葛燕萍 張青

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痰標本RNA恒溫擴增技術對活動性肺結核的臨床診斷價值

葛燕萍 張青

目的 評價結核分枝桿菌RNA恒溫擴增實時檢測法(SAT-TB)對活動性肺結核的臨床診斷價值。 方法 收集2014年1月至2014年12月上海市肺科醫(yī)院收治的活動性肺結核患者321例[結核組，包括確診肺結核(275例)及臨床診斷肺結核(46例)]及肺部其他疾病患者49例(對照組)的痰標本，分別采用SAT-TB法、涂片鏡檢法及結核分枝桿菌快速培養(yǎng)法(采用“BACTECTMMGITTM960全自動分枝桿菌檢測系統(tǒng)”,簡稱“BACTEC 960”)進行檢測，根據檢測結果分別計算敏感度、特異度、陽性預測值和陰性預測值。應用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，樣本“率”的比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結果 321例結核組患者及49例對照組患者的痰標本，分別用SAT-TB法、涂片鏡檢法及BACTEC 960培養(yǎng)法檢測，敏感度分別為74.77%(240/321)、28.04%(90/321)、85.05%(273/321)。SAT-TB法敏感度顯著高于涂片鏡檢法，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=140.297，P<0.01)；SAT-TB法敏感度低于BACTEC 960培養(yǎng)法，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=10.565，P<0.01)。涂片鏡檢法與SAT-TB法的特異度均為100.00%(49/49)，而BACTEC 960培養(yǎng)法的特異度為95.92%(47/49)；3種檢測方法特異度比較，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=4.055，P>0.05)。273例BACTEC 960培養(yǎng)法檢測陽性的肺結核患者中，SAT-TB法檢測陽性230例，敏感度為84.25%(230/273)；涂片鏡檢法陽性88例，敏感度為32.23%(88/273)，兩者敏感度比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=151.847，P<0.01)。SAT-TB法檢測275例確診肺結核患者的敏感度為84.36%(232/275)，陽性預測值為100.00%(232/232)，陰性預測值為53.26%(49/92)。結論 SAT-TB法敏感度高于涂片鏡檢法，特異度與BACTEC 960培養(yǎng)法相近，對于涂陰活動性肺結核有一定臨床診斷價值。

結核，肺/診斷； 核酸擴增技術； 敏感度與特異度

世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計結果表明，目前全球約有20億例結核分枝桿菌感染者，并且以每年800～1000萬例的速度遞增，約200萬例患者死于結核病[1-2]。2010年全國第五次結核病流行病學抽樣調查(簡稱“流調”)報告顯示結核病疫情較2000年流調結果有所下降，但活動性肺結核患病率下降較慢，因此，我國的結核病負擔仍很嚴重[3]。預防和控制結核病傳播的重要手段是早期、快速診斷。目前，臨床確診肺結核的傳統(tǒng)方法仍是痰涂片鏡檢法及分枝桿菌培養(yǎng)法，但涂片法陽性率低，而培養(yǎng)法耗時長。因此，臨床上亟需一種新的診斷技術。結核分枝桿菌RNA恒溫擴增實時檢測法(simultaneous amplification and testing forMycobacteriumtuberculosis，SAT-TB)是基于RNA恒溫擴增技術發(fā)展起來的一項最新的核酸檢測技術。它是以結核分枝桿菌特異的16S rRNA作為檢測靶標，通過恒溫RNA擴增技術擴增靶標片段，熒光標記的探針與靶標片段的擴增產物雜交后釋放出熒光信號，對熒光信號進行實時檢測，從而快速準確地判斷待檢樣本中是否有結核分枝桿菌的存在。

筆者通過回顧性研究，對上海市肺科醫(yī)院2014年1月至2014年12月收治的活動性肺結核及其他肺部疾病患者的痰液標本分別進行SAT-TB、涂片鏡檢及結核分枝桿菌快速培養(yǎng)(采用“BACTECTMMGITTM960全自動分枝桿菌檢測系統(tǒng)”,簡稱“BACTEC 960”)，比較3種檢測方法的差異，以評價SAT-TB法對活動性肺結核的臨床診斷價值。

