葛燕萍 張青

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痰標(biāo)本RNA恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)對(duì)活動(dòng)性肺結(jié)核的臨床診斷價(jià)值

葛燕萍 張青

目的 評(píng)價(jià)結(jié)核分枝桿菌RNA恒溫?cái)U(kuò)增實(shí)時(shí)檢測(cè)法(SAT-TB)對(duì)活動(dòng)性肺結(jié)核的臨床診斷價(jià)值。 方法 收集2014年1月至2014年12月上海市肺科醫(yī)院收治的活動(dòng)性肺結(jié)核患者321例[結(jié)核組，包括確診肺結(jié)核(275例)及臨床診斷肺結(jié)核(46例)]及肺部其他疾病患者49例(對(duì)照組)的痰標(biāo)本，分別采用SAT-TB法、涂片鏡檢法及結(jié)核分枝桿菌快速培養(yǎng)法(采用“BACTECTMMGITTM960全自動(dòng)分枝桿菌檢測(cè)系統(tǒng)”,簡(jiǎn)稱“BACTEC 960”)進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果分別計(jì)算敏感度、特異度、陽性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值。應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，樣本“率”的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果 321例結(jié)核組患者及49例對(duì)照組患者的痰標(biāo)本，分別用SAT-TB法、涂片鏡檢法及BACTEC 960培養(yǎng)法檢測(cè)，敏感度分別為74.77%(240/321)、28.04%(90/321)、85.05%(273/321)。SAT-TB法敏感度顯著高于涂片鏡檢法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=140.297，P<0.01)；SAT-TB法敏感度低于BACTEC 960培養(yǎng)法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.565，P<0.01)。涂片鏡檢法與SAT-TB法的特異度均為100.00%(49/49)，而BACTEC 960培養(yǎng)法的特異度為95.92%(47/49)；3種檢測(cè)方法特異度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.055，P>0.05)。273例BACTEC 960培養(yǎng)法檢測(cè)陽性的肺結(jié)核患者中，SAT-TB法檢測(cè)陽性230例，敏感度為84.25%(230/273)；涂片鏡檢法陽性88例，敏感度為32.23%(88/273)，兩者敏感度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=151.847，P<0.01)。SAT-TB法檢測(cè)275例確診肺結(jié)核患者的敏感度為84.36%(232/275)，陽性預(yù)測(cè)值為100.00%(232/232)，陰性預(yù)測(cè)值為53.26%(49/92)。結(jié)論 SAT-TB法敏感度高于涂片鏡檢法，特異度與BACTEC 960培養(yǎng)法相近，對(duì)于涂陰活動(dòng)性肺結(jié)核有一定臨床診斷價(jià)值。

結(jié)核，肺/診斷； 核酸擴(kuò)增技術(shù)； 敏感度與特異度

世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，目前全球約有20億例結(jié)核分枝桿菌感染者，并且以每年800～1000萬例的速度遞增，約200萬例患者死于結(jié)核病[1-2]。2010年全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查(簡(jiǎn)稱“流調(diào)”)報(bào)告顯示結(jié)核病疫情較2000年流調(diào)結(jié)果有所下降，但活動(dòng)性肺結(jié)核患病率下降較慢，因此，我國的結(jié)核病負(fù)擔(dān)仍很嚴(yán)重[3]。預(yù)防和控制結(jié)核病傳播的重要手段是早期、快速診斷。目前，臨床確診肺結(jié)核的傳統(tǒng)方法仍是痰涂片鏡檢法及分枝桿菌培養(yǎng)法，但涂片法陽性率低，而培養(yǎng)法耗時(shí)長(zhǎng)。因此，臨床上亟需一種新的診斷技術(shù)。結(jié)核分枝桿菌RNA恒溫?cái)U(kuò)增實(shí)時(shí)檢測(cè)法(simultaneous amplification and testing forMycobacteriumtuberculosis，SAT-TB)是基于RNA恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)發(fā)展起來的一項(xiàng)最新的核酸檢測(cè)技術(shù)。它是以結(jié)核分枝桿菌特異的16S rRNA作為檢測(cè)靶標(biāo)，通過恒溫RNA擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增靶標(biāo)片段，熒光標(biāo)記的探針與靶標(biāo)片段的擴(kuò)增產(chǎn)物雜交后釋放出熒光信號(hào)，對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，從而快速準(zhǔn)確地判斷待檢樣本中是否有結(jié)核分枝桿菌的存在。

