癥的診斷分子成像探針?biāo)幬?。同時，131I與211At同族，有相似的化學(xué)性質(zhì)，本研究擬對131I標(biāo)記多肽在小鼠體內(nèi)的分布與代謝進(jìn)行探索，以促進(jìn)腫瘤診斷與治療的新型碘標(biāo)記藥物研發(fā)工作，對211At標(biāo)記藥物的研發(fā)提供參考。

1材料與方法

1.1試劑與儀器

硅膠粉(Silicagel，200～400 mesh):Aldrich產(chǎn)品；氯代琥珀酰亞胺(NCS，純度>98%)：JK產(chǎn)品；Sephadex G10凝膠：瑞典Pharmacia公司；其他試劑為市售分析純，蒸餾水為高純水；Na131I(1.85×1012Bq/L,pH=7.0～9.0的NaOH溶液)：成都中核高通同位素股份有限公司；小分子融合多肽VP2(Ac-Gly-Phe-Arg-Phe-Gly-Ala-Leu-His-Glu-Tyr-Asn-Ser-NH2)：相對分子質(zhì)量約1 kDa，購于上海耀強生物科技有限公司。

FH-603井型閃爍探頭、FH463A自動定標(biāo)器：北京核儀器廠；INOVA-400MHz核磁共振儀：美國Bruker公司；高效液相色譜儀(HPLC)：美國Beckman公司334系列；BS210S電子天平：德國Sartorius公司；RE252C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、恒溫磁力攪拌器:上海亞榮生化儀器廠；PHS-3C精密pH計：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2實驗動物

昆明小鼠：(20 ±2) g，雌雄各半，購于四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)動物實驗中心。

2實驗方法

2.1雙功能偶聯(lián)劑SPC的合成

參照文獻(xiàn)[7]的方法，經(jīng)酯化、錫化、水解與琥珀?；铣闪穗p功能偶聯(lián)劑5-(三正丁基錫)-3-吡啶甲酸-N-琥珀酰亞胺酯(SPC)，產(chǎn)物經(jīng)核磁(1H NMR)與質(zhì)譜(MS)表征分析，結(jié)果與文獻(xiàn)一致。產(chǎn)物SPC的1H NMR：(CDCl3，400 MHz)δ：0. 88～1. 63 (m，27H，3 × n-C4H14)，2.94(s,4H,COCH2CH2CO)，8. 41(s，1H，C-4H)，8.86(s，1H，C-6H)，9. 22(s，1H，C-2H)；SPC的MS(ESI)+：m/z511 (M+1，計算值510)；MS(ESI)-：m/z509(M-1，計算值510)。

2.2131I標(biāo)記小分子肽

參照文獻(xiàn)[8]的方法，在微型反應(yīng)管中依次加入100 μL Na131I(約1.8×108Bq)溶液、6 μL 冰醋酸、40 μL 20 g/L NCS的丙酮溶液和80 μL 10 g/L SPC的甲醇溶液，在65 ℃水浴中反應(yīng)5 min后，轉(zhuǎn)入室溫再反應(yīng)30 min，加入10 μL 20g/L Na2S2O3溶液終止反應(yīng)。經(jīng)薄層層析法(TLC)分析標(biāo)記率，TLC層析液為V(C6H14)∶V(乙酸乙酯)=1∶1。

通入氮氣趕去有機相，然后加入500 μL 0.5 g/L的多肽溶液(溶解在0.1 mol/L，pH=9.0 硼酸鹽緩沖溶液中)，室溫下經(jīng)漩渦振蕩器震蕩10 min。再由Sephadex G10凝膠柱分離，用0.1 mol/L pH=7.6 的磷酸鹽緩沖液(PBS)淋洗， 每管收集1.5 mL淋洗液，測量每管的放射性活度，繪出淋洗曲線。

2.3131I-SPC-VP2體外穩(wěn)定性

將含131I-SPC-VP2的管淋洗液合并在一起備用，分別取500 μL淋洗液與血清及PBS等體積混合，室溫下放置。分別于1、24、48 h取樣，TLC分析標(biāo)記物的放化純度。層析液為V(MeOH)∶V(CHCl3)=1∶4。

2.4131I-SPC-VP2在正常小鼠體內(nèi)分布

將56只小鼠(雌雄各半)隨機分成14組，其中7組通過尾靜脈注射131I-SPC-VP2，另外7組注射Na131I溶液(用0.1 mol/L，pH=7.6的PBS稀釋)，每只注射0.2 mL放射性液體(約1.2×106Bq)，注射后分別于0.5、1、3、6、12、24、48 h處死，取血、心臟、肝臟、脾臟、腎、肺、胃、腸、肌肉與甲狀腺等組織，稱重并測量其放射性計數(shù)，甲狀腺連帶周圍組織一并取下但不稱重，計算各組織的放射性攝取率(%ID/g)。