材料與方法

一、研究對象

1.結核組：收集2014年1月至2014年12月上海市肺科醫(yī)院收治的活動性肺結核患者321例，其中男211例，女110例，年齡18～70歲，平均(47.5±11.6)歲?；顒有苑谓Y核的診斷依據《肺結核診斷和治療指南》[4]進行。根據細菌學及病理學檢測結果，本研究將活動性肺結核分為確診肺結核(275例)及臨床診斷肺結核(46例)。(1)確診肺結核：指有肺結核臨床癥狀和胸部影像學表現，且痰涂片或分枝桿菌培養(yǎng)陽性，菌型鑒定為結核分枝桿菌；或支氣管或肺部組織病理證實結核病變。(2)臨床診斷肺結核：是指不具備細菌學及病理學診斷依據，但臨床癥狀及胸部影像學表現符合活動性肺結核表現，且能排除其他肺部疾病，并經診斷性抗結核治療有效?；顒有苑谓Y核依據痰細菌學結果分為涂片陽性培養(yǎng)陽性(簡稱“涂陽培陽”)、涂片陽性培養(yǎng)陰性(簡稱“涂陽培陰”)、涂片陰性培養(yǎng)陽性(簡稱“涂陰培陽”及涂片陰性培養(yǎng)陰性(簡稱“涂陰培陰”)肺結核。涂陽培陽、涂陽培陰、涂陰培陽屬于確診肺結核；涂陰培陰屬于臨床診斷肺結核。

2.對照組：收集2014年1月至2014年12月上海市肺科醫(yī)院收治的肺部其他疾病患者49例，其中男28例，女21例，年齡28～68歲，平均(43.3±10.1)歲。肺部其他疾病包括慢性支氣管炎27例(55.10%)，肺炎8例(16.33%)，肺癌5例(10.20%)，支氣管擴張4例(8.16%)，非結核分枝桿菌肺病2例(4.08%)，結節(jié)病2例(4.08%)，塵肺1例(2.04%)。上述患者診斷均依據相關診斷標準[5]。所有患者均無HIV感染及嚴重的全身疾病。兩組患者均知情同意并簽署知情同意書。

二、研究方法

留取患者晨起漱口后的痰液標本，根據我國《結核病診斷細菌學檢驗規(guī)程》[6]進行預處理，并將標本分為3份，分別進行SAT-TB法、涂片鏡檢法及BACTEC 960培養(yǎng)法檢測。

1.SAT-TB法：檢測試劑盒采用上海仁度生物科技有限公司生產的SAT-TB試劑盒，根據說明書進行操作。將預處理的標本按1∶100的比例用TB稀釋液(一種裂解緩沖液，采用焦碳酸二乙酯處理過的無菌水配制10 mmol/L檸檬酸鈉)進行稀釋，放入超聲波清洗器中進行超聲處理15 min，超聲功率300 W；超聲處理結束后，取出2 μl處理物，在其中加入30 μl擴增檢測液(一種混合液，含40 mmol/L的Tris-HCl緩沖液，pH=8.1)，開啟恒溫熒光檢測儀器(上海精宏實驗設備有限公司)，按儀器操作手冊設定反應程序，熒光素通道設定為FAM(6-羧基熒光素)42 ℃ 1 min，共檢測40次；反應結束后置于恒溫混勻儀(上海精宏實驗設備有限公司)上42 ℃ 保溫5 min，同時將SAT酶液(含M-MLV逆轉錄酶和T7 RNA轉錄酶各2000 U)也預熱到42 ℃ 加入反應管，快速轉至恒溫熒光檢測儀上進行檢測。

2.涂片鏡檢法：采用萋-尼抗酸染色鏡檢，操作按《結核病診斷細菌學檢驗規(guī)程》[6]進行。

3. BACTEC 960培養(yǎng)法：試劑盒及儀器來源于碧迪醫(yī)療器械(上海)有限公司。對于培養(yǎng)陽性標本進一步行菌種鑒定，以明確是哪種分枝桿菌。

4.各指標計算方法：敏感度=真陽性例數/(真陽性例數+假陰性例數)×100%；特異度=真陰性例數/(真陰性例數+假陽性例數)×100%；陽性預測值=真陽性例數/(真陽性例數+假陽性例數) ×100%；陰性預測值=真陰性例數/(真陰性例數+假陰性例數) ×100%。

三、統(tǒng)計學分析

應用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，樣本“率”的比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、兩組患者3種檢測方法的檢出結果

結核組321例患者痰涂片鏡檢陽性90例(28.04%)，BACTEC 960培養(yǎng)法檢測結核分枝桿菌陽性273例(85.05%)，SAT-TB法檢測陽性240例(74.77%)。3種方法敏感度比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=253.207，P<0.01)。進一步對3種方法進行兩兩比較，SAT-TB法的敏感度高于涂片鏡檢法，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=140.297，P<0.01)；SAT-TB法的敏感度低于BACTEC 960培養(yǎng)法，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=10.565，P<0.01)。對照組49例患者痰標本涂片鏡檢法及SAT-TB法的檢出結果均為陰性，特異度均為100.00%(49/49)，而BACTEC 960培養(yǎng)檢出2例陽性，但最終菌型鑒定結果為非結核分枝桿菌，特異度為95.92%(47/49)。3種方法特異度比較，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=4.055，P>0.05)(表1)。