筆者通過回顧性研究，對(duì)上海市肺科醫(yī)院2014年1月至2014年12月收治的活動(dòng)性肺結(jié)核及其他肺部疾病患者的痰液標(biāo)本分別進(jìn)行SAT-TB、涂片鏡檢及結(jié)核分枝桿菌快速培養(yǎng)(采用“BACTECTMMGITTM960全自動(dòng)分枝桿菌檢測(cè)系統(tǒng)”,簡(jiǎn)稱“BACTEC 960”)，比較3種檢測(cè)方法的差異，以評(píng)價(jià)SAT-TB法對(duì)活動(dòng)性肺結(jié)核的臨床診斷價(jià)值。

材料與方法

一、研究對(duì)象

1.結(jié)核組：收集2014年1月至2014年12月上海市肺科醫(yī)院收治的活動(dòng)性肺結(jié)核患者321例，其中男211例，女110例，年齡18～70歲，平均(47.5±11.6)歲?；顒?dòng)性肺結(jié)核的診斷依據(jù)《肺結(jié)核診斷和治療指南》[4]進(jìn)行。根據(jù)細(xì)菌學(xué)及病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果，本研究將活動(dòng)性肺結(jié)核分為確診肺結(jié)核(275例)及臨床診斷肺結(jié)核(46例)。(1)確診肺結(jié)核：指有肺結(jié)核臨床癥狀和胸部影像學(xué)表現(xiàn)，且痰涂片或分枝桿菌培養(yǎng)陽性，菌型鑒定為結(jié)核分枝桿菌；或支氣管或肺部組織病理證實(shí)結(jié)核病變。(2)臨床診斷肺結(jié)核：是指不具備細(xì)菌學(xué)及病理學(xué)診斷依據(jù)，但臨床癥狀及胸部影像學(xué)表現(xiàn)符合活動(dòng)性肺結(jié)核表現(xiàn)，且能排除其他肺部疾病，并經(jīng)診斷性抗結(jié)核治療有效。活動(dòng)性肺結(jié)核依據(jù)痰細(xì)菌學(xué)結(jié)果分為涂片陽性培養(yǎng)陽性(簡(jiǎn)稱“涂陽培陽”)、涂片陽性培養(yǎng)陰性(簡(jiǎn)稱“涂陽培陰”)、涂片陰性培養(yǎng)陽性(簡(jiǎn)稱“涂陰培陽”及涂片陰性培養(yǎng)陰性(簡(jiǎn)稱“涂陰培陰”)肺結(jié)核。涂陽培陽、涂陽培陰、涂陰培陽屬于確診肺結(jié)核；涂陰培陰屬于臨床診斷肺結(jié)核。

2.對(duì)照組：收集2014年1月至2014年12月上海市肺科醫(yī)院收治的肺部其他疾病患者49例，其中男28例，女21例，年齡28～68歲，平均(43.3±10.1)歲。肺部其他疾病包括慢性支氣管炎27例(55.10%)，肺炎8例(16.33%)，肺癌5例(10.20%)，支氣管擴(kuò)張4例(8.16%)，非結(jié)核分枝桿菌肺病2例(4.08%)，結(jié)節(jié)病2例(4.08%)，塵肺1例(2.04%)。上述患者診斷均依據(jù)相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。所有患者均無HIV感染及嚴(yán)重的全身疾病。兩組患者均知情同意并簽署知情同意書。

二、研究方法

留取患者晨起漱口后的痰液標(biāo)本，根據(jù)我國《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》[6]進(jìn)行預(yù)處理，并將標(biāo)本分為3份，分別進(jìn)行SAT-TB法、涂片鏡檢法及BACTEC 960培養(yǎng)法檢測(cè)。