3結(jié)果與討論

3.1131I標(biāo)記小分子肽

加入Na2S2O3溶液終止反應(yīng)，通過TLC分析標(biāo)記率，131I-SPC的Rf為0.5，而游離131I的Rf約為0，當(dāng)偶聯(lián)劑SPC與氧化劑NCS的溶劑分別為甲醇和丙酮時，131I-SPC的標(biāo)記率可達(dá)91%(圖1、圖2)，比二氯甲烷為溶劑的標(biāo)記率高(表1)。甲醇與丙酮既能與有機試劑相溶又能與水相溶，能很好的將Na131I與NCS、SPC混合起來，增大接觸面積，有利于反應(yīng)的進(jìn)行，提高標(biāo)記率。而以二氯甲烷為溶劑時，因二氯甲烷不能和水互溶，Na131I與NCS、SPC不能很好的接觸，標(biāo)記率比以甲醇和丙酮作溶劑稍低。實驗體系為混合溶液體系，主要考慮到氧化劑NCS在一般的溶劑中溶解性不高，在保證NCS溶解度的同時不影響活性酯SPC的活性。與多肽偶聯(lián)后經(jīng)Sephadex G10凝膠柱淋洗得到的第一個放射性峰為最終標(biāo)記產(chǎn)物，總標(biāo)記率為28%，淋洗曲線如圖3所示。

圖1　 131I-SPC的TLC分析Fig.1　Radioanalysis of the 131I labeled mixture by TLC

圖2　Na131I的TLC分析Fig.2　Radioanalysis of Na131I by TLC

反應(yīng)體系不同反應(yīng)時間的標(biāo)記率5min10min20min30min二氯甲烷41%62%68%71%[10]三氯甲烷60%70%72%79%甲醇+丙酮86%83%86%91%

圖3　131I-SPC-VP2經(jīng)Sephadex G10 的淋洗曲線Fig.3　Elution profile of 131I-SPC-VP2 purified by Sephadex G10 column

3.2131I-SPC-VP2體外穩(wěn)定性

將含有131I-SPC-VP2的0.1 mol/L PBS淋洗液(pH=7.6)及與血清的混合液在室溫下放置2 d，其放化純度無明顯變化，結(jié)果如表2所示，即使在48 h后其放化純度仍可達(dá)97%，表明以SPC為雙功能偶聯(lián)劑的間接標(biāo)記物在體外具有較高的穩(wěn)定性。

3.3131I-SPC-VP2在正常小鼠體內(nèi)的生物分布

131I-SPC-VP2與Na131I在小鼠體內(nèi)分布結(jié)果列于表3。131I-SPC-VP2和Na131I溶液進(jìn)入小鼠體內(nèi)后代謝速度都比較快。因為多肽相對分子質(zhì)量小，在小鼠體內(nèi)可以快速的被清除，131I-SPC-VP2在小鼠體內(nèi)的血液清除半衰期為2.5 h。6 h之后小鼠體內(nèi)沒有放射性殘留。由表3可見，注射131I-SPC-VP2后放射性通過血液在胃部有明顯的濃集，推測該131I標(biāo)記的多肽主要通過胃腸道代謝，其次在腎、脾、肺也有較高的攝取。但在該劑量下，對肝、腎臟并無明顯的損傷。相比其他器官而言，其在甲狀腺并沒有明顯的攝取。與131I-相比，在12 h前，注射131I-SPC-VP2后，各器官的放射性攝取都處于較低水平，尤其是甲狀腺，兩者的倍數(shù)差異高于其他器官，比如在6 h時，在胃部131I-的攝取為4.46%ID/g，而131I-SPC-VP2為1.56%ID/g，131I-是131I-SPC-VP2的2.8倍，同時在甲狀腺，131I-SPC-VP2的攝取為0.01%ID，而131I-為0.66%ID，131I-是131I-SPC-VP2的66倍。游離碘離子在體內(nèi)易高度濃集于甲狀腺，一般通過考察藥物在小鼠甲狀腺的放射性攝取高低來評價該藥物在體內(nèi)的穩(wěn)定性，以上結(jié)果說明，該標(biāo)記藥物在小鼠體內(nèi)有良好的穩(wěn)定性。

表2　131I-SPC-VP2在室溫下的放化純度(n=4)