二、SAT-TB法與涂片鏡檢法在BACTEC 960培養(yǎng)法陽性患者中的檢測結果

在273例BACTEC 960培養(yǎng)法陽性的結核組患者中，SAT-TB法的敏感度為84.25%(230/273)，涂片鏡檢法的敏感度為32.23%(88/273)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=151.847，P<0.01)(表2)。

三、SAT-TB法檢測結果與不同細菌學檢測結果的比較

SAT-TB法檢測275例確診肺結核患者的敏感度為84.36%(232/275)，陽性預測值為100.00%(232/232)，陰性預測值為53.26%(49/92)，具體見表3；90例痰涂片鏡檢陽性的患者，其SAT-TB法檢測結果均為陽性，診斷敏感度達100.00%(90/90)。

討 論

表1 3種檢測方法對兩組患者檢測的敏感度及特異度比較

注 敏感度=真陽性例數/(真陽性例數+假陰性例數)×100%；特異度=真陰性例數/(真陰性例數+假陽性例數)×100%

表2 SAT-TB法與涂片法在BACTEC 960陽性結核組患者中檢測敏感度的比較

注 敏感度=真陽性例數/(真陽性例數+假陰性例數)×100%

表3 不同細菌學檢測結果與SAT-TB法檢測結果的比較

注 敏感度=真陽性例數/(真陽性例數+假陰性例數)×100%；特異度=真陰性例數/(真陰性例數+假陽性例數)×100%；陽性預測值=真陽性例數/(真陽性例數+假陽性例數) ×100%；陰性預測值=真陰性例數/(真陰性例數+假陰性例數) ×100%

活動性肺結核診治流程中的關鍵環(huán)節(jié)是如何早期、及時、準確地診斷，而目前要做到這點主要依賴于實驗室診斷技術。肺結核的實驗室診斷主要包括痰涂片鏡檢法、培養(yǎng)法、分子生物學方法及免疫學方法等。近年來，分子生物學技術在活動性肺結核的診斷中發(fā)揮了越來越重要的價值。1996年美國疾病預防控制中心推薦核酸擴增試驗(nucleic acid amplication，NAA)用于涂陰肺結核的診斷，并于2000年對流程進行了更新[7-8]。常用的NAA技術包括常規(guī)聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)、實時熒光定量PCR、核酸恒溫擴增檢測技術等。其中恒溫擴增技術包括SAT-TB和環(huán)介導等溫擴增法(loop mediated isothermal amplification，LAMP)等。

本研究結果顯示，對于321例活動性肺結核患者，SAT-TB法檢測敏感度為74.77%(240/321)，明顯高于傳統(tǒng)的涂片鏡檢法(28.04%，90/321)，但低于BACTEC 960培養(yǎng)法(85.05%，273/321)。

結核分枝桿菌培養(yǎng)及菌型鑒定法長期以來被譽為結核分枝桿菌診斷的“金標準”[9]。對273例BACTEC 960培養(yǎng)法陽性且菌型鑒定為結核分枝桿菌的結核組患者及49例對照組患者的痰標本進行檢測，結果顯示SAT-TB法的敏感度為84.25%(230/273)，特異度為100.00%(49/49)。從檢測時間上，SAT-TB法僅需1.5 h就能得到結果，速度明顯快于BACTEC 960培養(yǎng)法，而檢測結果與培養(yǎng)法一致率達84.25%(230/273)，也就是說SAT-TB法能夠在最短的時間內提供準確率為84.25%的檢測結果。應用SAT-TB檢測技術，可以在較短的時間內得到相對敏感度較高的檢測結果。49例對照組患者中有2例為NTM肺病，其BACTEC 960培養(yǎng)結果均陽性，而SAT-TB法檢測結果均為陰性，可見SAT-TB法可區(qū)分是否為結核分枝桿菌感染。因此，在一定條件下，SAT-TB法能夠替代BACTEC 960培養(yǎng)法，有望成為實驗室診斷的新方法，是一項很有市場前景的新技術[10]。

根據痰細菌學結果將活動性肺結核患者分為確診及臨床診斷兩組。結果發(fā)現，在275例確診肺結核組中，90例痰涂片鏡檢法陽性，其SAT-TB法檢測結果均陽性，診斷敏感度達100.00%(90/90)，這一結果與崔振玲等[11]報道的結果相仿。由此說明對于活動性肺結核患者，SAT-TB法檢測結果陽性可以確認結核病診斷，但SAT-TB法檢測結果陰性卻并不能完全排除結核病的診斷。