1.SAT-TB法：檢測(cè)試劑盒采用上海仁度生物科技有限公司生產(chǎn)的SAT-TB試劑盒，根據(jù)說明書進(jìn)行操作。將預(yù)處理的標(biāo)本按1∶100的比例用TB稀釋液(一種裂解緩沖液，采用焦碳酸二乙酯處理過的無菌水配制10 mmol/L檸檬酸鈉)進(jìn)行稀釋，放入超聲波清洗器中進(jìn)行超聲處理15 min，超聲功率300 W；超聲處理結(jié)束后，取出2 μl處理物，在其中加入30 μl擴(kuò)增檢測(cè)液(一種混合液，含40 mmol/L的Tris-HCl緩沖液，pH=8.1)，開啟恒溫?zé)晒鈾z測(cè)儀器(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，按儀器操作手冊(cè)設(shè)定反應(yīng)程序，熒光素通道設(shè)定為FAM(6-羧基熒光素)42 ℃ 1 min，共檢測(cè)40次；反應(yīng)結(jié)束后置于恒溫混勻儀(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)上42 ℃ 保溫5 min，同時(shí)將SAT酶液(含M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和T7 RNA轉(zhuǎn)錄酶各2000 U)也預(yù)熱到42 ℃ 加入反應(yīng)管，快速轉(zhuǎn)至恒溫?zé)晒鈾z測(cè)儀上進(jìn)行檢測(cè)。

2.涂片鏡檢法：采用萋-尼抗酸染色鏡檢，操作按《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》[6]進(jìn)行。

3. BACTEC 960培養(yǎng)法：試劑盒及儀器來源于碧迪醫(yī)療器械(上海)有限公司。對(duì)于培養(yǎng)陽性標(biāo)本進(jìn)一步行菌種鑒定，以明確是哪種分枝桿菌。

4.各指標(biāo)計(jì)算方法：敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陽性預(yù)測(cè)值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù)) ×100%；陰性預(yù)測(cè)值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù)) ×100%。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，樣本“率”的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、兩組患者3種檢測(cè)方法的檢出結(jié)果

結(jié)核組321例患者痰涂片鏡檢陽性90例(28.04%)，BACTEC 960培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌陽性273例(85.05%)，SAT-TB法檢測(cè)陽性240例(74.77%)。3種方法敏感度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=253.207，P<0.01)。進(jìn)一步對(duì)3種方法進(jìn)行兩兩比較，SAT-TB法的敏感度高于涂片鏡檢法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=140.297，P<0.01)；SAT-TB法的敏感度低于BACTEC 960培養(yǎng)法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.565，P<0.01)。對(duì)照組49例患者痰標(biāo)本涂片鏡檢法及SAT-TB法的檢出結(jié)果均為陰性，特異度均為100.00%(49/49)，而BACTEC 960培養(yǎng)檢出2例陽性，但最終菌型鑒定結(jié)果為非結(jié)核分枝桿菌，特異度為95.92%(47/49)。3種方法特異度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.055，P>0.05)(表1)。

二、SAT-TB法與涂片鏡檢法在BACTEC 960培養(yǎng)法陽性患者中的檢測(cè)結(jié)果

在273例BACTEC 960培養(yǎng)法陽性的結(jié)核組患者中，SAT-TB法的敏感度為84.25%(230/273)，涂片鏡檢法的敏感度為32.23%(88/273)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=151.847，P<0.01)(表2)。

三、SAT-TB法檢測(cè)結(jié)果與不同細(xì)菌學(xué)檢測(cè)結(jié)果的比較

SAT-TB法檢測(cè)275例確診肺結(jié)核患者的敏感度為84.36%(232/275)，陽性預(yù)測(cè)值為100.00%(232/232)，陰性預(yù)測(cè)值為53.26%(49/92)，具體見表3；90例痰涂片鏡檢陽性的患者，其SAT-TB法檢測(cè)結(jié)果均為陽性，診斷敏感度達(dá)100.00%(90/90)。

討 論

表1 3種檢測(cè)方法對(duì)兩組患者檢測(cè)的敏感度及特異度比較

注 敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%

表2 SAT-TB法與涂片法在BACTEC 960陽性結(jié)核組患者中檢測(cè)敏感度的比較

注 敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%

表3 不同細(xì)菌學(xué)檢測(cè)結(jié)果與SAT-TB法檢測(cè)結(jié)果的比較

注 敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陽性預(yù)測(cè)值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù)) ×100%；陰性預(yù)測(cè)值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù)) ×100%