4結(jié)論

本文通過間接標(biāo)記法將131I標(biāo)記到小分子肽VP2上，考察了該標(biāo)記藥物體內(nèi)外的穩(wěn)定性與在正常小鼠體內(nèi)的生物分布。標(biāo)記物體內(nèi)外有較好的穩(wěn)定性。若用合適的核素對小分子肽VP2進(jìn)行標(biāo)記，該多肽可以快速的到達(dá)靶點，較快的代謝速率可以及時清除非靶器官的放射性，降低對正常組織的傷害程度。131I標(biāo)記小分子肽VP2的初步研究顯示，該藥物有希望制成放射免疫藥物用于結(jié)腸癌、直腸癌、肺癌及乳腺癌癌癥的診斷與治療。

參考文獻(xiàn)：

[1]Laburthe M, Couvineau A, Tan V. Class Ⅱ G protein-coupled receptorsfor VIP and PACAP: structure, models of activation and pharmacology[J]. Peptides, 28(9): 1 631-1 639.

[2]Valdehita A, Carmena M J, Collado B, et al. Vasoactiveintestinal peptide (VIP) increases vascular endothelial growth factor (VEGF) expression and secretion in human breast cancer cells[J]. RegulPept, 144(1-3): 101-108.

[3]Valdehita A, Bajo A M, Schally A V, et al. Vasoactive intestinal peptide (VIP) induces transactivation of EGFR and HER2in human breast cancer cells[J]. Mol Cell Endocrinol, 302(1): 341-348.

[4]Reubi J C, Laderach U, Waser B, et al. Vasoactive intestinal peptide/pituitary adenylatecyclase-activating peptidereceptor subtypes in human tumors and their tissues of origin[J]. Cancer Res, 60(11): 3 105-3 112.

[5]Reubi J C, K?rner M, WaserB,et al. High expression of peptide receptors as a novel target in gastrointestinal stromal tumours[J]. Eur J Nucl Med Mol Imaging, 31(6): 803-810.

[6]Tang Bo, Li Zhexu, Huang Dingde,et al. Screening of a Specific Peptide Binding to VPAC1 Receptor from a Phage Display Peptide Library[J]. Plos One, 2013, 8(1), e54264.

[7]楊遠(yuǎn)友,廖家莉,林如山,等. 雙功能偶聯(lián)劑SPC 的一種新合成方法及其碘標(biāo)記[J]. 化學(xué)研究與應(yīng)用，2008,20(2)：162-165.

Yang Yuanyou, Liao Jiali, Lin Rushan, et al. A new synthesis route for SPC as a bi-functional linker for radioiodination and its labeling of iodine[J]. Chemical Research and Application, 2008, 20(2): 162-165(in Chinese).

[8]唐軍,金建南,劉寧,等. 用于放射性砹( 碘) 標(biāo)記蛋白質(zhì)的偶聯(lián)劑 SPC的合成與表征[J]. 原子能科學(xué)技術(shù),2004,25(3):261-265.

Tang Jun, Jin Jiannan, Liu Ning, et al. Synthesis and characterization of SPC as a linker for labeling proteins with astatine and iodine radioistopes[J]. Atomic Energy Science and Technology, 2004, 25(3): 261-265(in Chinese)

Preliminary Study of Radioiodination of VP2

MA Huan, TANG Yu, YANG Yuan-you, LIU Ning, LIAO Jia-li, YANG Ji-jun

(KeyLaboratoryofRadiationPhysicsandTechnology,MinistryofEducation,InstituteofNuclearScienceandTechnology,SichuanUniversity,Chengdu610064,China)

Abstract:The VP2 peptide specifically binding to vasoactive intestinal polypeptide receptor 1(VPAC1) receptor was radioiodinated with (131)I by bi-functional linker N-succinimidyl 5-(tributylstannyl)-3-pyridinecarboxylate (SPC), and in vitro and in vivo stability of the labeled peptide were evaluated. Mice were injected intravenously with either 1.2×106 Bq (131)I-SPC-VP2 or Na(131)I. Radiochemical purity and biodistribution were studied at various time points. The result showed that purified (131)I-SPC-VP2 exhibited radiochemical purity of 97% at room temperature up to 48 h. The tissue uptake of (131)I-SPC-VP2 was low after 6 h injection, especially in thyroid. The result indicated the labeled compound had fast clearance and good stability in vivo.

Key words：(131)I; VP2; labeled compound; peptide; biodistribution

doi：10.7538/tws.2016.29.01.0001

中圖分類號：R817.9

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1000-7512(2016)01-0001-05

作者簡介：馬歡(1992—)，女，浙江衢州人，碩士研究生，主要從事同位素應(yīng)用研究通信作者：楊遠(yuǎn)友，研究員， E-mail: yangyy@scu.edu.cn

基金項目：國家自然科學(xué)基金(21371124，J1210004)

收稿日期：2015-00-00;修回日期：2015-00-00