我國多次結核病流調結果均顯示，涂陰肺結核占活動性肺結核患者的比例較高，從1979年的73.9%上升到2010年的85.6%，涂陰肺結核成為我國肺結核患病率下降緩慢的主要原因[12]。由于涂陰肺結核患者缺乏痰涂片抗酸桿菌陽性結果，故對其進行痰培養(yǎng)或分子生物學檢查，獲得病原學檢查陽性依據，能大大提高涂陰肺結核診斷的準確性，減少誤診。本研究結果顯示，在321例活動性肺結核患者中，涂陰患者有231例(其中185例為BACTEC 960培養(yǎng)法陽性，46例為BACTEC 960培養(yǎng)法陰性)，SAT-TB法檢出陽性150例，陽性率為64.94%(150/231)。因此，對于痰涂片陰性的活動性肺結核患者而言，SAT-TB法不失為一種新的輔助診斷手段，具有一定臨床價值。SAT-TB法對于細菌學陰性的活動性肺結核患者(即涂陰培陰的46例患者)陽性率僅為17.39%(8/46)，但對于痰涂片陰性的活動性肺結核患者(包括涂陰培陰的46例患者及涂陰培陽的185例患者，共231例)，陽性率達64.94%(150/231)，因此SAT-TB法對于痰涂片陰性的活動性肺結核患者，檢測陽性率并不算低。范琳等[13]利用RNA恒溫擴增實時熒光檢測技術檢測支氣管肺泡灌洗液來診斷涂陰肺結核，該方法的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別為81.0%、96.9%、95.9%、84.9%，這一結果也證實了上述觀點。

綜上所述，SAT-TB法敏感度高于涂片鏡檢法，特異度接近BACTEC 960培養(yǎng)法，但耗時更短，且對于涂陰活動性肺結核有一定臨床診斷價值，值得在有實驗室相關能力的醫(yī)院推廣。

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[13] 范琳，王鵬，楊妍，等. RNA恒溫擴增實時熒光檢測技術檢測支氣管肺泡灌洗液對涂陰肺結核的快速診斷價值.中國防癆雜志，2015，37(2)：140-144.

(本文編輯：郭萌)

Clinical value of simultaneous amplification and testing method of sputum specimen for the diagnosis of active pulmonary tuberculosis

GEYan-ping,ZHANGQing.

ShanghaiKeyLaboratoryofTuberculosis,TuberculosisDiagnosisCenter,ShanghaiPulmonaryHospitalaffiliatedtoTongjiUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200433,China

ZHANGQing,Email:zhqi709851@sohu.com

Objective To evaluate the clinical value of the simultaneous amplification and testing method for the detection ofMycobacteriumtuberculosis(SAT-TB) for the diagnosis of active pulmonary tuberculosis (TB). Methods Sputum specimens from 321 active pulmonary TB (including confirmed tuberculosis (275 cases) and clini-cal diagnosis tuberculosis (46 cases)) and 49 patients with other lung diseases admitted in Shanghai Pulmonary Hospital were tested with SAT-TB, smears and BACTEC 960 cultures. Sensitivity, specificity, positive and negative predictive values were calculated according to test results. Using SPSS 19.0, data were compared withχ2test,P<0.05 was considered statistically significant. Results The sensitivities of SAT-TB, smears and cultures were 74.77% (240/321)，28.04% (90/321) and 85.05% (273/321), respectively. The sensitivity of SAT-TB was significantly higher than that of smear (χ2=140.297,P<0.01), but significantly lower than that of cultures (χ2=10.565，P<0.01). The specificities of SAT-TB, smear and cultures were 100.00% (49/49), 100.00% (49/49) and 95.92% (47/49), respectively, no statistical significance can be drawn (χ2=4.055,P>0.01). In 273 cases of pulmonary TB with culture positive, 230 cases were SAT-TB positive, the sensitivity of SAT-TB was 84.25% (230/273), whereas only 88 cases were smear positive, the sensitivity of smear was 32.23% (88/273), significantly lower than that of SAT-TB (χ2=151.847,P<0.01). The positive and negative predictive values for SAT-TB were 100.00% (232/232) and 53.26% (49/92), respectively. Conclusion The sensitivity of SAT-TB was significantly higher than that of smear, the specificity of SAT-TB was closely equal to that of culture. SAT-TB has clinical value for the diagnosis of active pulmonary TB with smear negative.

Tuberculosis, pulmonary/diagnosis； Nucleic acid amplification techniques； Sensitivity and specificity

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.09.010

200433 同濟大學附屬上海市肺科醫(yī)院結核病臨床研究中心 上海市結核病(肺)重點實驗室 同濟大學醫(yī)學院

張青，Email：zhqi709851@sohu.com

2016-05-31)