活動(dòng)性肺結(jié)核診治流程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是如何早期、及時(shí)、準(zhǔn)確地診斷，而目前要做到這點(diǎn)主要依賴于實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)。肺結(jié)核的實(shí)驗(yàn)室診斷主要包括痰涂片鏡檢法、培養(yǎng)法、分子生物學(xué)方法及免疫學(xué)方法等。近年來，分子生物學(xué)技術(shù)在活動(dòng)性肺結(jié)核的診斷中發(fā)揮了越來越重要的價(jià)值。1996年美國疾病預(yù)防控制中心推薦核酸擴(kuò)增試驗(yàn)(nucleic acid amplication，NAA)用于涂陰肺結(jié)核的診斷，并于2000年對(duì)流程進(jìn)行了更新[7-8]。常用的NAA技術(shù)包括常規(guī)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)等。其中恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)包括SAT-TB和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(loop mediated isothermal amplification，LAMP)等。

本研究結(jié)果顯示，對(duì)于321例活動(dòng)性肺結(jié)核患者，SAT-TB法檢測(cè)敏感度為74.77%(240/321)，明顯高于傳統(tǒng)的涂片鏡檢法(28.04%，90/321)，但低于BACTEC 960培養(yǎng)法(85.05%，273/321)。

結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)及菌型鑒定法長(zhǎng)期以來被譽(yù)為結(jié)核分枝桿菌診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”[9]。對(duì)273例BACTEC 960培養(yǎng)法陽性且菌型鑒定為結(jié)核分枝桿菌的結(jié)核組患者及49例對(duì)照組患者的痰標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示SAT-TB法的敏感度為84.25%(230/273)，特異度為100.00%(49/49)。從檢測(cè)時(shí)間上，SAT-TB法僅需1.5 h就能得到結(jié)果，速度明顯快于BACTEC 960培養(yǎng)法，而檢測(cè)結(jié)果與培養(yǎng)法一致率達(dá)84.25%(230/273)，也就是說SAT-TB法能夠在最短的時(shí)間內(nèi)提供準(zhǔn)確率為84.25%的檢測(cè)結(jié)果。應(yīng)用SAT-TB檢測(cè)技術(shù)，可以在較短的時(shí)間內(nèi)得到相對(duì)敏感度較高的檢測(cè)結(jié)果。49例對(duì)照組患者中有2例為NTM肺病，其BACTEC 960培養(yǎng)結(jié)果均陽性，而SAT-TB法檢測(cè)結(jié)果均為陰性，可見SAT-TB法可區(qū)分是否為結(jié)核分枝桿菌感染。因此，在一定條件下，SAT-TB法能夠替代BACTEC 960培養(yǎng)法，有望成為實(shí)驗(yàn)室診斷的新方法，是一項(xiàng)很有市場(chǎng)前景的新技術(shù)[10]。

根據(jù)痰細(xì)菌學(xué)結(jié)果將活動(dòng)性肺結(jié)核患者分為確診及臨床診斷兩組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在275例確診肺結(jié)核組中，90例痰涂片鏡檢法陽性，其SAT-TB法檢測(cè)結(jié)果均陽性，診斷敏感度達(dá)100.00%(90/90)，這一結(jié)果與崔振玲等[11]報(bào)道的結(jié)果相仿。由此說明對(duì)于活動(dòng)性肺結(jié)核患者，SAT-TB法檢測(cè)結(jié)果陽性可以確認(rèn)結(jié)核病診斷，但SAT-TB法檢測(cè)結(jié)果陰性卻并不能完全排除結(jié)核病的診斷。

我國多次結(jié)核病流調(diào)結(jié)果均顯示，涂陰肺結(jié)核占活動(dòng)性肺結(jié)核患者的比例較高，從1979年的73.9%上升到2010年的85.6%，涂陰肺結(jié)核成為我國肺結(jié)核患病率下降緩慢的主要原因[12]。由于涂陰肺結(jié)核患者缺乏痰涂片抗酸桿菌陽性結(jié)果，故對(duì)其進(jìn)行痰培養(yǎng)或分子生物學(xué)檢查，獲得病原學(xué)檢查陽性依據(jù)，能大大提高涂陰肺結(jié)核診斷的準(zhǔn)確性，減少誤診。本研究結(jié)果顯示，在321例活動(dòng)性肺結(jié)核患者中，涂陰患者有231例(其中185例為BACTEC 960培養(yǎng)法陽性，46例為BACTEC 960培養(yǎng)法陰性)，SAT-TB法檢出陽性150例，陽性率為64.94%(150/231)。因此，對(duì)于痰涂片陰性的活動(dòng)性肺結(jié)核患者而言，SAT-TB法不失為一種新的輔助診斷手段，具有一定臨床價(jià)值。SAT-TB法對(duì)于細(xì)菌學(xué)陰性的活動(dòng)性肺結(jié)核患者(即涂陰培陰的46例患者)陽性率僅為17.39%(8/46)，但對(duì)于痰涂片陰性的活動(dòng)性肺結(jié)核患者(包括涂陰培陰的46例患者及涂陰培陽的185例患者，共231例)，陽性率達(dá)64.94%(150/231)，因此SAT-TB法對(duì)于痰涂片陰性的活動(dòng)性肺結(jié)核患者，檢測(cè)陽性率并不算低。范琳等[13]利用RNA恒溫?cái)U(kuò)增實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液來診斷涂陰肺結(jié)核，該方法的敏感度、特異度、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值分別為81.0%、96.9%、95.9%、84.9%，這一結(jié)果也證實(shí)了上述觀點(diǎn)。

綜上所述，SAT-TB法敏感度高于涂片鏡檢法，特異度接近BACTEC 960培養(yǎng)法，但耗時(shí)更短，且對(duì)于涂陰活動(dòng)性肺結(jié)核有一定臨床診斷價(jià)值，值得在有實(shí)驗(yàn)室相關(guān)能力的醫(yī)院推廣。

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(本文編輯：郭萌)

Clinical value of simultaneous amplification and testing method of sputum specimen for the diagnosis of active pulmonary tuberculosis

GEYan-ping,ZHANGQing.

ShanghaiKeyLaboratoryofTuberculosis,TuberculosisDiagnosisCenter,ShanghaiPulmonaryHospitalaffiliatedtoTongjiUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200433,China

ZHANGQing,Email:zhqi709851@sohu.com

Objective To evaluate the clinical value of the simultaneous amplification and testing method for the detection ofMycobacteriumtuberculosis(SAT-TB) for the diagnosis of active pulmonary tuberculosis (TB). Methods Sputum specimens from 321 active pulmonary TB (including confirmed tuberculosis (275 cases) and clini-cal diagnosis tuberculosis (46 cases)) and 49 patients with other lung diseases admitted in Shanghai Pulmonary Hospital were tested with SAT-TB, smears and BACTEC 960 cultures. Sensitivity, specificity, positive and negative predictive values were calculated according to test results. Using SPSS 19.0, data were compared withχ2test,P<0.05 was considered statistically significant. Results The sensitivities of SAT-TB, smears and cultures were 74.77% (240/321)，28.04% (90/321) and 85.05% (273/321), respectively. The sensitivity of SAT-TB was significantly higher than that of smear (χ2=140.297,P<0.01), but significantly lower than that of cultures (χ2=10.565，P<0.01). The specificities of SAT-TB, smear and cultures were 100.00% (49/49), 100.00% (49/49) and 95.92% (47/49), respectively, no statistical significance can be drawn (χ2=4.055,P>0.01). In 273 cases of pulmonary TB with culture positive, 230 cases were SAT-TB positive, the sensitivity of SAT-TB was 84.25% (230/273), whereas only 88 cases were smear positive, the sensitivity of smear was 32.23% (88/273), significantly lower than that of SAT-TB (χ2=151.847,P<0.01). The positive and negative predictive values for SAT-TB were 100.00% (232/232) and 53.26% (49/92), respectively. Conclusion The sensitivity of SAT-TB was significantly higher than that of smear, the specificity of SAT-TB was closely equal to that of culture. SAT-TB has clinical value for the diagnosis of active pulmonary TB with smear negative.

Tuberculosis, pulmonary/diagnosis； Nucleic acid amplification techniques； Sensitivity and specificity

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.09.010

200433 同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院結(jié)核病臨床研究中心 上海市結(jié)核病(肺)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院

張青，Email：zhqi709851@sohu.com

2016-05-31)